李玉山，陳河濤，楊夕陽，王全先，劉軍杰，王琳凱，蘇彥華，孫 琳

鄭州大學第三附屬醫(yī)院人類精子庫鄭州450052

(2015-01-24收稿 責任編輯 王 曼)

不孕不育是全球性的生殖健康難題，影響了全世界約15%的夫婦［1］。75%的不育患者原因不明，屬于特發(fā)性［2］。臨床研究［3］表明，超過80%的不育患者存在精子運動缺陷，其中19%為特發(fā)性弱精子癥。弱精子癥發(fā)病機制多種多樣，其中引起精子活力低下的常見原因有精液液化異常、精索靜脈曲張、自身免疫因素、吸煙、飲酒等。為進一步闡明弱精子癥的發(fā)病機制，作者所在課題組前期進行了一系列基因水平的相關研究。目前已有超過300個精子相關基因被證實與不孕不育發(fā)病有關，如精子鞭毛基因 sept4［4］、tcte3［5］和 catsper1［6］。Tektins(簡 稱TEKT)是一個富含coiled-coil結構域的微管蛋白家族，結構高度保守，目前包含TEKT1～5等5個家族成員，是精子鞭毛軸絲及其附屬結構的重要組成部分［7］。TEKT3定位于精子線粒體膜表面和鞭毛中段外周致密纖維［8］。tekt3基因敲除小鼠精子前向運動能力顯著降低且精子尾部結構缺陷增加，表明TEKT3的表達缺失可能引起精子運動能力降低，進而導致弱精子癥的發(fā)生［9］。劉利敏［10］通過構建mRNA差異表達譜，發(fā)現(xiàn)弱精子癥精子TEKT3 mRNA表達水平下調。然而目前尚缺少TEKT3在人類弱精子癥患者精子中表達的研究。該研究采用RTPCR和Western blot方法，檢測TEKT3 mRNA和蛋白在正常男性和特發(fā)性弱精子癥患者精子中的表達水平，探討特發(fā)性弱精子癥的發(fā)生機制，為深入了解特發(fā)性弱精子癥提供理論基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2014年6月至10月就診于鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖中心男科門診的35例弱精子癥患者(年齡23～39歲)和35份同期河南省人類精子庫健康體檢合格供精者(年齡20～40歲)的精液標本。研究對象符合以下標準:①無傳染病史。②無性功能障礙，無精索靜脈曲張、附睪炎。③無家族遺傳病史。④肝腎功能正常，內分泌各項激素檢查正常。⑤排除少精子癥、無精子癥、畸形精子癥患者。該研究獲得鄭州大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象簽訂知情同意書。

1.2 精液檢測 受試者禁欲3～7 d，采用手淫方式收集精液于廣口干燥無菌取精杯中，精液經(jīng)37℃水浴30 min液化完全。嚴格按照第五版《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》進行分析，排除精液量、液化時間、pH、酸性磷酸酶、精漿果糖、α葡萄糖苷酶、精子形態(tài)等參數(shù)異常的精液樣本。精液標本涂片后自然干燥，95%乙醇和乙醚固定10 min，光學顯微鏡下選擇涂片上多個區(qū)域進行精子形態(tài)評估，每片計數(shù)200個精子，計算正常形態(tài)精子百分率。計算機輔助精液分析系統(tǒng)(北京偉力新世紀科技發(fā)展有限公司)連續(xù)3次檢測結果顯示，正常對照組精子濃度均≥20×106mL－1，精子前向運動能力≥32%;弱精子癥組精子濃度均≥20×106mL－1，精子前向運動能力≤32%。

1.3 精子的分離 采用完全液化的精液標本經(jīng)45%和90%Percoll分離液(美國Pharmacia公司)非連續(xù)密度梯度離心法分離精子。在15 mL離心管中加入體積比為1∶1的45%和90%Percoll分離液，隨后加入相同體積的精液標本，600 g條件下離心20 min。收集底部部分精子，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗滌 3次，將精子濃度調整為 50 ×106mL－1，－80℃保存。采用改良巴氏染色法觀察精子形態(tài)。

