于 敏，周 華，任立偉，蔣振華，韋 萍

無溶劑體系中固定化脂肪酶催化合成香茅醇酯

于 敏，周 華，任立偉，蔣振華，韋 萍

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800

在無溶劑體系中以大孔樹脂NKA吸附固定的褶皺假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase）為催化劑，以脂肪酸為酰基供體，酶法合成香茅醇脂肪酸酯?？疾炝笋薨櫦俳z酵母脂肪酶對?；w的選擇性，以及反應(yīng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、酶用量、底物比例及微量水添加等對酯化反應(yīng)的影響，建立了無溶劑中香茅醇酯的酶法合成工藝。研究表明，在酸醇物質(zhì)的量比為1，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，固定化酶用量為1 250 U/L，反應(yīng)溫度為50 ℃，微量水添加量為4 μL的條件下，反應(yīng)10h，月桂酸香茅酯及油酸香茅酯的轉(zhuǎn)化率分別可達95.6% 和87.6%，明顯高于在有機溶劑體系中的酯化率。

香茅醇酯 脂肪酶 固定化 無溶劑 酶催化

香茅醇是一種具有新鮮玫瑰香氣的萜烯醇，其脂肪酸酯也是重要的風(fēng)味和芳香化合物，廣泛應(yīng)用于食品、飲料、化妝品及醫(yī)藥行業(yè)［1，2］。目前化學(xué)合成香料以其經(jīng)濟性和周期短等特點占據(jù)著較大的市場空間，但隨著生活水平的提高，人們對天然高品質(zhì)香料的興趣逐漸增強，從自然界中提取已不能滿足日益增長的消費需求，而生物法合成的香料被視為天然香料，其比化學(xué)法合成的香料更能滿足消費者心理需求，因此生物法生產(chǎn)香料受到越來越多的關(guān)注。酶法合成香茅醇酯具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物純度高和環(huán)境污染小等優(yōu)點。上世紀(jì)90年代，已有關(guān)于有機溶劑中游離脂肪酶催化合成萜烯醇酯的報道［3］，但游離酶在有機溶劑中分散性較差且不易回收利用，因而在隨后的研究中逐漸被Novozyme 435和Lipozyme MML等固定化酶所取代［4，5］。Claon等［6］使用固定化脂肪酶SP435在正己烷中通過轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)催化合成短鏈乙酸香茅酯，獲得98%的酯化率，目前其他長鏈香茅酯的合成也多在有機相中進行［7，8］。除了傳統(tǒng)有機相體系，超臨界二氧化碳因與己烷等溶劑極性相近［9］，具有類似氣體的擴散性及液體的溶解能力，同時兼具低黏度和低表面張力的特性也迅速被用作酶催化反應(yīng)的介質(zhì)。曾健青等［9］利用Lipozyme IM在超臨界CO2中催化油酸甲酯與香茅醇轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)合成油酸香茅酯，實現(xiàn)酶促反應(yīng)與分離一體化過程。近年來，離子液體的出現(xiàn)也為酶催化反應(yīng)提供了新的發(fā)展契機，Lozano等［10］使用離子液體對Novozym 435進行包裹，提高了其催化合成丁酸香茅酯的反應(yīng)速率。盡管在以上反應(yīng)體系中香茅醇酯化率均比較高，但是有機溶劑的毒性與揮發(fā)性、離子液體復(fù)雜的制備過程以及超臨界流體對反應(yīng)設(shè)備的苛刻要求均制約了香茅醇酯的規(guī)模化制造，故發(fā)展更為環(huán)境友好的新型香茅醇酯制備反應(yīng)體系顯得尤為重要。

