嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH2抑制大腸桿菌作用機(jī)理的探討

趙瑞香，段改麗，楊天佑，孫俊良，牛生洋，王 瑩

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH2抑制大腸桿菌作用機(jī)理的探討

趙瑞香1，段改麗1，楊天佑2，孫俊良1，牛生洋1，王 瑩1

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

將離子交換色譜純化獲得的抑菌效價(jià)為380.60 AU/mL的嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH2作用于大腸桿菌（Escherichia coli），從死亡率、細(xì)胞膜損傷及引起胞內(nèi)物質(zhì)外泄方面，探討Lactobacillin XH2抑制大腸桿菌的機(jī)理。結(jié)果表明：Lactobacillin XH2作用于大腸桿菌后，在3 h內(nèi)大腸桿菌死亡率達(dá)96%，菌體細(xì)胞變形并出現(xiàn)孔洞，菌體短小且不規(guī)整。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜通透性增大，胞內(nèi)K+快速大量泄露，膜電位紊亂失衡；胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)、乳酸脫氫酶等生命大分子物質(zhì)大量流失；同時(shí)導(dǎo)致了大腸桿菌胞內(nèi)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）外泄，細(xì)胞物質(zhì)代謝、能量代謝失常，最終導(dǎo)致了菌體死亡。這些現(xiàn)象表明，孔道形成（pore formation）理論可能同樣適用于Lactobacillin XH2對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的作用機(jī)理。

嗜酸乳桿菌；細(xì)菌素；革蘭氏陰性菌；抑菌機(jī)理

乳酸菌（lactic acid bacteria）細(xì)菌素具有熱穩(wěn)定性，并耐酸、耐低溫，對食品的口感、口味等無不良影響。它的使用可以減弱殺菌強(qiáng)度，減少殺菌時(shí)間，有利于保持食品原有的營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味，在食品保鮮方面，可望成為替代化學(xué)抑菌劑的物質(zhì)，目前乳酸菌細(xì)菌素已成為天然防腐劑研究與開發(fā)應(yīng)用的熱點(diǎn)［1-3］。但是大多乳酸菌細(xì)菌素的抗菌譜較窄，只對革蘭氏陽性菌具有抑菌性，因此在使用中受到很大限制。近年來發(fā)現(xiàn)一些嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）細(xì)菌素具有廣譜性，不僅可抑制革蘭氏陽性菌，也可抑菌革蘭氏陰性菌和真菌，引起了人們越來越多的關(guān)注［4-7］。但是目前嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的研究多集中在細(xì)菌素發(fā)現(xiàn)、分離純化、生物學(xué)特性等方面［4］，而乳酸菌細(xì)菌素殺菌機(jī)制的研究對于細(xì)菌素開發(fā)應(yīng)用、安全評價(jià)及柵欄技術(shù)的開發(fā)都十分重要。目前只有乳酸菌細(xì)菌素Nisin、Sakacin、Pedioncin PA-1等殺菌機(jī)制的研究較為深入，主要體現(xiàn)在細(xì)菌素通過在敏感菌的細(xì)胞膜上形成孔洞，使細(xì)胞內(nèi)離子外泄，最終引起質(zhì)子驅(qū)動勢的耗散［8］。但是對于嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的抑菌機(jī)理，特別是對抑制革蘭氏陰性菌的作用機(jī)理的涉及較少，相關(guān)研究亟待開展。本課題前期從嗜酸乳桿菌La-XH2中分離出的細(xì)菌素，具有較高的熱和酸穩(wěn)定性，對胰蛋白酶、胃蛋白酶及木瓜蛋白酶均有敏感性，分子質(zhì)量為16 ku左右，其更為接近Ⅱ類細(xì)菌素［9-10］，但有存在明顯不同，特別是該細(xì)菌素對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有較強(qiáng)的抑制性，可能是一種新型的細(xì)菌素，具有較大的研究價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)以離子交換色譜分離純化嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH2作用于大腸桿菌（Escherichia coli），從死亡率、細(xì)胞膜的膜損傷、胞內(nèi)物質(zhì)外泄等方面探討該細(xì)菌素抑制大腸桿菌的機(jī)理，進(jìn)而闡述嗜酸乳桿菌細(xì)菌素抑制革蘭氏陰性菌的機(jī)理，并為該細(xì)菌素的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株、培養(yǎng)基與試劑

細(xì)菌素產(chǎn)生菌：嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）La-XH2，來源于波蘭羅茲技術(shù)大學(xué)發(fā)酵工程與工業(yè)微生物系，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室馴化保藏；培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基；指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）JM109，由河南科技學(xué)院食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏提供，培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。