1.4 精子中TEKT3 mRNA的RT-PCR檢測 嚴格按照RNA提取試劑盒(北京康為世紀公司)操作說明書提取分離純化精子的總RNA，按照反轉錄試劑盒(美國Thermo公司)操作說明，每樣本取等量總RNA 10μL進行反轉錄，合成cDNA，取cDNA 3 μL作為模板，按照PCR試劑盒(TaKaRa公司)操作說明在25μL反應體系中進行擴增。引物用Primer Premier 5.0軟件設計，由北京鼎國生物公司合成。TEKT3上游引物序列為5'-CTCAGGCAGACACAAC CCAA-3'，下 游 為 5'-GATCCGGTAAGCCGTCTGTT-3'，產(chǎn)物 389 bp;內參上游引物序列為 5'-CGG GAAATCGTGCGTGAC-3'，下 游 為 5'-TGGAAGGTG GACAGCGAGG-3'，產(chǎn)物434 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，圖像掃描儀掃描，用Image J軟件進行分析。

1.5 精子中TEKT3蛋白的Western blot檢測取分離純化后的精子，37℃水浴解凍，加入一定量4℃預冷的0.01 mol/L PBS(pH 7.4)，4 ℃ 3 000 g 離心5 min，棄去上清，在離心管中加入100μL細胞裂解液RIPA和1μL蛋白酶抑制劑PMSF(北京索萊寶科技有限公司)，充分吹打，冰上裂解30 min，進一步超聲裂解10 s×5次，低溫高速離心機4℃12 000 g離心10 min，吸取上清液(即精子總蛋白)，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海BestBio公司)檢測總蛋白濃度。取30μg等量總蛋白上樣，100 g/L SDS-PAGE凝膠電泳(80 V 30 min，120 V 120 min)，半干法(20 V 120 min)轉移至醋酸纖維素膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，3次洗滌后與1∶600稀釋的一抗(鼠抗人TEKT3抗體，臺灣Abnova公司)37℃孵育1 h，TBST洗膜5次，10 min/次;再用1∶2 500稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗(兔抗鼠IgG，北京鼎國生物公司)室溫孵育1 h，然后TBST洗滌3～5次，5 min/次。以β-actin為內參。處理后的醋酸纖維素膜經(jīng)Odyssey Clx雙紅外熒光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)掃描，用Image Studio軟件獲取圖像并進行處理。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0進行分析。兩組精液基本參數(shù)、TEKT3 mRNA和蛋白表達水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗，采用Pearson相關系數(shù)來描述TEKT3表達與前向運動精子率的相關性。檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 兩組精液基本參數(shù)的比較 正常對照組與弱精子癥組年齡和精液量、pH值、精子濃度等參數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義，但弱精子癥組前向運動精子率低于正常對照組。見表1。

表1 兩組精液基本參數(shù)的比較

2.2 正常對照組與弱精子癥組精子形態(tài)學比較見圖1。正常對照組正常形態(tài)精子百分率為(25.42±5.26)%;弱精子癥患者精子形態(tài)發(fā)生變化，精子尾部畸形、缺陷增加，其正常形態(tài)精子百分率為(7.21 ±2.45)%，低于正常對照組(t=18.528，P ＜0.001)。

圖1 正常對照組(A)與弱精子癥組(B)精子形態(tài)學表現(xiàn)(×400)

2.3 正常對照組和弱精子癥組TEKT3 mRNA和蛋白表達的比較 與正常對照組比較，弱精子癥組TEKT3 mRNA和蛋白的表達均降低，見圖2、3和表2。

圖2 正常對照組和弱精子癥組TEKT3 mRNA的RT-PCR檢測M:Marker;A1、A2、A3:弱精子癥組;N1、N2:正常對照組。

圖3 正常對照組和弱精子癥組TEKT3蛋白的Western blot檢測A1、A2、A3:弱精子癥組;N1、N2、N3:正常對照組。

表2 兩組精子中TEKT3表達的比較

2.4 前向運動精子率與TEKT3 mRNA和蛋白表達的相關性分析 經(jīng)Pearson相關性分析，弱精子癥組前向運動精子率與精子TEKT3 mRNA表達水平(r=0.684，P=0.001)和 TEKT3 蛋白表達水平(r=0.483，P=0.013)均具有相關性。

