張　茜，肖新華，黎　明，李文慧，于　淼，張化冰，平　凡，楊國華

·中藥研究·

復(fù)方血栓通膠囊改善腎功能機(jī)制研究*

張茜，肖新華，黎明，李文慧，于淼，張化冰，平凡，楊國華

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科，衛(wèi)生部內(nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730）

［目的］研究復(fù)方血栓通膠囊對糖尿病腎?。―N）大鼠24 h尿白蛋白、尿肌酐、血肌酐和血尿素氮等相關(guān)代謝指標(biāo)的影響，及應(yīng)用基因芯片探討復(fù)方血栓通膠囊改善DN大鼠腎功能的機(jī)制。［方法］選用SD大鼠45只，高脂喂養(yǎng)/鏈尿佐菌素（STZ）注射法制備DN模型，將DN成模大鼠40只隨機(jī)分為小劑量、中劑量、大劑量血栓通組［分別給予0.3、0.6、1.2 g/（kg·d）的血栓通粉末懸濁液］、DN模型組（給予生理鹽水）。另外選用SD大鼠10只為正常對照組（給予生理鹽水），均連續(xù)灌胃12周。每月末測定大鼠空腹血糖（FBG）和體質(zhì)量。3個月末測定大鼠24 h尿白蛋白、尿肌酐、血肌酐和血清尿素氮水平。取大鼠腎臟組織進(jìn)行Illumina基因芯片實(shí)驗(yàn)以期從整體基因角度揭示復(fù)方血栓通膠囊改善腎功能的機(jī)制。實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果。［結(jié)果］復(fù)方血栓通膠囊能以劑量依賴的方式降低24 h尿白蛋白、血肌酐和血清尿素氮，升高尿肌酐（P＜0.05或P＜0.01）?；蛐酒@示大劑量血栓通組較模型組有67個基因顯著改變，其中34個上調(diào)，33個下調(diào)。實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大劑量血栓通組膠原蛋白1型1（Col1a1）、結(jié)締組織生長因子（Ctgf）和轉(zhuǎn)化生長因子1（Tgfb1）基因較模型組顯著下調(diào)，細(xì)胞色素P450家族2亞族C肽23（Cyp2c23）和Nephrin-1（Nphs1）顯著上調(diào)。［結(jié)論］復(fù)方血栓通膠囊能有效改善DN大鼠腎臟功能，其機(jī)制可能涉及Bmp2-Tgfβ-Ctgf通路，Cyp2c23和足細(xì)胞損傷修復(fù)。

復(fù)方血栓通膠囊；基因芯片；糖尿病腎?。蛔慵?xì)胞

糖尿病腎?。―N）是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。新近研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥制劑在逆轉(zhuǎn)和治療DN中有很好的療效，如糖腎康膠囊，益腎化瘀沖劑等［1-2］。復(fù)方血栓通膠囊是由三七、黃芪、丹參和玄參4味藥組成的復(fù)方，具有改善血液流速和溶解血塊的作用。以往研究發(fā)現(xiàn)血栓通膠囊能夠降低DN大鼠24 h尿蛋白，改善腎小管基底膜厚度［3］。在DN患者的研究中也證實(shí)了這一點(diǎn)［4］。但是復(fù)方血栓通膠囊改善腎臟功能的機(jī)制還有待研究?；蛐酒夹g(shù)作為一種先進(jìn)的高通量檢測技術(shù)，具有靈敏、準(zhǔn)確、高信息量等優(yōu)點(diǎn)，可以對個體生物的大量基因表達(dá)信息進(jìn)行高速檢測和分析。本研究旨在研究復(fù)方血栓通膠囊對DN大鼠24 h尿白蛋白、尿肌酐、血肌酐和血尿素氮等相關(guān)代謝指標(biāo)的影響，且應(yīng)用基因芯片從整體上探討復(fù)方血栓通膠囊改善DN大鼠腎功能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動物分組及處理5周齡雄性SD大鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所 ［SCXK（京）-2011-0010］。45只SD大鼠構(gòu)建DN模型：給予4周高脂飼料喂養(yǎng)（豬油10%，糖20%，膽固醇2.5%，膽酸鹽1%，常規(guī)鼠飼料66.5%，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所）后，單次腹腔注射1%鏈脲佐菌素（STZ）30 mg/kg（Sigma公司）。1周后檢測空腹血糖（FBG，禁食6 h，取尾靜脈血，葡萄糖氧化酶法），F(xiàn)BG＞16.7mmol/L者（n= 40）入組。DN組按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組，小劑量、中劑量和大劑量血栓通組（各組n=10），分別灌胃生理鹽水、0.3、0.6、1.2 g/kg的血栓通粉末懸濁液，每日1次。另外10只正常健康SD大鼠為正常對照組。每4周測定FBG和體質(zhì)量。12周末，留取24 h尿測定24 h尿白蛋白和尿肌酐，取血測定血清肌酐和尿素氮。取腎臟，立即放在液氮中保存。

