蓮霧果實高質(zhì)量總RNA提取方法的建立

尹珍珍，吳光斌，陳發(fā)河，*，謝潮添

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021）

蓮霧果實高質(zhì)量總RNA提取方法的建立

尹珍珍1，吳光斌1，陳發(fā)河1，*，謝潮添2

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021）

為從蓮霧果實中提取高質(zhì)量RNA，以“黑珍珠”蓮霧果實為材料，采用試劑盒法、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法、改良CTAB法和Trizol法5 種總RNA提取方法進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，SDS法得到的總RNA質(zhì)量較差，有嚴(yán)重的降解和DNA污染；Trizol法提取物中有較多蛋白和多糖等殘留，無條帶出現(xiàn)。CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法均能獲得質(zhì)量較好的蓮霧果實總RNA，經(jīng)實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗證得到條帶與目的片段大小一致，表明該RNA均能滿足后續(xù)分子生物學(xué)研究。

蓮霧果實；RNA提??；多糖；多酚；方法

從不同植物組織和器官中提取完整性好、高純度的RNA是進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建、Northern分析實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantificational real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）和新一代測序（如RNA-seq）等許多分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提。由于不同組織結(jié)構(gòu)與所含成分的差異，其RNA最適提取方法也不盡相同［1］。尤其對于富含蛋白質(zhì)、多糖多酚類物質(zhì)的植物果實組織，且核糖核酸酶（RNase）水平較高，這些因素作用下難以從果實中獲得高質(zhì)量RNA［2-4］。目前已有通過研究改進(jìn)不同的提取方法，成功從獼猴桃［5］、葡萄［6-9］、蘋果［6，10］、香蕉［11］、菠蘿［12］、枇杷［13-14］、越橘［15-16］、李［17］和番茄［18］等果實中提取得到高質(zhì)量RNA的報道。蓮霧（Syzygium samarangense Merr. et Perry）是熱帶、南亞熱帶地區(qū)重要珍稀果樹之一，其果實風(fēng)味獨特，富含蛋白質(zhì)、VC、糖類、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，具有除痰、潤肺、止咳、涼血等功效，深受大眾喜愛。而目前以蓮霧果實為材料進(jìn)行高質(zhì)量RNA提取的方法目前未見有報道。

本研究以成熟蓮霧果實為材料，采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法、改良CTAB法、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法、Trizol法和適合多糖多酚植物RNA提取試劑盒法提取蓮霧果實組織總RNA，探索和建立最適宜蓮霧果實總RNA的提取方法，為蓮霧分子生物學(xué)研究的開展提供基本的技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

臺灣“黑珍珠”蓮霧（Syzygium samarangense Merr. et Perry）果實 廈門臺灣水果集散中心。

二乙基焦碳酸酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）北京索萊寶科技有限公司；Plant RNA Kit RNA提取試劑盒 美國Omega公司；十六烷基三甲基溴化銨、氯化鋰、氯仿（均為分析純） 上海浩然生物技術(shù)有限公司；TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒KR104、2×Taq PCR MasterMix KT201 天根生化科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

5417R臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Nanodrop ND-1000分光光度計 凱樂博（北京）科技發(fā)展有限公司；ULT386-3-V40超低溫冰箱 美國Thermo Electron公司；AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺蘇州凈化醫(yī)療設(shè)備有限公司；YXQ.SG41.280壓力蒸汽滅菌鍋 佛山順德格蘭仕微波爐電器有限公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器公司。