3 討論

弱精子癥是引起男性不育的常見原因，其中精索靜脈曲張、睪丸炎、隱睪、附屬性腺感染等是弱精子癥常見的病因，然而多數(shù)的弱精子癥并不能明確其病因，被稱為特發(fā)性弱精子癥，特發(fā)性弱精子癥顯著的特征為精子活動力低下。

TEKT是精子鞭毛軸絲中與微管相關的蛋白家族［7］，最早發(fā)現(xiàn)于海膽精子鞭毛中［11］，哺乳動物中共有5種。TEKT3是TEKT家族中的一員，研究［8］表明從附睪尾部抽取的精子TEKT3可抵抗S-EDTA溶液的抽提，因此認為其存在于纖毛軸絲周圍。免疫熒光顯微技術和免疫電鏡結果顯示TEKT3主要存在于線粒體與中段外周致密纖維表面，此外還存在于精子頭部赤道段，由此推斷TEKT3不僅可作為精子鞭毛一部分參與鞭毛的穩(wěn)定性，與精子活力相關，還參與了精卵結合和頂體反應［12］。Roy 等［12］發(fā)現(xiàn)敲除小鼠tekt3基因后，小鼠產(chǎn)生的精子尾部缺陷率增加，精子活力顯著降低，但小鼠仍能夠繁殖后代，因此推測，tekt3基因敲除后小鼠產(chǎn)生的尾部缺陷精子仍具有完整的超活化能力。

人類tekt3基因位于17號染色體的短臂，包含9個外顯子，編碼含有490個氨基酸、相對分子質量為53 900的蛋白。成年雄性小鼠tekt3基因編碼一個1 700 bp的轉錄本。小鼠與人類的TEKT3有83.5%的同源序列，包括一個在所有TEKT家族中都含有的九肽結構［11］。纖毛蛋白質學研究［7］表明TEKT3與TEKT1、TEKT2可能是軸絲9+2結構的一部分，而TEKT5與TEKT3具有高度的相似性。

精子前向運動能力是精子與卵子結合形成受精卵的重要保障。哺乳動物精子的前向運動主要是靠尾部鞭毛擺動，而外周致密纖維和纖維鞘這兩種細胞骨架是精子尾部鞭毛擺動的主要物質基礎，精子尾部形態(tài)和結構的異?？梢鹁舆\動障礙和精子活力的改變。該研究結果顯示，TEKT3 mRNA和蛋白在正常對照組和特發(fā)性弱精子癥組精子中均表達，但特發(fā)性弱精子癥組精子TEKT3 mRNA和蛋白的表達水平較正常對照組明顯降低，并且前向運動精子率與TEKT3 mRNA和蛋白的表達均呈正相關;表明TEKT3是影響精子活力的重要因素，TEKT3的表達降低可能引起精子鞭毛的缺陷增加和穩(wěn)定性降低，影響精子前向運動能力，從而導致男性不育。

TEKT家族蛋白表達具有高度相似性，敲除tekt4基因的雄性小鼠產(chǎn)生的精子能量利用低效甚至無效，而同時敲除TEKT3基因和TEKT4基因的雄性子鼠的精子既有結構的缺陷又有能量利用的低效，雙重作用導致生育率的降低，然而仍能繁殖后代，表明TEKT家族其他的成員如TEKT1、TEKT2、TEKT5可能在功能上彌補了TEKT3和TEKT4雙重缺失所導致的缺陷［13］。因此同時檢測TEKT家族在精子中的表達，可能為闡明其在特發(fā)性弱精子癥中的作用機制提供更明確的指導。

綜上所述，TEKT3的表達水平與弱精子癥精子前向運動能力呈正相關，提示TEKT3可能成為弱精子癥發(fā)病機制研究的一個重要的靶標，TEKT3表達水平下降的機制及其與TEKT家族成員的相互作用值得進一步深入研究。

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