1.2相關(guān)指標(biāo)測定于開始灌胃當(dāng)天，喂藥后4、8、12周測量大鼠體質(zhì)量、FBG。灌胃12周后，將大鼠放置于代謝籠，留取24 h尿，酶法測定24 h尿白蛋白和尿肌酐。12周末，禁食6 h，處死，摘眼球取血，酶法測定血肌酐和血清尿素氮。

1.3基因芯片實(shí)驗(yàn)

1.3.1腎臟組織總核糖核酸（RNA）抽提處死小鼠后，立即取腎臟組織置液氮凍存?zhèn)溆谩Ｐ┝?、中劑量和大劑量血栓通組和模型組各自取3個腎臟樣本進(jìn)行基因芯片實(shí)驗(yàn)。Trizol法提取 RNA（Qiagen）。紫外吸收測定法（NanoDrop ND-1000）測定RNA含量，變性瓊脂糖凝膠電泳觀測18 s和28 s條帶亮度，對RNA質(zhì)量進(jìn)行鑒定。

1.3.2Illumina基因芯片實(shí)驗(yàn)本研究應(yīng)用Illumina大鼠Ref-12表達(dá)譜芯片，包含22 228個大鼠基因。按照Illumina TotalPrep RNA擴(kuò)增試劑盒操作程序進(jìn)行RNA擴(kuò)增?？俁NA逆轉(zhuǎn)錄得到第一鏈互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），再合成第2鏈cDNA。cDNA純化，體外轉(zhuǎn)錄合成補(bǔ)充核糖核酸（cRNA），cRNA純化，雜交，洗滌，染色，干燥進(jìn)行芯片掃描（Illumia芯片掃描儀）。

1.3.3芯片數(shù)據(jù)處理應(yīng)用Illumina微珠芯片掃描儀掃描芯片，Illumina微珠芯片圖像分析軟件對芯片灰度掃描圖進(jìn)行分析處理。應(yīng)用立方樣條函數(shù)法（cubic spine）對原始數(shù)據(jù)歸一化處理。差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為大劑量血栓通組（或小劑量、中劑量血栓通組）與模型組相比，倍比值＞2或者＜-2，而且P＜0.05。應(yīng)用Cluster和TreeView軟件進(jìn)行聚類分析。為了將差異基因按照生物學(xué)功能進(jìn)行分類，使用DAVID軟件和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因分類（GO）分析。

1.4實(shí)時定量PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證基因芯片實(shí)驗(yàn)，挑選了5個基因進(jìn)行實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實(shí)驗(yàn)。這5個基因是：膠原蛋白1型1（Col1a1）、結(jié)締組織生長因子（Ctgf）、細(xì)胞色素P450家族 2亞族 C多肽 23（Cyp2c23）、Nephrin-1（Nphs1）和轉(zhuǎn)化生長因子1（Tgfb1）。留取小劑量、中劑量、大劑量血栓通組和模型組大鼠腎臟各3只，按照前面所述方法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物設(shè)計(jì)見表1。管家基因GAPDH。實(shí)時定量PCR在ABI 7700系統(tǒng)上完成。

表1　實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)Tab.1　Oligonucleotide sequences for quantitative real time PCR analysis

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnet’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1復(fù)方血栓通膠囊對DN大鼠體質(zhì)量的影響DN大鼠較對照組體質(zhì)量顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。血栓通治療組較模型組體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。說明復(fù)方血栓通膠囊對DN大鼠體質(zhì)量無影響。

