袁穎，冉小庫(kù)，徐煜彬，竇德強(qiáng)

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

·基礎(chǔ)研究·

牛蒡子炮制前后化學(xué)成分變化研究△

袁穎，冉小庫(kù)，徐煜彬，竇德強(qiáng)*

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

目的：比較牛蒡子炮制前后色譜指紋圖譜，對(duì)變化成分進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，進(jìn)一步對(duì)牛蒡子炮制機(jī)理進(jìn)行探討研究。方法：采用高效液相色譜法，建立牛蒡子的指紋圖譜，揭示其炮制后成分變化規(guī)律，采用系列硅膠、反相硅膠柱色譜、高效液相色譜，對(duì)變化成分進(jìn)行分離純化，結(jié)合NMR波譜學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，確定其結(jié)構(gòu)。結(jié)果：建立了牛蒡子生品與制品在296 nm波長(zhǎng)下的指紋圖譜，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)非木脂素類變化成分。分離并鑒定了兩個(gè)化合物，分別是3，5-二咖啡酰基奎寧酸和4，5-二咖啡酰基奎寧酸，二者含量在炮制前后存在顯著變化。結(jié)論：共分離得到兩個(gè)酚酸類物質(zhì)，并且二者為首次從牛蒡子果實(shí)中分離得到。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，由于牛蒡子在炮制過(guò)程中受溫度影響，其所含有的3，5-二咖啡?；鼘幩峥上?，5-二咖啡酰基奎寧酸轉(zhuǎn)化，從而使牛蒡子生品與制品在指紋圖譜上出現(xiàn)較大差異，本研究可以為牛蒡子的炮制機(jī)理及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供一定的理論依據(jù)。

牛蒡子；炮制；咖啡酰基奎寧酸；化學(xué)成分

牛蒡子為菊科植物牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果實(shí)，屬辛涼解表藥，具疏散風(fēng)熱、宣肺透疹、解毒利咽之功效。用于治療風(fēng)熱感冒、咳嗽痰多、麻疹、風(fēng)疹、咽喉腫痛、痄腮、丹毒、癰腫瘡毒等癥[1]，又名惡實(shí)、鼠粘子、黍粘子、大力子等，在我國(guó)分布廣泛，其中以浙江產(chǎn)“杜大力”和東北產(chǎn)“關(guān)大力”最為有名[2-3]。牛蒡子中主要含有木脂素類化合物，其中以牛蒡苷的含量最高，能達(dá)到藥材的5%，現(xiàn)代藥理研究表明牛蒡子具有抗病毒、抗菌、抗癌、抗糖尿病、免疫調(diào)節(jié)、利尿、抗氧化等作用[4-6]。牛蒡子中化學(xué)成分報(bào)道以木脂素類較多，而其他類成分鮮有報(bào)道。牛蒡子臨床用藥以炮制品居多，關(guān)于牛蒡子炮制的研究較多，但是炮制后化學(xué)成分變化情況并沒有很好地得以解釋，本研究通過(guò)結(jié)合中藥化學(xué)提取分離技術(shù)及核磁共振波譜解析技術(shù)以及高效液相指紋圖譜技術(shù)，對(duì)牛蒡子炮制后化學(xué)成分進(jìn)行研究，以期為牛蒡子質(zhì)量控制以及炮制機(jī)理提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(四元泵、在線脫氣、DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷侖科技有限公司)；AE系列電子分析天平：FA-1004電子天平(上海精科天平廠)；METTLER AB135-S十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士)。Burker-ARX-600型核磁共振光譜儀(德國(guó)Burker公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HITACHI LC-7100型高效液相色譜儀，UV-7400檢測(cè)器(日本日立公司)，YMC-C18色譜柱(ODS)(日本YMC公司，25 cm×9.4 mm，5 μm)，Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(ODS)(美國(guó)Agilent公司，150 mm×4.6mm，5 μm)；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A(國(guó)家藥典委員會(huì))。

1.2 材料

甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)，甲酸(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，優(yōu)級(jí)純)，水(娃哈哈純凈水)，其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)所用10批牛蒡子分別購(gòu)自全國(guó)各藥店，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)康廷國(guó)教授鑒定為ArctiumlappaL.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇(A)、0.25%磷酸水(B)，梯度洗脫，梯度程序見表1。流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：296 nm，進(jìn)樣體積：10 μL，所有組分色譜峰均在45 min內(nèi)流出完畢。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表

2.2 供試品溶液的制備

取不同產(chǎn)地牛蒡子生制牛蒡子粉末各5 g，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇約45 mL，超聲處理(功率150 W，頻率120 kHz)30 min，放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜的建立

共采集不同產(chǎn)地10批牛蒡子生品與制品色譜圖，將所得結(jié)果導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A(國(guó)家藥典委員會(huì))，得到公共指紋圖譜。見圖1～4。

