黃曉輝，茹晶晶，羅五魁，郭彩云

(寧德師范學(xué)院)

0 引言

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)年產(chǎn)葡萄約100萬噸，其中80%的葡萄用于釀酒.在釀酒的同時(shí)將產(chǎn)生大量的葡萄籽［1］，葡萄籽中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物及其他營(yíng)養(yǎng)保健物質(zhì)［2］.目前對(duì)葡萄籽蛋白質(zhì)的提取利用報(bào)道極少［3］.傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離方法，有等電點(diǎn)沉淀和pH調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑法等方法.但這些方法很難用于具有某些特殊性質(zhì)的生化產(chǎn)品的提取與分離，原因在于這類物質(zhì)多數(shù)不溶于非極性有機(jī)溶劑［4－6］.20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的反膠團(tuán)萃取技術(shù)解決了這難題，反膠團(tuán)法萃取蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)主要是萃取率高并具有選擇性;過程簡(jiǎn)單;能解決蛋白質(zhì)在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問題;溶劑可反復(fù)使用、成本低廉［7］.

該課題擬用十六烷基三甲基溴化銨(CATB)/異辛烷/正丁醇反膠團(tuán)體系萃取葡萄籽蛋白質(zhì)，并探討了反膠團(tuán)葡萄籽蛋白的萃取工藝條件，為進(jìn)一步開發(fā)葡萄籽植物蛋白新資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與試劑

十六烷基三甲基溴化銨(CATB)、異辛烷、正辛醇、氯化鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙醇、磷酸85%、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅指示劑、氫氧化鈉、95%乙醇(以上均為分析純 天津市福辰化學(xué)試劑廠)，VIS－7220型分光光度計(jì)(北京瑞麗分析儀器公司)，DHG－9001A型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，pHS－25W數(shù)顯pH計(jì)(上海雷磁創(chuàng)益儀表有限公司)，電子天平 AR124CN(奧豪斯儀器(上海)有限公司)，KQ－250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 測(cè)定葡萄籽中總蛋白質(zhì)含量

用凱氏定氮法［8］測(cè)定葡萄籽中總蛋白質(zhì)含量.

2.2 反膠團(tuán)法萃取葡萄籽中的蛋白質(zhì)

稱取適量CATB將其置于250 mL錐形瓶中，加入一定體積的異辛烷與正辛醇(體積比為4∶1)的混合溶劑、一定濃度KCl和一定pH的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液［8］.向上述反膠團(tuán)溶液中加入一定量葡萄籽粉(精確到0.0001 g)將錐形瓶置于超聲波清洗器超聲一段時(shí)間，超聲波清洗后所得混合物倒入離心管中進(jìn)行離心分離出去殘?jiān)?］，所得清液用考馬斯亮藍(lán)G－250法測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)含量.

3 結(jié)果與分析

3.1 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線［10］

按文獻(xiàn)［10］方法測(cè)定考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線的線性方程為y=0.0006x+0.0192，其中x為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，y為吸光度，R2=0.9924，說明該曲線符合線性相關(guān)，且線性關(guān)系良好.

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 pH對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響

按照2.2步驟，分別調(diào)節(jié)水相不同的pH，計(jì)算不同pH下的葡萄籽蛋白質(zhì)萃取率，結(jié)果如圖1所示:

圖1 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖1可以看出，pH在3～6之間，蛋白質(zhì)的萃取率隨著pH的升高而升高.而pH在7～9之間，蛋白質(zhì)萃取率隨著pH的升高而降低.所以選取pH為6.00.

3.2.2 KCl濃度對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響

按照2.2步驟調(diào)節(jié)水相pH為6.00，調(diào)節(jié)不同KCl的濃度;計(jì)算在不同KCl鹽濃度下的葡萄籽蛋白質(zhì)萃取率;結(jié)果如圖2所示.