表2　復(fù)方血栓通膠囊對DN大鼠體質(zhì)量的影響Tab.2　Effects of FXST on body weight of DN ratsg

表2　復(fù)方血栓通膠囊對DN大鼠體質(zhì)量的影響Tab.2　Effects of FXST on body weight of DN ratsg

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別　1個月　2個月　3個月對照組　492.4±37.0　543.4±40.1　592.6±29.9 DN模型組　455.0±32.4*452.8±30.0**459.2±42.7**小劑量血栓通組　486.8±37.7*479.5±32.7**487.9±34.7**中劑量血栓通組　472.8±29.4*470.2±36.7**471.8±38.9**大劑量血栓通組　420.3±33.0*425.1±32.4**439.8±39.6** n 10 10 10 10 10 0個月446.6±18.3 450.0±42.8 481.4±32.4 468.2±27.1 047.6±39.3

2.2復(fù)方血栓通膠囊對DN大鼠FBG的影響DN大鼠FBG較對照大鼠顯著升高（P＜0.01）。血栓通治療組較模型組大鼠FBG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表3）。說明復(fù)方血栓通膠囊對DN大鼠FBG無影響。

表3　復(fù)方血栓通膠囊對DN大鼠FBG的影響（Tab.3　Effects of FXST on FBG of DN ratsmmol/L

表3　復(fù)方血栓通膠囊對DN大鼠FBG的影響（Tab.3　Effects of FXST on FBG of DN ratsmmol/L

注：與對照組比較，**P＜0.01。

組別　1個月　2個月　3個月對照組　6.3±0.7　6.4±0.5　6.7±0.3 DN模型組　18.9±4.1**19.2±5.3**19.4±6.0**小劑量血栓通組　17.8±6.2**19.4±4.5**17.4±4.6**中劑量血栓通組　17.4±5.8**18.7±5.9**19.5±3.7**大劑量血栓通組　18.1±4.9**17.8±5.2**18.4±3.5** n 10 10 10 10 10 0個月6.5±0.6 19.6±3.4** 18.4±3.1** 19.2±2.5** 18.9±2.7**

2.3復(fù)方血栓通膠囊對DN大鼠腎功能生化指標(biāo)的影響DN大鼠尿肌酐較對照組顯著下降（P＜0.05），24 h尿白蛋白，血肌酐和血清尿素氮顯著升高（P＜0.05）。小劑量、中劑量和大劑量血栓通組24 h尿蛋白、血肌酐和血清尿素氮較DN組顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。小劑量、中劑量和大劑量血栓通組尿肌酐較DN組顯著上升（P＜0.05），見表4。說明復(fù)方血栓通膠囊能以劑量依賴的方式顯著升高尿肌酐，降低24 h尿白蛋白，血肌酐和血尿素氮，改善DN大鼠腎功能。

表4　復(fù)方血栓通膠囊干預(yù)12周對DN大鼠24 h尿白蛋白，尿肌酐，血肌酐和血清尿素氮的影響Tab.4　Effects of FXST treatment on 24 h urinary albumin，urinary creatinine，serum creatinine and serum urea nitrogen in DN rats

表4　復(fù)方血栓通膠囊干預(yù)12周對DN大鼠24 h尿白蛋白，尿肌酐，血肌酐和血清尿素氮的影響Tab.4　Effects of FXST treatment on 24 h urinary albumin，urinary creatinine，serum creatinine and serum urea nitrogen in DN rats

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DN模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　尿肌酐　血肌酐血清尿素氮（mmol/L）（μmol/L）（mmol/L）對照組　9.36±1.52　49.4±3.5　7.6±1.7 DN模型組　2.44±0.57**81.0±7.8*20.2±2.5**小劑量血栓通組　3.05±0.84**#71.4±6.1*#16.2±1.6**#中劑量血栓通組　3.29±0.49**#75.8±4.1*#15.3±2.4**#大劑量血栓通組　3.42±0.31**#68.5±7.9*#13.4±2.5*##n 10 10 10 10 10 24 h尿白蛋白（mg/d）24.9±3.9 72.6±5.4** 58.4±6.4**#52.9±3.6**#43.5±4.5*##

