張海寧，尹園，柳玉梅，張維文

（廣州醫(yī)科大學(xué) 藥理教研室，廣東 廣州 511436）

托珠單抗對(duì)心衰大鼠輔助性T細(xì)胞17介導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)的影響*

張海寧，尹園，柳玉梅，張維文

（廣州醫(yī)科大學(xué) 藥理教研室，廣東 廣州 511436）

目的探討托珠單抗對(duì)心衰大鼠輔助性T細(xì)胞17（Th17）介導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)的影響及對(duì)心功能的保護(hù)作用。方法利用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法制備心衰模型，于術(shù)后第2天腹腔注射5 mg/kg托珠單抗，4周注射1次，連續(xù)注射3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，左心室插管檢測(cè)大鼠左心室血流動(dòng)力學(xué)變化；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定心肌或脾臟組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-17（IL-17）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）及白介素-23（IL-23）水平；流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟Th17細(xì)胞比例；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)脾臟維A酸相關(guān)孤兒受體γ t（RORγ t）及維A酸相關(guān)孤兒受體α（RORα）mRNA的表達(dá)水平；Western blot檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）p65核蛋白表達(dá)水平。結(jié)果托珠單抗治療降低心衰大鼠死亡率及心臟體重比（HW/BW）比值，改善心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括降低平均血壓（MBP）及左心室舒張末期壓（LVEDP），升高左心室舒張壓最大上升和下降速率（±dp/dt）及左心室收縮壓（LVSP）。模型組大鼠脾組織IL-23、IL-17蛋白表達(dá)水平、Th17細(xì)胞頻率、Th17細(xì)胞活化的特征性轉(zhuǎn)錄因子RORγ t及RORαmRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，并且心肌IL-1β、IL-6、TNF-α含量及NF-κB p65表達(dá)水平亦顯著高于對(duì)照組。與模型組比較，托珠單抗治療使上述指標(biāo)明顯降低。結(jié)論托珠單抗可能通過(guò)抑制Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

心衰；炎癥；托珠單抗；NF-κB

慢性炎癥反應(yīng)是心衰發(fā)展過(guò)程中的主要病理特征，在心衰的發(fā)病機(jī)制中可能起關(guān)鍵作用[1-2]。新近研究表明，以分泌白介素 -17（Interleukin-17，IL-17）為主要特征的輔助性T細(xì)胞17（T helper cells 17，Th17）過(guò)度活化在促進(jìn)炎癥反應(yīng)并介導(dǎo)炎癥損傷中發(fā)揮重要作用。研究顯示，IL-17在患者血清和靶組織中高表達(dá)，與慢性感染、自身免疫疾病、移植排斥反應(yīng)及腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。近年來(lái)對(duì)心衰的研究顯示，慢性心力衰竭患者存在Th17細(xì)胞功能亢進(jìn)及IL-17高表達(dá)[5-7]，提示Th17細(xì)胞可能介導(dǎo)心衰發(fā)展過(guò)程中的慢性炎癥反應(yīng)。

托珠單抗（Tocilizumab）是近年美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的首個(gè)治療中至重度活動(dòng)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的人源化白介素 -6（Interleukin-6，IL-6）受體的單克隆抗體類藥物。其臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，托珠單抗參與下調(diào)IL-17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對(duì)緩解RA患者的全身炎癥狀態(tài)表現(xiàn)出良好的療效[8-12]。目前，托珠單抗是否可以改善心衰患者的體內(nèi)炎癥狀態(tài)，延緩心衰的發(fā)展未見(jiàn)報(bào)道。本文利用冠狀動(dòng)脈左前降支（left anterior descending,LAD）結(jié)扎法建立慢性心衰大鼠模型，觀察長(zhǎng)期接受托珠單抗治療對(duì)大鼠心衰發(fā)展過(guò)程中炎癥反應(yīng)及心功能的改善作用，并初步探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