1.3方法

1.3.1試劑盒法提取總RNA

參照Omega公司的E.Z.N.A plant RNA Kit試劑盒使用說明提取RNA。

1.3.2 CTAB法提取總RNA

取0.5 g新鮮蓮霧果肉放入預(yù)冷的研缽中，加入2%聚乙烯砒咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），用液氮快速研磨至粉末，快速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的2 mL離心管中，再加入1 mL 3% CTAB提取液，同時加入2% β-巰基乙醇和20 μL 4 mg/mL蛋白酶K溶液，充分混勻；置65 ℃水浴30min，期間每 5 min振搖1 次。4 ℃、10 000×g離心10 min；取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇溶液（體積比24∶1），混勻后于4 ℃、12 000×g離心15min。取上清液加入1/3體積10 mol/L LiCl溶液，混勻后于－20 ℃條件下沉淀過夜。4 ℃、12 000×g離心30 min，棄上清液，用200 μL 2 mol/L LiCl溶液充分懸浮沉淀，4 ℃、12 000×g離心20 min，棄上清液，重復(fù)1 次。用200 μL 10 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5）在室溫條件下充分懸浮沉淀，加入20 μL 體積 3 mol/L KAc溶液（pH 5.5），冰浴20 min。4 ℃、12 000×g離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液于新1.5 mL管中，加入500 μL預(yù)冷的無水乙醇，－70 ℃放置 2～3 h。 4 ℃、12 000×g離心20 min，棄上清液，加入1 mL 75%乙醇溶液洗滌2次，室溫晾干，用適量DEPC水溶解并置于－70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3改良CTAB法提取總RNA

取0.5 g新鮮蓮霧果肉，先擠干水分放入預(yù)冷的研缽中，加入2% PVP，用液氮快速研磨至粉末，迅速轉(zhuǎn)入含有1 mL 75%乙醇溶液和2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）β-巰基乙醇溶液的2 mL離心管中，混勻，4 ℃、10 000×g離心10 min，棄去上清液，重復(fù)1 次。加入1 mL 3% CTAB提取液，后續(xù)方法同1.3.2節(jié)CTAB法。

1.3.4 SDS法提取總RNA

取0.5 g新鮮果肉擠干水分于液氮中速凍，研磨成粉，迅速置于盛有1 mL SDS緩沖液的離心管中，于65 ℃水浴30 min，不時顛倒混勻。在離心管加入0.4 mL 3 mol/L KAc溶液（pH 5.5），混勻，冰浴20 min，4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清液。加入等體積氯仿-異戊醇溶液（24∶1，V/V），輕輕顛倒混勻，4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液。加入1/2體積的冰異丙醇溶液，輕輕顛倒混勻（見絲狀沉淀），于 －20 ℃沉淀30 min。4 ℃、12 000×g離心10 min，棄上清液。加入75%乙醇溶液洗滌2 次，室溫晾干，用適量DEPC水溶解并置于－70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 Trizol法提取總RNA

取0.5 g新鮮果肉擠干水分于液氮中速凍，研磨成粉，快速轉(zhuǎn)入盛有1 mL Trizol的離心管中，旋渦振蕩充分混勻。加入約1/5體積的氯仿，旋渦混勻約15 s，室溫靜置5 min，于4 ℃、12 000×g離心20 min。取上清液，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置5 min，于4 ℃、12 000×g離心10 min。去上清液，加入200 μL 75%乙醇溶液洗滌2 次，室溫晾干，用30 μL DEPC水溶解并置于－70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6總RNA檢測

用Tris-硼酸電泳緩沖液（0.5×TBE）、1.0%瓊脂糖凝膠檢測RNA的純度及完整性。

紫外分光光度計測定A230nm、A260nm、A280nm值，A260nm∶A280nm、A260nm∶A230nm比值檢測RNA純度。計算樣品總RNA提取量（μg/g）。

1.3.7 RT-PCR分析

參照馬六甲蒲桃β-actin部分序列（登錄號：ADB43594.1）和過氧化物酶（peroxidase，POD）（登錄號：ACJ11762.1），并委托上海英濰公司合成。其中β-actin上游引物FP：5'-CCATTCAGGCTGTCCTTTCC-3'，下游引物RP：5'-AGCTTTTCCTTCATGTCCCT-3'，POD上游引物FP：5'-AGATTCCGTTGTTGCTTTAGGTG-3'，下游引物RP：5'-GGCATTGATGTTGTTCTCGTTG-3'。按照TIANScript RT Kit試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再根據(jù)2×Taq PCR MasterMix說明在PCR反應(yīng)管中調(diào)試反應(yīng)液和設(shè)置反應(yīng)條件。反應(yīng)結(jié)束后以1.0%瓊脂糖凝膠電泳，余下反應(yīng)液于－70 ℃保存。