無溶劑體系中以低熔點反應(yīng)物為反應(yīng)溶劑，使酶直接作用于底物，加快了反應(yīng)速率，且克服了有機溶劑毒性大、易燃易揮發(fā)、對環(huán)境造成污染及回收和循環(huán)使用成本高等缺點［11］，是酶工程領(lǐng)域中具有良好發(fā)展?jié)摿Φ男滦头磻?yīng)體系。目前有關(guān)無溶劑體系中香茅酯合成的報道極少［10］，通常需要使用昂貴的脂肪酸乙烯酯為酰基供體，酶種類單一，且未見使用褶皺假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase，CRL）在無溶劑體系中催化合成香茅酯的報道。本工作以大孔樹脂吸附固定的褶皺假絲酵母脂肪酶為催化劑，在無溶劑體系中采用脂肪酸作為?；w，以提高酶法合成香茅酯酯化率為目標(biāo)，建立綠色環(huán)保的香茅酯酶法制備工藝。

1 實驗部分

1.1 固定化脂肪酶的制備

按照供應(yīng)商提供的方法對載體大孔樹脂NKA （購自南開大學(xué)化工廠）進行預(yù)處理。將適量褶皺假絲酵母脂肪酶（購自Sigma公司）溶解在pH值為5.0的磷酸鹽緩沖液中，4 ℃下攪拌30 min，配制成4 mg/mL的粗酶溶液（實際蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%～3.0%），經(jīng)4 ℃下10 000 r /min離心5 min以去除不溶物，取5 mL上清液與0.1 g上述載體混合。30 ℃吸附2h后，用砂芯漏斗抽濾，提取固定化酶，并用5 mL pH值為5.0的緩沖液沖洗固定化酶數(shù)次。用少量pH值為7.0 的磷酸鹽緩沖液浸泡固定化酶20 min后再次抽濾，將固定化酶于30 ℃真空干燥48h，利用酶的“pH記憶性”將脂肪酶的構(gòu)象調(diào)至最適宜催化的狀態(tài)。固定化酶蛋白回收率為80%，測得干燥后的酶活為10 U/g。

1.2 脂肪酶活性的測定

以對硝基苯基乙酸酯（p-NPA）為底物，采用比色法測定游離和固定化脂肪酶的水解活性［12］。在37 ℃，pH值為7.0的條件下，1 min內(nèi)水解產(chǎn)生1 μmol p-NPA所需要的酶量定義為一個活力單位（U）。

1.3 香茅醇酯的酶法合成

10 mL具塞錐形瓶中加入2 mmol脂肪酸與2 mmol β-香茅醇（純度大于99.8%），放入恒溫空氣搖床預(yù)熱后，加入干燥后的固定化脂肪酶，混勻后添加4 μL去離子水，于恒溫搖床中反應(yīng)2h后，加入0.5 g的4A分子篩以去除反應(yīng)生成的過量水。在不同的反應(yīng)條件（搖床轉(zhuǎn)速、溫度、底物比例和酶用量等）下進行實驗。

1.4 酯化率的測定

對反應(yīng)體系分析可知主要成分為香茅酯、游離脂肪酸及β-香茅醇的混合物。采用Agilent 6890氣相色譜儀進行反應(yīng)底物和產(chǎn)物定量分析，色譜條件如下：載氣為N2；檢測器為FID，210 ℃；氣化室220 ℃；色譜柱為PEG-20M（15 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱室溫度50 ℃，維持2 min，以20 ℃/min升溫至200 ℃并維持3 min。通過內(nèi)標(biāo)法計算香茅醇的含量。香茅醇的酯化率通過測定反應(yīng)前后反應(yīng)體系中香茅醇的濃度變化換算而得。