無(wú)特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重 250g 左右，雄性，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，批號(hào)：SCXK（粵）2014-0005，200 mg/10 ml托珠單抗購(gòu)自美國(guó)羅氏制藥公司，Trizol試劑、First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自日本TaKaRa公司，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的抗鼠CD4單克隆抗體、藻膽素（Phycoerythrin，PE）標(biāo)記的IL-17單克隆抗體、同型對(duì)照大鼠IgG1κ抗體、破膜劑由美國(guó)BD Bioscience公司提供。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。腫瘤壞死因子 -α（tumor necrosis factor-a，TNF-α）試劑盒購(gòu)自美國(guó) R&D公司。IL-17、IL-6、IL-23、IL-1β試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioScience公司。Lamin B1、P65抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 LAD冠狀動(dòng)脈結(jié)扎制備慢性心衰動(dòng)物模型及藥物干預(yù) SD大鼠戊巴比妥鈉麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，經(jīng)左前胸廓旁第4、5肋間開(kāi)胸，暴露心臟，在冠脈下穿6號(hào)絲線結(jié)扎LAD近端，關(guān)胸并擠出胸腔空氣，心電圖檢查出現(xiàn)ST段明顯弓背狀抬高或壓低，即初步認(rèn)為心梗模型已建立。實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)立假手術(shù)組作為對(duì)照組，假手術(shù)組大鼠行開(kāi)胸，但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。給藥組于術(shù)后第2天腹腔注射5 mg/kg托珠單抗，4周注射1次，連續(xù)注射3次。給藥期間，觀察大鼠的一般情況，記錄各組大鼠死亡數(shù)。于最后一次給藥的第2天，處死大鼠，摘取心臟，稱心臟重量（heart weight，HW），計(jì)算心臟體重比（HW/BW），并提取心肌組織蛋白。摘取脾臟，部分用于提取蛋白及總RNA，其余用于分離脾細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.2.2 大鼠左心室血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定 大鼠戊巴比妥麻醉后，仰臥固定，經(jīng)右頸總動(dòng)脈切口插入注滿0.1%肝素并連接壓力換能器的PE50導(dǎo)管，導(dǎo)管與PowerLab相連，邊插入邊觀察屏幕上的波形，當(dāng)波幅明顯增大且導(dǎo)管劇烈抖動(dòng)時(shí)，表明導(dǎo)管已進(jìn)入左心室。左心室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)由PowerLab 8通道電生理記錄儀自動(dòng)采集，分析獲得。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法測(cè)定細(xì)胞因子濃度 冰浴下制備心肌及脾臟組織勻漿，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17 及 IL-23 水平，結(jié)果以pg/mg表示。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17細(xì)胞頻率 藥物干預(yù)結(jié)束的第2天殺死大鼠，取出脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，置于紅細(xì)胞裂解液（0.83%NH4Cl；0.01 mmol Tris-HCl，pH=7.2），清洗重懸細(xì)胞，進(jìn)行 APC-anti-CD3，F(xiàn)ITC-anti-CD4免疫染色；破膜，進(jìn)行PE-anti-IL-17（1∶50）細(xì)胞內(nèi)染色，同型對(duì)照管加PE-anti-IgG1κ作為同型陰性對(duì)照，用流式細(xì)胞儀（FACSDIVA；Becton Dickinson Biosciences，San Jose，CA）檢測(cè) CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞頻率。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real timequantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）利用Trizol試劑提取大鼠脾臟總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 3 min，94℃變性 45 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析表明，PCR反應(yīng)產(chǎn)物為單獨(dú)的雙鏈DNA。用ΔΔCt值法，以β-actin表達(dá)為內(nèi)參定量維A酸相關(guān)孤兒受體γt（retinoid-related or-phan nuclear receptorγt，RORγt）及維A酸相關(guān)孤兒受體α（retinoid-related or-phan nuclear receptor α，ROR α）mRNA 的表達(dá)水平。

1.2.6 蛋白電泳 用放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液提取心肌組織總蛋白，經(jīng)BCA蛋白定量后，取等量蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，室溫下用含5%脫脂奶粉的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST） 封閉 PVDF 膜1 h，加入一抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜，加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白水平，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SSPS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，多組比較用方差分析（one-way，ANVOA），方差齊時(shí)，兩兩比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 托珠單抗對(duì)心衰大鼠一般情況、死亡率及HW/BW的影響

直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)正常。與對(duì)照組比較，模型組大鼠從8周開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)少動(dòng)、松毛、進(jìn)食減少、端坐呼吸及四肢皮下水腫等癥狀，托珠單抗組大鼠上述癥狀明顯減輕。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組大鼠無(wú)死亡。托珠單抗組死亡率、HW/BW較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021和0.038）。見(jiàn)表1。

