趙楚生，王奕忠，吳令杰，郭旭武

（廣東省汕頭市中心醫(yī)院，廣東汕頭515031）

·臨床論著·

Micro RNA-146a基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者抗病毒療效的相關性

趙楚生，王奕忠，吳令杰，郭旭武

（廣東省汕頭市中心醫(yī)院，廣東汕頭515031）

目的探討micro RNA-146a（miR-146a）基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）和慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者干擾素-α（IFN-α）治療應答反應的相關性。方法選擇接受IFN-α抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者133例，其中應答組79例，無應答組54例。采集兩組靜脈血并提取DNA，用聚合酶鏈式反應-限制性內切酶長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法對miR-146a行SNP分型。結果miR-146a CT基因型與TT基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.009）；CC基因型與TT基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.029）。T等位基因與C等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.020）。結論MiR-146a基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者抗病毒療效相關，T等位基因或TT基因型與IFN治療應答相關，而C等位基因或CC基因型與干擾素治療應答無相關。

RNA；基因多態(tài)性；肝炎病毒；等位基因

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種導致急、慢性乙型肝炎的病原體，世界上約有4億慢性HBV感染者，其中75％為亞洲人。急性感染可導致嚴重致命的爆發(fā)性肝炎，慢性感染可導致肝硬化甚至肝細胞癌，所以在許多國家，這是一非常嚴重的問題[1]。干擾素-α（Interferon-α，IFN-α）有抗病毒、免疫調節(jié)、抗增生及基因誘導特性。應用IFN-α治療可使CHB患者獲得病毒學應答，并可改善臨床結果[2]。影響IFN-α療效的因素很多，本研究目的是探討microRNA-146a（miR-146a）基因多態(tài)性對慢性乙型肝炎患者IFN-α抗病毒治療應答的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料

選取2010年1月-2013年12月本院感染科就診的CHB患者133例，HBeAg陽性及HBV-DNA陽性，所有患者接受24～72周的普通IFN或聚乙二醇化干擾素（PEG-IFN）治療。根據患者對IFN-α的病毒學反應分成應答組（n=79）和非應答組（n=54）例。應答組定義為治療期間患者血清HBV-DNA＜100 IU/ml，隨訪1年未復發(fā)。非應答組定義為治療期間未達到以上標準，或者達到以上標準后隨訪1年復發(fā)。

1.2檢測方法

1.2.1 標本采集和基因組DNA提取抽取靜脈血1 ml，乙二胺四乙酸抗凝外周全血。將1 ml全血加至2.5 ml抽提緩沖液中，60℃保溫1 h，15 000 r/min離心10 min，上清液轉入另一個新的離心管中。加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），混勻抽提至水乳膠融狀。15 000 r/min離心10 min，上清液轉入另一個新的離心管中。加入2/3體積的預冷異丙醇，置入-20℃冰箱保溫30～60min，緩慢混勻DNA成絮狀析出。15 000 r/min離心10 min，棄上清液。用70％乙醇洗2次沉淀DNA，加入400μl TE buffer溶解DNA。

1.2.2 聚合酶鏈式反應-限制性內切酶長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP）分析利用PCR-RFLP方法分析miR-146a基因多態(tài)性。其中PCR引物參照JAZDZEWSKI等[3]的報道，并行PubMed blast比對，與擴增產物符合。PCR反應體系為20μl，包括300 ng的基因組DNA，正、反向引物各0.2μmoL/L，10×PCR buffer 2μl，2.5 mmol/L dNTPs 2μl及l(fā)μl Taq DNA聚合酶（日本TaKaRa公司）。PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，共33個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸7 min，于40℃保存。PCR產物經2％瓊脂糖溴化乙錠電泳分析，100 bp DNA Marker（日本TaKaRa公司）作為參照組，驗證目的片段是否擴增成功。138 bp PCR產物經限制性內切酶MspⅠ（立陶宛MBI Fermentas公司）消化，37℃、5 uEcoRⅠ過夜反應，經3％瓊脂糖溴化乙錠凝膠電泳分析。單一138 bp條帶代表野生型TT純合子，雙帶112和26 bp代表突變的CC純合子，3條帶138、112和26 bp代表CT雜合子。為確?；蛐头治龅臏蚀_性，隨機選取10％PCR產物進行測序，與酶切結果100％符合。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較用兩獨立樣本的t檢驗，計數資料以率表示，用χ2檢驗，兩組患者等位基因頻率行Hardy-Weinberg equilibrium分析、等位基因頻率比較及A值計算用χ2檢驗，以TT基因型作為參照，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1兩組患者一般資料比較