2 結(jié)果與討論

2.1 ?；w對香茅醇酯化反應(yīng)的影響

向10 mL反應(yīng)瓶中各加入2 mmol脂肪酸與香茅醇，以0.5 U（約0.05 g）干燥后的固定化CRL為催化劑，在無溶劑體系中進行香茅醇酯的合成反應(yīng)，采用的脂肪酸分別為乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸和油酸。由于月桂酸熔點為 44～46 ℃，癸酸的熔點為 31.5 ℃，為了保證不同脂肪酸體系都為均一液態(tài)體系，所以選擇無溶劑體系反應(yīng)溫度為50 ℃，考察固定化CRL對脂肪酸的選擇性，并探討建立無溶劑反應(yīng)體系的可行性。在搖床轉(zhuǎn)速200 r/min下反應(yīng)24h，結(jié)果如圖1所示。由圖可看出，乙酸和己酸在無溶劑體系中的酯化率均很低，主要是由于CRL對這兩種酸的選擇性較差所致［13］。丁酸的極性較強，催化過程中可能會剝奪CRL的“必需水”，因此酯化率也較低。辛酸、癸酸、月桂酸及油酸在無溶劑體系的酯化率分別可達70.12%，63.15%，95.56%和87.56%。其中月桂酸香茅酯酯化率最高，這可能是由于月桂酸與香茅醇等摩爾混合后體系的疏水參數(shù)（lgPm）接近于 4（lgP = x1lgP1+x2lgP2，其中x1和x2分別代表體系中兩種物質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)，P1和P2分別代表兩種物質(zhì)的疏水參數(shù)。乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸和油酸的lgP分別為2.78，2.03，2.59，3.12，3.64，4.17和5.52），能為脂肪酶提供適宜的催化環(huán)境［14］，且CRL對較長碳鏈的脂肪酸選擇性較高所致。

圖1　不同脂肪酸對CRL催化合成香茅酯的影響Fig.1 Effect of different aliphatic acids on the synthesis of citronellyl ester catalyzed by CRL

圖2　不同?；w對CRL催化合成月桂酸香茅酯的影響Fig.2 Effect of different acyl donors on the synthesis of citronellyl laurate ester catalyzed by CRL

以月桂酸香茅酯合成為例，比較月桂酸、月桂酸甲酯及乙酯以及月桂酸乙烯酯（活性酯）幾類常用的酰基供體的作用效果，結(jié)果如圖2所示。由圖可看出，以月桂酸及月桂酸乙烯酯作為?；w時獲得的酯化率較高，以月桂酸甲酯和月桂酸乙酯為?；w時，無溶劑體系中香茅醇的酯化率均低于30%。故以下研究中選擇月桂酸作為?；w。

2.2 轉(zhuǎn)速對香茅醇酯化反應(yīng)的影響

搖床轉(zhuǎn)速關(guān)系到反應(yīng)體系中底物的傳質(zhì)，選擇合適的轉(zhuǎn)速既可達到所需的傳質(zhì)效果，又可節(jié)約能耗，故在無溶劑體系中考察了搖床轉(zhuǎn)速對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖可看出，當(dāng)無溶劑體系中搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時混合傳質(zhì)效果較好，酯化率較高，這是因為無溶劑體系粘度較高，需要克服的傳質(zhì)阻力較大所致。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達到240 r/min時，酯轉(zhuǎn)化率略有降低。故200 r/min的轉(zhuǎn)速已經(jīng)可以滿足體系反應(yīng)要求。

圖3　搖床轉(zhuǎn)速對CRL催化合成月桂酸香茅酯的影響Fig.3 Effect of agitation speed on the synthesis of citronellyl laurate ester catalyzed by CRL

圖4　溫度對CRL催化合成月桂酸香茅酯的影響Fig.4 Effect of temperature on the synthesis of citronellyl laurate ester catalyzed by CRL

2.3溫度對香茅醇酯化反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度既能影響酶催化反應(yīng)速率和脂肪酶的活性，也可以影響傳質(zhì)，反應(yīng)溫度對CRL催化合成月桂酸香茅酯的影響見圖4。由圖可看出，當(dāng)溫度為50或60 ℃時，該體系才具有較高的酯化率，這是因為在低于月桂酸熔點的溫度下，月桂酸以固體形式存在并伴隨反應(yīng)的進行不斷減少，在50或60 ℃時月桂酸以熔化形式存在，與香茅醇形成的均一液態(tài)反應(yīng)體系有利于增大底物與酶的碰撞幾率，從而使反應(yīng)速率加快。此外溫度的升高可使反應(yīng)體系粘度降低而提高酯化效果，但是70 ℃的反應(yīng)溫度會嚴(yán)重影響脂肪酶的活性并造成酯化率降低，所以確定反應(yīng)溫度為50 ℃。