2.2 托珠單抗對(duì)心衰大鼠心功能的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠心率改變不明顯（P=0.987），而 MBP、LVEDP 升高（P=0.007和 0.002），±dp/dt、LVSP降低（P=0.023、0.037 和 0.025）。托珠單抗組與模型組比較，MBP、LVEDP降低（P=0.038和 0.006），LVSP、±dp/dt升高（P=0.041、0.033 和0.043）。見(jiàn)表 2。

2.3 托珠單抗對(duì)心衰大鼠脾臟IL-17、IL-6、IL-23水平及Th17細(xì)胞比率的影響

表2 各組左室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 （±s）

表2 各組左室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.01；2）與對(duì)照組比較，P＜0.05；3）與模型組比較，P＜0.05；4）與模型組比較，P＜0.01

組別心率/（次/min）MBP/（mmHg）LVSP/（mmHg）LVEDP/（mmHg）+dp/dt/（mmHg/s）-dp/dt/（mmHg/s）對(duì)照組 372.0±25.1 118.2±5.7 132.1±6.2 2.8±5.4 5908.0±854.6 -5362.1±998.7模型組 392.0±32.3 154.7±7.21） 78.4±3.82） 17.7±3.91） 3769.4±823.52） -3173.7±856.92）托珠單抗組 381.0±28.4 128.5±4.73） 126.6±3.93） 5.9±4.54） 4802.6±711.23） -4687.5±423.13）

為觀察心衰過(guò)程中是否存在Th17細(xì)胞的免疫激活，本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)體內(nèi)最主要的免疫器官脾臟中Th17細(xì)胞激活相關(guān)細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。模型組大鼠脾臟IL-17、IL-6、IL-23水平及Th17細(xì)胞頻率較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005、0.006、0.017 和 0.035）（見(jiàn)圖 1 和表 3），脾臟RORγ t和RORα mRNA表達(dá)水平也明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032和0.003）（見(jiàn)圖2），提示心衰發(fā)展過(guò)程中存在Th17細(xì)胞活化。托珠單抗組與模型組比較，可顯著降低IL-17、IL-6、IL-23蛋白水平，減少脾臟Th17細(xì)胞頻率及下調(diào)ROR γ t和 RORα mRNA 表達(dá) （P=0.017、0.013、0.021、0.042、0.038 和 0.022）（見(jiàn)圖 2 和表 3）。

圖1 各組脾臟Th17細(xì)胞比例

2.4 托珠單抗對(duì)心衰大鼠心肌炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響

表3 各組脾臟IL-23、IL-6、IL-17水平及Th17細(xì)胞頻率比較 （±s）

表3 各組脾臟IL-23、IL-6、IL-17水平及Th17細(xì)胞頻率比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與對(duì)照組比較，P＜0.01；3）與模型組比較，P＜0.05

組別例數(shù)IL-23/（pg/mg）IL-17/（pg/mg）IL-6/（pg/mg）Th17細(xì)胞頻率/%對(duì)照組 12 27.33±0.39 32.89±8.31 40.01±9.35 0.90±0.18模型組 7 63.52±1.081) 87.90±11.342） 337.23±24.542） 3.89±0.211)托珠單抗組 10 47.65±2.353） 61.22±8.233） 135.78±25.113） 1.96±0.253）

圖2 各組脾臟ROR γ t和RORα mRNA表達(dá)

表4 各組心肌IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α含量比較 （±s）

表4 各組心肌IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α含量比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.01；2）與對(duì)照組比較，P＜0.05；3）與模型組比較，P＜0.01；4）與模型組比較，P＜0.05

組別例數(shù)IL-6/（pg/mg）IL-1β/（pg/mg）IL-17/（pg/mg）TNF-α/（pg/mg）對(duì)照組 12 37.33±1.37 21.14±3.54 22.45±2.98 18.23±1.56模型組 7 263.52±35.661） 167.54±10.391） 52.07±9.872） 67.32±10.411）托珠單抗組 10 107.44±11.353） 98.64±10.454） 29.43±4.634） 38.23±8.574）