兩組患者年齡、性別、丙氨酸轉氨酶及天冬氨酸轉氨酶比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.130、0.627、0.420和0.685）。兩組患者感染HBV的途徑比較，包括輸血史、吸毒史、其他醫(yī)療操作或其他方面，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.281），具有可比性。

2.2MiR-146a基因多態(tài)性分析

MiR-146a序列和PCR產物序列測序結果見圖1。MiR-146a PCR擴增產物片段長度為138 bp。其中野生型TT純合子不能被EcoRⅠ酶切，仍為138 bp。突變的CC純合子可被EcoRⅠ完全酶切，產物片段為112和26 bp（因片段太小，電泳條帶不清楚）。CT雜合子的擴增產物部分酶切，可見138、112和26 bp片段（因片段太小，電泳條帶不清楚）。見圖2。

2.3MiR-146a C/T基因多態(tài)性與患者抗病毒療效的相關性

圖1 測序結果

慢性乙型肝炎患者miR-146a基因型分布經χ2檢驗符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.610，P=0.382），說明研究對象具有群體代表性。兩組患者中miR-146a CT雜合子為主要的基因型，CT基因型與TT基因型比較差異有統(tǒng)計學意義[A=2.935，（95％CI：1.291，6.341），P=0.009]，CC基因型與TT基因型比較差異有統(tǒng)計學意義（A=3.027，95％CI：1.048，9.078，P=0.029）。應答組的T等位基因頻率（64.6％）比非應答組（49.1％）高，而非應答組的C等位基因頻率（50.9％）比應答組（35.4％）高，且C等位基因與T等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計學意義（OR=1.782，95％CI：1.028和2.914，P=0.020）。miR-146a CC基因型或C等位基因可能與慢性乙型肝炎患者抗病毒療效欠佳有關。見附表。

圖2 miR-146a C/T多態(tài)性位點EcoRⅠ酶切電泳圖

附表 兩組患者的miR-146a C/T基因多態(tài)性例（％）

3 討論

IFN-α是目前治療乙型肝炎病毒感染具有持久療效的抗病毒藥物，有抗病毒和免疫調節(jié)作用，可以清除HBV，抑制肝臟壞死性炎癥，降低肝硬化或肝細胞癌的危險性。據報道，應用IFN-α治療的患者中，HBeAg陽轉率約為40％，HBV-DNA陰轉率約為50％[4]。

與核苷類似物相比，IFN-α治療療程有限，治療應答率偏低。尋找影響治療反應的預測因素對制定個體化治療方案、節(jié)省醫(yī)療成本、避免副反應，具有一定的臨床意義。研究證實，高丙氨酸轉氨酶水平（＞200 u/L）、女性、低HBV載量、病毒基因型（B＞C）等因素可預測HBcAg陽性的慢性HBV患者對干擾素治療的應答，并預示良好的應答效果[5-6]。除上述影響療效的外在因素，不同個體的遺傳背景亦影響自身對藥物的反應性。通過SNP的研究，可以從遺傳背景的角度探討影響療效的預測因素，并為闡明干擾素確切的作用機制提供線索。