2.4基因芯片結(jié)果小劑量血栓通組較模型組有28個基因表達(dá)改變，其中15個上調(diào)，13個下調(diào)。大劑量血栓通組有67個基因表達(dá)改變，其中34個上調(diào)，33個下調(diào)，其中，9個基因在小劑量血栓通組也存在差異表達(dá)。對大劑量血栓通組的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)67個差異表達(dá)基因分為27個GO分類。將這27個GO分類進(jìn)行DAVID聚類分析，結(jié)果顯示3個聚類（P＜0.05，倍比值＞2.0，且聚類評分＞2.0）。3個聚類的評分在2.62到3.66之間，見表5。其中，第1個聚類包括3個GO分類：營養(yǎng)、營養(yǎng)水平和細(xì)胞外刺激。第2個聚類包括：膜聯(lián)囊泡、囊泡、胞漿膜聯(lián)囊泡和胞漿囊泡。第3個聚類包括：季胺轉(zhuǎn)運(yùn)、陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)和胺轉(zhuǎn)運(yùn)。KEGG通路分析顯示大劑量血栓通組差異基因富集在2個通路上（P＜0.10，倍比值＞2.0），見表6。這2個通路是細(xì)胞色素P450通路和藥物代謝通路。

2.5實(shí)時定量PCR結(jié)果大劑量血栓通組Col1a1，Ctgf和Tgfb1基因較DN模型組相對表達(dá)量顯著降低，Cyp2c23和Nphs1基因較DN模型組相對表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），見表7。其結(jié)果與基因芯片的結(jié)果一致。

表5　DAVID功能聚類分析Tab.5　DAVID function annotation cluster analysis

表6　KEGG通路分析Tab.6　KEGG pathway

表7　實(shí)時定量PCR和基因芯片的結(jié)果Tab.7　Results of fold change in gene expression measured by gene array and real time PCR

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方血栓通膠囊能以劑量依賴的方式，顯著降低DN大鼠24 h尿白蛋白，血肌酐和血清尿素氮，增加尿肌酐水平。以往研究也發(fā)現(xiàn)了復(fù)方血栓通膠囊具有改善腎臟功能的特點(diǎn)。Lang等［4］發(fā)現(xiàn)給予DN患者血栓通治療，能降低尿白蛋白和改善血液黏稠度。在DN大鼠中也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果［3］。

復(fù)方血栓通膠囊包含4種成分：三七、黃芪、丹參和玄參。其中三七能修復(fù)KKAy小鼠腎小球損傷［5-6］。黃芪能降低血糖，具有抗氧化的作用［7］。Luo等［8］發(fā)現(xiàn)丹參能抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生。

基因分類分析顯示大劑量血栓通組27個GO分類中，“膠原蛋白1型”的倍比值最高（倍比值: 276.3）。在大劑量血栓通組的差異表達(dá)基因中，有2個基因在這一GO分類中（Cola1，Col1a2）。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)中的重要結(jié)構(gòu)。足細(xì)胞和足細(xì)胞特異蛋白是早期腎小球病變尿標(biāo)志物之一［9］。實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大劑量血栓通組Col4a4（-3.721倍）和Nphs1（2.520倍）顯著變化。Veiming等［10-11］發(fā)現(xiàn)DN患者腎小球膠原蛋白Ⅳ顯著增加。Nephrin是足細(xì)胞特異蛋白之一。尸檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病患者腎臟Nephrin表達(dá)下調(diào)［12］。本研究揭示復(fù)方血栓通膠囊可能通過下調(diào)Col4a4基因，上調(diào)Nphs1基因，阻止足細(xì)胞破壞，改善DN大鼠腎臟功能。

DAVID功能聚類分析中，本研究發(fā)現(xiàn)評分最高的功能聚類（倍比值：3.66）包括3個GO功能分類：營養(yǎng)，營養(yǎng)水平和對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)。這3個GO功能分類包括7個基因：Bmp2，Cubn，Adh1，Clk2，Zfp354a，Col1a1和Tgfb1。另外，本研究發(fā)現(xiàn)大劑量血栓通組Tgfb1（-2.550）和Ctgf（-3.266）基因顯著下調(diào)，并且實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)。骨形成蛋白2（Bmp2）和轉(zhuǎn)移生長因子-β（Tgf-β）是激活素（activin）/骨形成超家族成員［13］，其在凋亡，損傷修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)形成中起重要作用［14］。Tgf-β在DN的腎臟肥大，纖維化/硬化表現(xiàn)中起到至關(guān)重要的作用［15-17］。Ziyadeh等［18］用抗TGF-β單克隆抗體長期治療糖尿病小鼠，發(fā)現(xiàn)能改善腎臟功能。結(jié)締組織生長因子（Ctgf）是一種主要的自分泌因子。Tgf-β能誘導(dǎo)Ctgf產(chǎn)生。有報(bào)道Tgf-β1能誘導(dǎo)足細(xì)胞中Ctgf mRNA產(chǎn)生和蛋白表達(dá)［19］。故推測復(fù)方血栓通膠囊能通過抑制Bmp2-Tgfβ-Ctgf通路，阻止細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積累。