ELISA檢測(cè)心肌組織炎癥因子水平。模型組大鼠心肌組織 IL-17、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯高于對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023、0.004、0.002和0.002）。而給予托珠單抗治療后心肌組織IL-17、TNF-α、IL-1β、IL-6 水平較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031、0.019、0.022 和0.007）。見(jiàn)表4。

2.5 托珠單抗抑制心衰過(guò)程中核轉(zhuǎn)錄因子-κB的活化

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）p65核蛋白表達(dá)水平明顯增加（P=0.028）。而給予托珠單抗治療后，心肌組織NF-κB p65核蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P=0.033）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組心肌細(xì)胞NF-κB p65核蛋白表達(dá)

3 討論

1990年LEVINE等[13]發(fā)現(xiàn)慢性心衰患者循環(huán)中TNF-α水平明顯升高。隨后人們注意到包括TNF-α、IL-6、IL-1β等在內(nèi)的大量前炎癥細(xì)胞因子在外周血及心肌局部大量活化介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)是心衰發(fā)病進(jìn)程中的主要病理學(xué)特征，并在心衰的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[1-2]，因此提出抗炎和免疫調(diào)節(jié)治療有望成為延緩心衰的新策略。托珠單抗是首個(gè)被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的IL-6受體的單克隆抗體。目前，其主要用于中至重度活動(dòng)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物治療，通過(guò)緩解RA患者全身炎癥狀態(tài)，可改善患者疲乏、疼痛及晨僵癥狀，延緩關(guān)節(jié)損傷，進(jìn)而改善軀體功能。本實(shí)驗(yàn)觀察托珠單抗對(duì)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的心衰的治療作用，結(jié)果顯示，托珠單抗組大鼠死亡率、HW/BW較模型組明顯降低，左室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)如LVEDP，±dp/dt等有顯著改善，表明托珠單抗對(duì)心衰大鼠產(chǎn)生良好的保護(hù)作用。

免疫系統(tǒng)激活是多種前炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的主要機(jī)制。既往研究認(rèn)為，過(guò)度活化Th1細(xì)胞通過(guò)分泌 TNF-α、干擾素 γ（interferonγ，IFNγ）、IL-2等致炎因子與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)有關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞在防御胞外細(xì)菌感染、介導(dǎo)慢性炎癥以及自身免疫疾病中發(fā)揮更加重要的作用[3-4]。Th17細(xì)胞主要產(chǎn)生 IL-17A、IL-17F、IL-21和 IL-22，其中IL-17是主要的炎癥介導(dǎo)因子，通過(guò)與其受體IL-17R結(jié)合，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，參與多種疾病的病理過(guò)程。新近LI等[6]報(bào)道，心衰患者循環(huán)血中IL-17表達(dá)量及Th17細(xì)胞頻率明顯增加，并與心肌損害程度密切相關(guān)，提示Th17細(xì)胞參與心衰的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，心衰組大鼠體內(nèi)最主要的免疫器官脾臟中IL-17表達(dá)水平以及Th17細(xì)胞頻率顯著增高，Th17細(xì)胞活化的特征性轉(zhuǎn)錄因子RORγ t和RORα mRNA表達(dá)水平也明顯上調(diào)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，維持Th17細(xì)胞擴(kuò)增及功能的最主要的正調(diào)控因子IL-23在脾臟的分泌亦明顯增加，表明心衰發(fā)展中存在Th17細(xì)胞的免疫激活，也進(jìn)一步證實(shí)心衰的發(fā)生、發(fā)展與Th17細(xì)胞過(guò)度活化密切相關(guān)。

IL-6是活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的前炎癥細(xì)胞因子，參與廣泛的生物學(xué)功能，包括急性期炎癥反應(yīng)、干擾鐵的重吸收和再利用、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)等[14]。新近研究表明，通過(guò)作用于其受體，IL-6還參與調(diào)控Th17細(xì)胞的活化過(guò)程。有研究顯示，IL-6在介導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)Th17細(xì)胞活化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，而給予抗IL-6受體的抗體明顯抑制由6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶及膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物體內(nèi)Th17細(xì)胞及IL-17的產(chǎn)生[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，心衰組大鼠脾臟中IL-6水平顯著升高，Th17細(xì)胞明顯活化，給予IL-6受體的抗體托珠單抗干預(yù)處理后，Th17細(xì)胞活化相關(guān)指標(biāo)較模型組明顯降低。以上結(jié)果提示，抑制Th17細(xì)胞活化亦可能是托珠單抗抑制心衰發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。