2.4 底物比例對反應(yīng)的影響

通常底物比例可在一定程度上影響體系的最終轉(zhuǎn)化率，實驗考察了不同底物比例對月桂酸香茅酯酯化率的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖可知，該固定化脂肪酶無溶劑體系在酸醇物質(zhì)的量之比為1時即可獲得最高的酯化率，主要原因是無溶劑體系增加了底物濃度，酸或醇過量都可能對脂肪酶產(chǎn)生更為顯著的抑制作用，且在該體系中醇的抑制作用較酸更為顯著；此外，該結(jié)果的獲得與混合后反應(yīng)體系的lgPm值接近于4，能為脂肪酶催化酯化反應(yīng)提供適宜的疏水環(huán)境有關(guān)。

圖5　底物比例對CRL催化合成月桂酸香茅酯的影響Fig.5 Effect of molar ratio of substrate on the esterification of citronellyl laurate ester catalyzed by CRL

圖6　不同固定化酶量催化的酯化反應(yīng)進程曲線Fig.6 Process curves of esterification catalyzed by different amounts of immobilized lipase

2.5 固定化脂肪酶用量對香茅醇酯化反應(yīng)的影響

固定化脂肪酶用量對香茅醇酯化反應(yīng)的影響如圖6所示。由圖可看出，酶用量較少時，隨著酶用量的增加，反應(yīng)到達平衡所需時間不斷縮短，底物轉(zhuǎn)化率也不斷提高。當(dāng)加入酶活為625 U/L時，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率可達95%左右的峰值。酶量的增加對酯化率提高作用不大，但能明顯縮短反應(yīng)時間，當(dāng)酶用量為1 250 U/L時，達到95%的酯化率所需反應(yīng)時間可由24h縮短至10h，反應(yīng)效率提升顯著。

2.6 微量水添加量對香茅醇酯化反應(yīng)的影響

非水相催化過程中，一般認(rèn)為酶分子需要結(jié)合微量“必需水”以滿足活性構(gòu)象的變化要求，只有達到最佳水含量的要求時，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的動力學(xué)剛性和熱力學(xué)穩(wěn)定性之間才能達到最佳平衡點。為此考察了不同初始水添加量對固定化脂肪酶無溶劑體系合成月桂酸香茅酯的影響，結(jié)果如圖7所示。由圖可看出，初始水添加量對非水體系中的酶促反應(yīng)有一定影響，與正常情況下即不添加微量水（control）相比，當(dāng)初始水添加量為4或10 μL時，酯化率較高，在95%左右。繼續(xù)增加初始水添加量后，酯化率明顯降低，當(dāng)初始水添加量為50 μL時，酯化率降低至70%。在最適水添加量時，水分子主要充當(dāng)“分子潤滑劑”以維持酶的活性構(gòu)象，當(dāng)超過最適水添加量時，會促進酯的水解，且此時水化層厚度增加，而該反應(yīng)的底物與產(chǎn)物在水相中的溶解性均較差，較厚的水化層會增加底物與產(chǎn)物的擴散難度，導(dǎo)致最終轉(zhuǎn)化率下降。

圖 7 初始水添加量對酯化率的影響Fig.7 Effect of initial water addition on esterification of citronellyl laurate ester catalyzed by CRL

圖8　不同溶劑環(huán)境中的合成香茅醇酯結(jié)果Fig.8 CRL-catalyzed synthesis of citronellyl esters in organic solvent and solvent-free systems