2　結(jié)果與分析

2.1總RNA樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測

圖1　5種不同的方法提取蓮霧果實總RNA的電泳圖Fig.1　Electrophoretograms of total RNA extracted from wax apple fruit by five methods

圖1顯示，只有4 種方法可從蓮霧果實組織獲得一定量的總RNA，而不同提取方法獲得的RNA質(zhì)量又有明顯的差異。試劑盒法、CTAB法和改良CTAB法均能得到28S、18S和5S 3 條條帶，條帶清晰，無明顯拖尾現(xiàn)象，且28S條帶的亮度約為18S的2 倍，說明提取的總RNA完整性較好，純度較高。SDS法雖獲得的RNA產(chǎn)量較多，但RNA有明顯降解，且出現(xiàn)明顯的DNA污染痕跡；而Trizol法提取的RNA無條帶出現(xiàn)。

2.2總RNA樣品的純度和提取量

表1　不同方法提取蓮霧果實總RNA的吸光度比值和提取量Table1　Yields and absorbance ratios of total RNA extracted from wax apple fruit by different methods

對5 種方法提取的總RNA純度進(jìn)行分析，從表1可知，CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法的A260nm∶A280nm值均在1.8～2.1之間，A260nm∶A230nm值均在2.0～2.4之間，說明這3 種方法能有效去除蛋白質(zhì)、DNA、多糖多酚和次生代謝物等雜質(zhì)，所得RNA純度較高；SDS法雖然A260nm∶A280nm值均在1.8～2.0之間，但電泳檢測有DNA污染；而Trizol法的A260nm∶A280nm值低于1.8，A260nm∶A230nm值均低于0.9，說明含有較多的多糖等雜質(zhì)殘留。然而，從提取量來看，試劑盒法提取量最高，達(dá)到62.16 μg/g，且提取周期最短；改良CTAB法提取量也較高，可達(dá)36.09 μg/g；而CTAB法提取量則相對較低。

2.3RT-PCR電泳結(jié)果分析

圖2　總RNNAA的β-actin RT-PCR產(chǎn)物（A）和POD RT-PCR產(chǎn)物（BB）電泳圖Fig.2　Electrophoretograms of RT-PCR products of total RNA extracted by five different methods

將5 種方法提取的蓮霧果實RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一條鏈為模板做PCR擴(kuò)增。由圖2可知，CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法提取的蓮霧果實總RNA經(jīng)RT-PCR均得到與目的片段β-actin（245 bp）和POD（256 bp）大小一致的條帶，SDS法出現(xiàn)其他非目的條帶，而Trizol法也均未得到目的條帶，這說明CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法獲得的RNA質(zhì)量均能滿足后續(xù)分子實驗的需要。

3　討 論

RNA的提取是開展分子生物學(xué)研究中的一個最關(guān)鍵最基礎(chǔ)的問題，獲得完整的高純度RNA是基因克隆和表達(dá)等研究的關(guān)鍵所在。然而，不同的RNA提取方法各有其優(yōu)缺點，故需根據(jù)物種特性來選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。蓮霧果實富含多糖多酚、萜類物質(zhì)、色素、蛋白質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物［19］，嚴(yán)重干擾其RNA的提取。酚類化合物被氧化后會與RNA不可逆地結(jié)合，導(dǎo)致RNA活性喪失［20］，或形成不溶性復(fù)合物［21］；而多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀下來［22］；萜類化合物和RNase會分別造成RNA的化學(xué)降解和酶解［21］。