研究顯示，Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與活化前炎癥轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)釋放密切相關(guān)。NF-κB是普遍存在于細(xì)胞漿中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，在介導(dǎo)細(xì)胞增殖與分化、腫瘤、炎癥和免疫反應(yīng)等多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。NF-κB由p50和RelA（p65）組成，非活性狀態(tài)時(shí)與抑制性蛋白IκB結(jié)合存在于胞漿中，而當(dāng)NF-κB激活時(shí)，IκB被降解，使NF-κB p65亞單位釋放，轉(zhuǎn)入核內(nèi)與靶基因的κB基序結(jié)合，從而啟動(dòng)靶基因的表達(dá)。眾多研究表明，NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等多種炎性蛋白的表達(dá)是引起哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、腸炎等許多慢性炎癥性疾病的關(guān)鍵因素[15-16]。本研究結(jié)果顯示，心衰模型組大鼠心肌組織IL-17表達(dá)水平明顯升高，核NF-κB明顯活化，同時(shí)心肌組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平亦明顯高于對(duì)照組，而經(jīng)托珠單抗干預(yù)治療后，胞核NF-κB p65表達(dá)水平及心肌勻漿液中IL-17、IL-1β、IL-6、TNF-α含量較模型組降低，提示托珠單抗可能通過(guò)拮抗IL-17的產(chǎn)生阻礙NF-κB活化及NF-κB活化介導(dǎo)的IL-1β、IL-6、TNF-α釋放，從而抑制由Th17細(xì)胞過(guò)度活化導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)及炎癥損傷，最終延緩心衰的發(fā)展，然而其具體機(jī)制尚需在后續(xù)的研究中深入探討。

綜上所述，本研究表明，托珠單抗作為一個(gè)新型的抗炎藥物，長(zhǎng)期應(yīng)用可緩解心衰大鼠心肌炎癥反應(yīng)，改善心功能并延緩心衰的發(fā)展，其機(jī)制可能與抑制Th17細(xì)胞過(guò)度活化介導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的下調(diào)有關(guān)。本研究結(jié)果將為托珠單抗在心血管相關(guān)疾病及心衰中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]BOLTON AE.Biologic effects and basic science of a novel immune-modulation therapy[J].Am J Cardiol,2005,95(11):24-29.

[2]GENTH-ZOTZ S,VON HAEHLING S,BLANKENBERG S.Immunactivation in chronic heart failure.Inflammatory mediators[J].Z Kardiol,2004,93(4):24-30.

[3]KORN T,OUKKA M,KUCHROO V,et al.Th17 cells:effector T cells with inflammatory properties[J].Semin Immunol,2007,19(6):362-371.

[4]MARTINEZ GJ,NURIEVA RI,YANG XO,et al.Regulation and function of proinflammatory TH17 cells[J].Ann New York Acad Sci,2008,1143(1):188-211.

[5]彭芝斌,鄧世磊,楊澤敏,等.慢性心力衰竭患者Th17/Treg失衡的研究及其意義[J].中華中醫(yī)學(xué)雜志,2009,33(6):316-318.

[6]LI J,WANG L,WANG S,et al.The Treg/Th17 imbalance in patient with idiopathic dilated cardiomyopathy[J].Scand J Immunol,2010,71(4):298-303.

[7]TANG TT,DING YJ,LIAO YH,et al.Defective circulating CD4+CD25+Foxp3+CD127 (low)regulatory T-cells in patients with chronic heart failure[J].Cell Physiol Biochem,2010,25(4/5):451-458.

[8]NISHIMOTO N,MIYASAKA N,YAMAMOTO K,et al.Study of active controlled tocilizumab monotherapy for rheumatoid arthritis patients with an inadequate response to methotrexate(SATORI):significant reduction in disease activity and serum vascular endothelial growth factor by IL-6 receptor inhibition therapy[J].Mod Rheumatol,2009,19(1):12-19.

[9]NISHIMOTO N,HASHIMOTO J,MIYASAKA N,et al.Study of active controlled monotherapy used for rheumatoid arthritis,an IL-6 inhibitor(SAMURAI):evidence of clinical and radiographic benefit from an X ray reader-blinded randomised,controlled trial of tocilizumab[J].Ann Rheum Dis,2007,66(9):1162-1167.