KEGG通路分析顯示大劑量血栓通組涉及2個通道的改變：細(xì)胞色素P450通路和藥物代謝通路。細(xì)胞色素P450家族2亞族C多肽23（Cyp2c23）在這2個通路上出現(xiàn)?；蛐酒Y(jié)果顯示大劑量血栓通組Cyp2c23顯著上調(diào)（倍比值：3.194）。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)給與大鼠Cyp2c23能夠保護(hù)血管緊張素Ⅱ引起的腎損傷［20］。

總之，本研究觀察到復(fù)方血栓通膠囊能有效降低DN大鼠24 h尿白蛋白，血肌酐和血清尿素氮，升高尿肌酐，改善腎臟功能。復(fù)方血栓通膠囊對DN大鼠腎臟功能的改善作用是多通路的。本研究嘗試使用基因芯片來探討這些復(fù)雜的機(jī)制，并用實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些結(jié)果。并且，本研究選用復(fù)方血栓通膠囊治療后的DN大鼠的腎臟作為實(shí)驗(yàn)材料，為復(fù)方血栓通膠改善腎功能的機(jī)制研究提供了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。但是，這些結(jié)果還需要進(jìn)一步在蛋白水平進(jìn)行證實(shí)。

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（本文編輯：高杉，于春泉）

Study of the mechanism of Fufang Xueshuantong capsule on kidney function

ZHANG Qian，XIAO Xin-hua，LI Ming，LI Wen-hui，YU Miao，ZHANG Hua-bing，PING Fan，YANG Guo-hua
（Department of Endocrinology，Peking Union Medical College Hospital，Key Laboratory of Endocrinology，Ministry of Health，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100730，China）

［Objective］To explore the effects of Fufang Xueshuantong capsule（FXST）on the kidney function in diabetic nephropathy（DN）rats and to investigate its possible mechanism.［Methods］SD rats were fed with high fat diet and injected with STZ to make diabetic nephropathy（DN）model.DN rats were randomly divided into four groups:low dose（XSTL），medium dose（XSTM），high dose（XSTH）FXST groups（treated with 0.3，0.6，1.2 g/kg/d FXST，respectively，n=10），and DN model group（treated with saline，n=10）.Normal rats were enrolled as normal group（treated with saline，n=10）.The fasting blood glucose，weight，24-h urinary albumin，urinary creatinine，blood creatinine and blood urea nitrogen were tested.Illumina Rat Ref-12 Expression BeadChip gene array experiment was done using kidney of rats.［Results］FXST could reduce 24-h urinary albumin，serum creatinine and serum urea nitrogen，and increase urinary creatinine in a dose dependent manner compared with those of DN model group（P＜0.05 or P＜0.01）.Gene array showed that FXST significantly changed expression of genes（34 increased，33 decreased）.Real-time PCR showed that relative levels for Col1a1，Ctgf and Tgfb1 were significantly decreased in FXST group，compared with the model group.Cyp2c23 and Nphs1 were increased.［Conclusion］FXST can moderate the kidney function in DN rats.The mechanism may be involved with BMP2-TGFβ-CTGF pathway，CYP2C23 and podocytes proteins.

Fufang Xueshuantong capsule；gene array；diabetic nephrapathy；podocyte

R587.1

A

1672-1519（2015）06-0359-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.06.11

北京協(xié)和醫(yī)院基金項(xiàng)目（2006119）；國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目（WBYZ2011-873）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81170736，81300649）；中華醫(yī)學(xué)會臨床醫(yī)學(xué)科研專項(xiàng)基金-默沙東糖尿病研究項(xiàng)目（12030450345）；北京協(xié)和醫(yī)院中青年基金，協(xié)和青年基金（33320140022）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金。

張茜（1979-），女，博士，助理研究員，從事糖尿病研究工作。

肖新華，E-mail:xiaoxinhua@medmail.com.cn。

（2014-12-25）