本研究中SDS法的A260nm∶A280nm的低比率說明提取的RNA中有酚類和多糖類等物質(zhì)的殘留污染；且其5S條帶很亮，可能是萜類化合物和RNase的殘留，從而造成RNA的化學(xué)降解和酶解，同時其又未將RNA與DNA完全分離開來，使產(chǎn)物有明顯DNA雜帶污染；Trizol是目前較常用的一種提取RNA的試劑，操作簡便，省時省力。目前此法已成功的從一些植物果實［23-24］中分離出高質(zhì)量的RNA，但本實驗組發(fā)現(xiàn)此方法并不適于提取蓮霧果實RNA，其產(chǎn)物中有較多多糖等雜質(zhì)殘留，RNA質(zhì)量較差。Plant RNA Kit試劑盒，是一種適于提取富含多糖、多酚的植物材料總RNA的試劑盒，成功獲得了高產(chǎn)量高質(zhì)量蓮霧果實總RNA，且實驗周期短，效率高，但同時成本也較高。CTAB法通過在裂解細(xì)胞階段加入蛋白酶K排除蛋白質(zhì)雜質(zhì)的干擾，而后又結(jié)合使用特異性沉淀RNA的LiCl，加上高濃度的Na+存在，有效清除了多糖和DNA的污染，獲得高質(zhì)量RNA且成本相對較低；而其缺點是周期較長，耗時耗力，且提取量較低。此法在香蕉［11］、枇杷［13-14］、越橘［15-16］、神秘果［25］等RNA提取的研究中也得到一致的結(jié)果。針對CTAB法濃度低提取量低的問題，改良CTAB法通過在第一步取樣時就先將新鮮樣品擠干，快速減少了樣品中糖類、色素等物質(zhì)含量，再結(jié)合75%乙醇溶液的預(yù)處理，獲得了高質(zhì)量總RNA的同時，其所得產(chǎn)量較未改良之前高出許多，而較試劑盒法其成本又低不少。

CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法均能提取高質(zhì)量的蓮霧果實總RNA，滿足RT-PCR等以RNA為基礎(chǔ)的后續(xù)分子生物學(xué)研究，其中試劑盒法和改良CTAB法所得提取量較高?？梢愿鶕?jù)實驗?zāi)康暮蛯NA質(zhì)量要求來選擇最佳提取方法。

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Comparison of Extraction Methods for High Quality RNA from Wax Apple （Syzygium samarangense Merr. et Perry）

YIN Zhenzhen1， WU Guangbin1， CHEN Fahe1，*， XIE Chaotian2
（1. Food and Bio-engineering College， Jimei University， Xiamen 361021， China；2. Fisheries College， Jimei University， Xiamen 361021， China）

The objective of the study was to extract high quality RNA from wax apple （Syzygium samarangense Merr. et Perry） fruits. The effectiveness of five RNA extraction methods， i.e.， Plant RNA Kit， hexadecyltrimethylammonium bromide（CTAB）， modified CTAB， sodium dodecyl sulfate （SDS） and Trizol， was evaluated. The results showed that the quality of total RNA extracted by SDS method was poor due to serious RNA degradation and genomic DNA contamination. The total RNA extracted with Trizol reagent contained various residues such as proteins and polysaccharides and exhibited no RNA bands. Plant Kit protocol， CTAB and modified CTAB methods were found to be suitable for total RNA extraction from wax apple fruit. RT-PCR analysis demonstrated that the RNA bands were consistent with the target fragment size， which showed that the extracted total RNA could be applied to subsequent molecular biology research.

wax apple fruit； RNA isolation； polysaccharide； polyphenol； method

S667.9

A

1002-6630（2015）14-0001-04

10.7506/spkx1002-6630-201514001

2014-11-19

國家自然科學(xué)基金面上項目（31171777）；福建省自然科學(xué)基金項目（2010J01211）

尹珍珍（1989—），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮。E-mail：837949196@qq.com

陳發(fā)河（1960—），男，教授，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮。E-mail：fhchen@jmu.edu.cn