[10]IWANAMI K,MATSUMOTO I,TANAKA-WATANABE Y,et al.Crucial role of the interleukin-6/interleukin-17 cytokine axis in the induction of arthritis by glucose-6-phosphate isomerase[J].Arthritis Rheum,2008,58(3):754-763.

[11]FUJIMOTO M,SERADA S,MIHARA M,et al.Interleukin-6 blockade suppresses autoimmune arthritis in mice by the inhi bition of inflammatory Th17 responses[J].Arthritis Rheum,2008,58(12):3710-3719.

[12]YOSHIDA H,HASHIZUME M,MIHARA M.IL-6 blockade preferentially inhibits Th17 differentiation in collagen-induced arthritis[J].Rheumatol Int,2011,31(1):127-131.

[13]LEVINE B,KALMAN J,MAYER L,et al.Elevated circulating levels of tumor necrosis factor in severe chronic heart failure[J].N Engl J Med,1990,323(4):236-241.

[14]AKIRA S,TAGA T,KISHIMOTO T.Interleukin-6 in biology and medicine[J].Adv Immunol,1993,54:1-78.

[15]TERGAONKAR V.NF kappa B pathway:a goodsignaling paradigm and therapeutic target[J].Int J Biochem Cell Biol,2006,38(10):1647-1653.

[16]MELISI D,NIU J,CHANG Z,et al.Secreted interleukin-1 alpha induces a metastatic phenotype in pancreatic cancer by sustaining a constitutive activation of nuclear factor-kappa B[J].Mol Cancer Res,2009,7(5):624-633.

（申海菊 編輯）

Effects of Tocilizumab on myocardial inflammation mediated by Th17 cells in rats with chronic heart failure*

Hai-ning ZHANG,Yuan YIN,Yu-mei LIU,Wei-wen ZHANG
(Department of Pharmacology,Guangzhou Medical University,Guangzhou,Guangdong 511436,P.R.China)

【Objectives】To observe the effect of Tocilizumab on the myocardial inflammation mediated by T helper cells 17 (Th17)in rats with chronic heart failure,and to explore the possible protective action of Tocilizumab on heart function.【Methods】Male Sprague-Dawley (SD)rats were subjected to the permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD)to induce chronic heart failure.One day later,the rats in the Tocilizumab group

an intraperitoneal injection of 5 mg/kg of Tocilizumab once every four weeks for 12 weeks.Cardiac function parameters of the rats were measured by left ventricular catheterization at the end of experiments.The levels of proinflammatory cytokines such as tumor necrosis factor α(TNF-α),interleukin 1β (IL-1β),interleukin 6(IL-6),interleukin 17(IL-17)and interleukin 23(IL-23)in the heart and the spleen were measured by ELISA.The mRNA expressions of retinoid related orphan receptor t(ROR t)and retinoid related orphan receptor α (ROR α)were detected by real-time quantitative PCR.Th17 cell frequency was analyzed by flow cytometry and the expression level of nuclear factor-κB (NF-κB)p65 in the cardiomyocyte nuclei was examined using Western blot.【Results】Tocilizumab treatment significantly decreased the rat mortality and the heart-to-body weight ratio(HW/BW),and ameliorated rat cardiac function,as evidenced by decreasing mean blood pressure(MBP)and left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP)and increasing the maximum ascending and descending rates of left ventricular diastolic pressure(±dp/dt)and left ventricular systolic pressure(LVSP).Moreover,the rats in the model group exhibited significantly increased IL-23 and IL-17 expressions,Th17 cell frequency,mRNA levels of RORt and RORα in the rat spleen,as well as increased cardiomyocyte NF-κB p65 expression and myocardial content of IL-1β,IL-6 and TNF-α as compared with those in the control group;but all of them were reduced by Tocilizumab treatment.【Conclusions】Tocilizumab may exert a myocardial protective effect by inhibiting the inflammation mediated by Th17 cells.

chronic heart failure;inflammation;Tocilizumab;nuclear factor-κB

R541.6

A

1005-8982（2015）35-0007-06

2015-02-11

廣州市教育局基金（No：10A179）