圖1 10批牛蒡子生品匹配前色譜圖

圖2 10批牛蒡子制品匹配前色譜圖

圖3 10批牛蒡子生品公共指紋圖譜

圖4 10批牛蒡子制品公共指紋圖譜

2.4 結(jié)果

10批牛蒡子生品及制品的指紋圖譜與各自公共指紋圖譜相似度均在0.9以上，說(shuō)明該方法穩(wěn)定可靠。通過(guò)生品與制品公共指紋圖譜的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在296 nm波長(zhǎng)下，10號(hào)和12號(hào)色譜峰含量變化顯著，其中10號(hào)峰物質(zhì)含量明顯下降，12號(hào)峰物質(zhì)含量顯著提高。牛蒡子中主要含牛蒡子苷等木脂素類成分，木脂素類成分的紫外吸收?qǐng)D如圖5所示，而10、12號(hào)色譜峰的紫外吸收?qǐng)D經(jīng)DAD檢測(cè)器查看得圖6，發(fā)現(xiàn)其并非為木脂素類成分，究竟為何物質(zhì)，未曾有人揭示，因此筆者對(duì)10、12號(hào)峰進(jìn)行了系統(tǒng)分離鑒定研究。

圖5 牛蒡子中木脂素類成分紫外吸收?qǐng)D

圖6 10、12號(hào)色譜峰紫外吸收?qǐng)D

2.5 色譜峰10和12的化學(xué)成分研究

2.5.1 提取和分離 干燥的制牛蒡子3 kg，粉碎成粗粉，8倍量乙醇回流提取2次，每次提取2 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇至無(wú)醇味，加水形成懸浮液，分別用等體積的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分取有機(jī)相，得石油醚浸膏72 g，三氯甲烷浸膏200 g，乙酸乙酯浸膏20 g，正丁醇浸膏 60 g。

取正丁醇浸膏用二氯甲烷-甲醇溶解，加入100～200目硅膠120 g拌勻，揮干溶劑。稱取200～300目硅膠1000 g，加二氯甲烷浸泡，使其充分溶脹，裝柱，待硅膠沉降完全，上樣。以二氯甲烷-甲醇(100∶10～0∶100)進(jìn)行梯度洗脫，每250 mL為1個(gè)流分，共收集50個(gè)流分。TLC檢識(shí)，合并相似者。1～15合并為成分Ⅰ，16～28合并為成分Ⅱ，29～38合并為成分Ⅲ，39～42合并為成分Ⅳ，43～50合并為成分Ⅴ。

將成分Ⅱ經(jīng)反相硅膠開放柱色譜分離，甲醇-水(20∶80，80∶20，100∶0)為洗脫劑洗脫，相同梯度洗脫液合并，共收集3部分，分別標(biāo)記為Fr2-1，F(xiàn)r2-2，F(xiàn)r2-3。Fr2-2采用高效液相色譜法分離，以甲醇-0.05%甲酸水(46∶54)為流動(dòng)相，320 nm波長(zhǎng)下檢識(shí)，得到純品化合物1(30 mg)。

將成分Ⅲ經(jīng)反相硅膠開放柱柱色譜分離，甲醇-水(20∶80，80∶20，100∶0)為洗脫劑洗脫，相同梯度洗脫液合并，共收集3部分，分別標(biāo)記為Fr3-1，F(xiàn)r3-2，F(xiàn)r3-3。Fr3-2采用高效液相色譜法分離，以甲醇-0.05%甲酸水(43∶57)為流動(dòng)相，320 nm波長(zhǎng)下檢識(shí)，得到純品化合物2(35 mg)。

表2 3，5-二咖啡?；鼘幩岷舜艛?shù)據(jù)(13C 125 MHz，1H 500 MHz，CD3OD)

圖7 3，5-二咖啡酰基奎寧酸(3，5-dicaffeoyl quinic acid)

圖8 4，5-二咖啡?；鼘幩?4，5-dicaffeoyl quinic acid)

化合物2文獻(xiàn)[7]序號(hào)δCδH序號(hào)δCδH175.90176.05238.422.23(2H,m)238.372.23(2H,m)369.034.37(1H,m)368.974.37(1H,m)475.905.11(1H,dd,8.5,3.0Hz)475.735.11(1H,dd,9.0,3.0Hz)569.515.63(1H,brs)569.345.61(1H,ddd,4.5,9.2,9.4Hz)639.522.30(1H,m)638.372.30(1H,m)2.10(1H,m)2.10(1H,dd,4.0,14.2Hz)7178.537176.801'127.731'127.70127.67127.642'115.217.01(1H,d,2.0Hz)2'115.197.01(1H,d,2.0Hz)116.417.00(1H,d,2.0Hz)115.197.00(1H,d,2.0Hz)3'146.753'146.73147.56146.734'149.644'149.64149.64149.645'116.496.74(1H,d,8.0Hz)5'116.476.74(1H,d,8.0Hz)116.496.73(1H,d,8.2Hz)116.476.73(1H,d,8.2Hz)6'123.126.90(1H,dd,2.0,8.0Hz)6'123.136.90(1H,dd,2.0,8.0Hz)123.126.90(1H,dd,2.0,8.0Hz)123.136.90(1H,dd,2.0,8.0Hz)7'147.697.59(1H,d,15.9Hz)7'147.407.59(1H,d,15.9Hz)147.567.51(1H,d,15.9Hz)7.51(1H,d,15.9Hz)8'114.756.28(1H,d,15.9Hz)8'114.736.28(1H,d,15.9Hz)114.786.18(1H,d,15.9Hz)6.18(1H,d,15.9Hz)9'168.569'168.55168.27168.22