MiRNA是一種在機體中高度保守的20～23個核苷酸長度的非編碼RNA，能夠廣泛地參與基因的轉錄后調節(jié)，包括調節(jié)生物體的生物學和各種疾病的進程[7]。其中miR-l46a作為較早發(fā)現的與免疫炎癥相關的調節(jié)因子，與乙肝肝癌的易感性密切相關[8]。

本研究表明，miR-146a CT雜合子在慢性乙型肝炎患者中占優(yōu)勢，且CT基因型與野生TT基因型比較差異有統(tǒng)計學意義。CT基因型在非應答組頻率較高，表明CT基因型比野生TT基因型療效差。C等位基因與T等位基因比較差異有統(tǒng)計學意義，表明C等位基因或CC基因型與患者對干擾素應答欠佳或治療后復發(fā)率高相關。MiR-146a基因多態(tài)性可能影響相關靶基因的表達，從而影響疾病對藥物的療效。下一步筆者將通過研究miR-146a的可能調控因素和相關基因表達，為慢性乙型肝炎患者個體化治療提供理論依據。

[1]金仙玉,張新宇.乙型肝炎病毒母嬰傳播及其預防的研究現狀[J].中華圍產醫(yī)學雜志,2013(7)∶258-260.

[2]江曉燕,陳明勝,劉寧.不同HBV基因型慢性乙型肝炎干擾素治療的臨床療效[J].福建醫(yī)藥雜志,2013,35(6)∶78-80.

[3]JAZDZEWSKI K,MURRAY EL,FRANSSILA K,et al.Common SNP in pre-miR-146a decreases mature mir expression and predisposes to papillary thyroid carcinoma[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(20)∶7269-7274.

[4]邱宏.干擾素治療慢性乙型肝炎臨床療效觀察[J].中國慢性病預防與控制,2010,18(6)∶628-629.

[5]徐學俊.干擾素治療慢性乙型肝炎的長期療效觀察[J].中國臨床醫(yī)學,2006,13(5)∶758-760.

[6]葉志典,陳勇毅,羅賢鑫,等.慢性乙型肝炎不同炎癥分級與干擾素抗病毒療效探討[J].現代醫(yī)院,2013,13(4)∶10-12.

[7]MORISHITA A,MASAKI T.MiRNA in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology Research,2014,45(2)∶128-141.

[8]侯召華.MiR146a參與HBV感染造成的肝細胞Ⅰ型干擾素應答抑制的分子機制研究[D].濟南∶山東大學,2012.

（申海菊 編輯）

MicroRNA-146a gene polymorphism and antiviral therapy of chronic hepatitis B

Chu-sheng ZHAO,Yi-zhong WANG，Ling-jie WU,Xu-wu GUO
(Shantou Central Hospital,Shantou,Guangdong 515031,P.R.China)

【objertive】To investigate the relationship between the single nucleotide polymorphism(SNP)on miR-l46a gene and the treatment effects of TFN-α.【Methods】Totally 133 patients of chronic hepatitis B infection who

the treatment of IFN-α were enrolled in this study.The patients were divided into two groups:sustained virological response(n=79)group and non virological response(NVR)or recurrence(n=54)group.Blood samples were collected and chromosomal DNA was extracted.The miR-146a polymorphism was determined with the method of polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism(PCRRFLP).【Results】In our study,there was a statistical association between miR-146a polymorphism and the antiviral therapy efficacy in the hepatitis B patients.There was a statistical difference in the CT genotype and the TT genotype of miR-146a between the two groups(P=0.009).There was a significant difference in the CC genotype and TT genotype between the two groups(P=0.029).There was a significant difference in the C allele and T allele between the two groups(P=0.02).【Conclusions】These findings suggested that the SNP in miR-146a is associated with the antiviral therapy efficacy of hepatitis B patients.And the TT genotype or T alleles is associated with the response to TFN-α therapy while the CC genotype or C allele is not related to the response to TFN-α therapy or recurrence.

RNA;gene;hepacivirus;allele

R512.62

A

1005-8982（2015）35-0070-03

2014-03-27