2.7 有機溶劑及無溶劑體系中香茅醇酯合成結(jié)果比較

選擇月桂酸及油酸為酰基供體，分別在有機溶劑及無溶劑體系中進行香茅酯合成。在酸醇物質(zhì)的量比為1，加入5 mL有機溶劑（正己烷，正庚烷或異辛烷）與4 μL去離子水，酶濃度為1 250 U/L ，200 r/min，50 ℃反應(yīng)10h后，香茅醇酯化效果如圖8所示。由圖可看出，在無溶劑體系中，月桂酸香茅醇酯和油酸香茅醇酯的酯化率分別達到95.6%和87.6%，月桂酸香茅醇酯的酯化率高于Serri等［7］報道的89%，油酸香茅醇酯酯化率高于曾健青等［9］在超臨界CO2中獲得的66.14%，而在有機溶劑中月桂酸香茅醇酯和油酸香茅醇酯的酯化率最高只有81.3%和80.1%，故對于月桂酸及油酸等中長鏈脂肪酸香茅酯的酶法合成而言，無溶劑體系的酯化效果明顯優(yōu)于有機溶劑體系，這與無溶劑體系中脂肪酸與香茅醇混合后體系的 lgPm有關(guān)，也與無溶劑體系增大了底物濃度有關(guān)。而且分析表明，采用固定化CRL進行香茅酯合成時，對于與香茅醇混合后能給脂肪酶提供適宜疏水環(huán)境的中長鏈脂肪酸而言，無溶劑體系比有機溶劑體系更具優(yōu)勢，可獲得更高的酯化率，且可簡化后續(xù)分離提純過程。

3 結(jié) 論

以大孔樹脂NKA吸附固定的CRL為催化劑，構(gòu)建了無溶劑體系中香茅醇酯的綠色合成工藝。在底物物質(zhì)的量之比為1，添加酶濃度為1 250 U/L的固定化CRL和4 μL微量水的條件下，50 ℃，200 r/min反應(yīng)10h，月桂酸香茅酯酯化率可達95.6%，油酸香茅酯酯化率達87.6%，香茅醇酯的酯化率均高于有機溶劑體系中酯化率，表明本工作構(gòu)建的無溶劑體系尤其適合于中長鏈脂肪酸香茅酯的酶法合成，且該反應(yīng)體系具有條件溫和、無溶劑揮發(fā)和產(chǎn)物更易分離提取等優(yōu)勢，是一條環(huán)境友好的酶法合成工藝，為優(yōu)質(zhì)萜烯酯香料的高效制備與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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200 r/min， reaction temperature 50 ℃， the concentration of immobilized lipase 1 250 U/L， the addition of water 4 μL， citronellyl laurate and citronellyl oleate were achieved with esterification rate of 95.6% and 87.6%， respectively， after 10h of reaction， which was more superior than that in organic solvent system.

Synthesis of Citronellyl Esters Catalyzed by Immobilized Lipase in Solvent-Free System

Yu Min， Zhouhua， Ren Liwei， Jiang Zhenhua， Wei Ping
College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering， Nanjing Tech University， Nanjing 211800， China

The enzymatic synthesis of citronellyl esters by esterification of citronellol and fatty acids in a solvent-free system was discussed using Candida rugosa lipase （CRL） absorbed on macroporous resin NKA as catalyst. The conditions of enzymatic synthesis of citronellyl esters was optimized， including the selectivity of acyl donor， reaction temperature， enzyme dosage， molar ratio of substrate and micro-water addition. The results showed that under the conditions of molar ratio of acid to alcohol 1， agitation speed

citronellyl esters； lipase； immobilization； solvent-free； enzyme catalysis

Q814.9

A

1001—7631 （ 2015 ） 04—0373—06

2014-11-20；

2015-05-28。

于 敏（1991—），女，碩士研究生；周 華（1970—），男，教授，通訊聯(lián)系人。E-mail: zhouhua@njtech.edu.cn。

國家重點基礎(chǔ)研究計劃（973）項目（2009CB724706）。