2.5.3 色譜峰10和12的鑒定 將分離得到的化合物1和2取適量，加甲醇溶解，照2.1項(xiàng)下色譜條件，分別注入高效液相色譜儀，在色譜峰10和12保留時(shí)間處，分別出現(xiàn)相同色譜峰，且二者紫外吸收?qǐng)D與圖6相同，故確定色譜峰10為3，5-二咖啡?；鼘幩?，色譜峰12為4，5-二咖啡?；鼘幩?，二者為牛蒡子炮制后在296 nm波長(zhǎng)下主要變化成分。

3 討論

通過(guò)建立牛蒡子生品與制品的指紋圖譜，揭示了生品與制品化學(xué)成分變化規(guī)律，牛蒡子經(jīng)炮制后，部分小色譜峰消失，同時(shí)增加部分小色譜峰，但是其含量很低。但在波長(zhǎng)為296 nm下，筆者發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)非木脂素類成分，其含量變化顯著，二者的紫外吸收光譜相同，且二者明顯存在此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)。最終，筆者通過(guò)運(yùn)用中藥化學(xué)相關(guān)技術(shù)與方法，將二者分離開來(lái)，并運(yùn)用波譜學(xué)方法，確定二者化合物的結(jié)構(gòu)為咖啡?；鼘幩犷惢衔?。同時(shí)經(jīng)高效液相色譜法驗(yàn)證，指紋圖譜中色譜峰10為3，5-二咖啡酰基奎寧酸，色譜峰12為4，5-二咖啡酰基奎寧酸。牛蒡子在炮制過(guò)程中，由于受溫度影響，3，5-二咖啡?；鼘幩峥梢赞D(zhuǎn)化成立體結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定的4，5-二咖啡?；鼘幩?。

咖啡?；鼘幩崾且活愑煽鼘幩崤c數(shù)目不等的咖啡酸通過(guò)酯化反應(yīng)縮合而成的酚酸類天然成分，廣泛存在于植物界如金銀花、旋覆花、蒼耳等中藥及茶葉、山楂等果樹中。而這類植物往往與牛蒡子一樣具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒的作用，其可能與植物中所含有的咖啡?；鼘幩峄蚓G原酸等酚酸類成分有關(guān)，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)二咖啡?；鼘幩峋哂泻芎玫目寡趸?、抗炎、抗病毒、抗纖維化、抑制平滑肌收縮、降血脂等諸多作用[8]。筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牛蒡子中含有一些二咖啡?；鼘幩犷惓煞?，其可能為牛蒡子疏散風(fēng)熱、解毒利咽的有效成分。通過(guò)本研究所得結(jié)論，可以為牛蒡子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及炮制規(guī)范研究提供理論依據(jù)，為牛蒡子更好地應(yīng)用于臨床及新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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Studies on Change of Chemical Constitunetsin Arctii Fructus after Processing

YUAN Ying，RAN Xiaoku，XU Yubin，DOU Deqiang*

(College of pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China)

Objective：To isolate and elucidate the altered constituents in Arctii Fructus after processing by comparing the variations of their fingerprints，and clarify the mechanism of processing.Methods：The fingerprints were established with HPLC，and a series of column chromatography were applied to obtain the compounds，and their structureswere elucidated by NMR.Results：Two phenolic acids were isolated and elucidated as 3，5-dicaffeoyl quinic acid，4，5-dicaffeoyl quinic acid，and their contents changed significantly after processing.Conclusion：Two phenolic acids were isolated，and both of them were isolated from this drug for the first time.and we also found that the 3，5-dicaffeoyl quinic acid can transform to 4，5-dicaffeoyl quinic acid，during the processing procedure，it may be caused by heat，and the spatial conformation of 4，5-dicaffeoyl quinic acid may be much more stable than 3，5-dicaffeoyl quinic acid，this research can provide theory evidence for the mechanism of processing.

Arctii Fructus；processing；caffeoylquinic acid；chemical components

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.8.007

2015-01-30)

遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)課題(LT2013020)

*

竇德強(qiáng)，教授，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及新藥開發(fā)；Tel：(0411)85890143，E-mail：deqiangdou@126.com