圖2 KCl濃度對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響

由圖2可以看出，在KCl濃度范圍為0.02～0.06 mol/L時(shí)，葡萄籽蛋白質(zhì)萃取率隨著KCl濃度的升高而升高.當(dāng) KCl濃度范圍為0.06～0.18 mol/L時(shí)，葡萄籽蛋白質(zhì)萃取率隨著KCl濃度的升高反而降低.當(dāng) KCl濃度為0.06 mol/L時(shí)葡萄籽蛋白質(zhì)的萃取率達(dá)到最高.

3.2.3 葡萄籽加入量對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響

按照2.2步驟加入不同的葡萄籽原料量，計(jì)算各原料量下的葡萄籽蛋白質(zhì)萃取率;葡萄籽原料量從0.6000 g增加到1.4000 g，葡萄籽蛋白質(zhì)萃取率隨著原料量的增加而減少.綜合考慮有效利用反膠團(tuán)溶液，所以選取加入原料量為0.6000 g.

3.2.4 萃取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響

按照2.2步驟在不同的時(shí)間萃取;計(jì)算各萃取時(shí)間下的萃取率;當(dāng)時(shí)間為20～60 min，隨著時(shí)間的增加蛋白質(zhì)萃取率也在提高，60 min以后蛋白質(zhì)萃取率的變化變?yōu)槠骄?綜合考慮選取萃取時(shí)間為60 min.

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 因素水平的選取

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取4個(gè)因素做正交試驗(yàn)，見表1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平

在進(jìn)行反膠團(tuán)法萃取葡萄籽蛋白質(zhì)的單因素分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)最佳提取工藝參數(shù)進(jìn)行探討，正交實(shí)驗(yàn)見表2.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)上述正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，影響蛋白質(zhì)萃取率的各因素主次關(guān)系是:pH＞離子強(qiáng)度＞萃取時(shí)間＞原料量;最佳萃取條件為:離子強(qiáng)度0.07 mol/L，pH 為 6.00，溫度為 50℃時(shí)，原料量為0.4000 g.在最佳工藝條件下，萃取率可達(dá)68.32%.

4 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)葡萄籽蛋白質(zhì)萃取受離子強(qiáng)度、萃取時(shí)間、pH、原料量的影響突出.通過正交實(shí)驗(yàn)可得:最優(yōu)的工藝參數(shù)為:離子強(qiáng)度0.07 mol/L，pH 為6.00，溫度為50 ℃時(shí)，原料量為0.4000 g，萃取率可達(dá)到 68.32%.這說明以CTAB/異辛烷/正辛醇反膠團(tuán)體系萃取葡萄籽蛋白質(zhì)可行的.

［1］吉宏武.葡萄酒廠下腳料的綜合開發(fā)利用途徑［J］.食品研究與開發(fā)，2000(1):29－31.

［2］周建華.葡萄籽中提取油和蛋白質(zhì)的研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2000(10):48－49.

［3］何秀珍，張慧祥，羅玉潔，等.山葡萄籽蛋白的提取和分析［J］.食品科學(xué)，1989(8):20–21.

［4］李殿寶.從葵花脫脂粕中提取分離蛋白質(zhì)工藝的研究［J］.遼寧師專學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005(1):13–15.

［5］李鳳英，權(quán)英.堿溶法提取葡萄籽中蛋白質(zhì)的工藝［J］.河北職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2003(3):5－6.

［6］沈忠耀.表面活性劑在生物工程中的應(yīng)用之一反膠團(tuán)萃?。跩］.日用化學(xué)工業(yè)，2001(1):24–27.

［7］徐寶財(cái)，王媛.反膠團(tuán)萃取分離技術(shù)研究進(jìn)展［J］.日用化學(xué)工業(yè)，2004，34(6):390–393.

［8］王家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2003.193–194.

［9］李潤(rùn)霞，陳復(fù)生，趙俊廷.CAB/正庚烷/正己醇反膠束體系前萃大豆蛋白的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(7):8－11.

［10］杭州大學(xué)化學(xué)系分析化學(xué)教研室.分析化學(xué)手冊(cè):第二分冊(cè)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1982.45–48.