Na2HPO4、NaH2PO4、Cellufine A-500 北京慧德易科技有限責(zé)任公司；考馬斯亮藍(lán)R-250（色譜純） 上?；瘜W(xué)試劑公司分裝廠；N-（2-羥乙基）哌嗪-N’-2-乙烷磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonicaci，HEPES） 美國Sigma公司；細(xì)胞裂解液 北京Solarbio公司；乳酸脫氫酶試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測試劑盒 美國Promega公司。

1.2儀器與設(shè)備

Heraeus Multifuge低溫高速離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀 德國賽默飛世爾公司；Quanta 200掃描電子顯微鏡美國FEI公司；Optima2100DV原子發(fā)射光譜儀 美國PE公司。

1.3方法

1.3.1蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度及抑菌效價(jià)的測定［11-12］

將培養(yǎng)18 h的La-XH2菌液離心獲取的發(fā)酵上清液、由氯仿萃取的粗提物及粗提液經(jīng)離子交換Cellufine A-500純化［13］獲取的細(xì)菌素Lactobacillin XH2，進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和抑菌效價(jià)測定。采用考馬斯亮藍(lán)（Bradford）法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，以吸光度為縱坐標(biāo)（y），蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.413 8x+0.005 2（R2=0.996 6）。抗菌蛋白的抑菌效價(jià)值（AU/mL）以100 ?L純化后樣品經(jīng)系列稀釋后仍能形成明顯的抑菌圈的最大稀釋度的倒數(shù)再乘以10方法測定。

1.3.2大腸桿菌菌懸液的制備

將對數(shù)生長期的單核細(xì)胞增生大腸桿菌液，于4 ℃條件下8 000 r/min 離心10 min，沉淀用pH 7.0的2.5 mmol/L HEPES緩沖液洗滌一次，重懸浮在該緩沖液中，制備成107CFU/mL菌液備用。

1.3.3大腸桿菌的細(xì)菌素處理

取10 mL大腸桿菌菌懸液，加100 mmol/L葡萄糖活化，37 ℃溫育10 min，加2 mL的Lactobacillin XH2細(xì)菌素使其終效價(jià)為380.60 AU/mL，處理3 h，1～3 h每30 min取樣一次。采用平板計(jì)數(shù)法測定各個(gè)取樣點(diǎn)的大腸桿菌菌落數(shù)，重復(fù)3 次，每次3 個(gè)平行。取平均值計(jì)算細(xì)菌素對大腸桿菌的致死率（M），計(jì)算公式如下。

式中：a0、a1分別為未經(jīng)細(xì)菌素處理的大腸桿菌菌落數(shù)和細(xì)菌素處理后大腸桿菌菌落數(shù)。

1.3.4大腸桿菌的光鏡及掃描電鏡觀察

取細(xì)菌素處理3 h后的大腸桿菌兩份，一份革蘭氏染色后在100×油鏡下觀察大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)；另一份用體積分?jǐn)?shù)1%戊二醛固定2 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS，pH 7.0，50 mmol/L，V（Na2HPO4）：V（NaH2PO4）=1.56：1）漂洗3 次，每次5 min，先后用60%、70%的乙醇各脫水10 min，離心，沉淀真空冷凍干燥后，鍍金儀噴金90 s，在電鏡下進(jìn)行掃描［14］。

1.3.5大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)外K+質(zhì)量濃度的測定

取細(xì)菌素處理0～3 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)（同1.3.3節(jié)）的大腸桿菌懸液各0.5 mL置于冰上，0 ℃條件下1 000 r/min離心10 min；上清液用于測細(xì)胞外K+質(zhì)量濃度。菌體細(xì)胞用1 mL 5%的三氯乙酸懸浮，-20 ℃下冷凍過夜，解凍后95 ℃溫育10 min，每份樣品加 4 mL去離子水，10 000 r/min離心15 min，上清液用原子發(fā)射光譜測定測K+質(zhì)量濃度。

1.3.6胞外紫外吸收物質(zhì)及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力的測定

按1.3.5節(jié)中用于測定胞外K+質(zhì)量濃度樣品的制備方法，制備上清液，分兩份，一份用于上清液中紫外吸收物質(zhì)測定，通過酶標(biāo)儀測定上清液260 nm波長處光密度值，以同樣處理且未加細(xì)菌素的樣品作對照；另一份用于胞外乳酸脫氫酶的測定，參考南京建成乳酸脫氫酶測定試劑盒說明書中的方法。

1.3.7大腸桿菌ATP含量的測定

取細(xì)菌素處理3 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)（同1.3.3節(jié)）的大腸桿菌懸液各1 mL，4 ℃條件下12 000 r/min離心6 min，取上清液測胞外ATP含量。菌體加入100 ?L細(xì)胞裂解液，室溫放置10 min后，4 ℃條件下12 000 r/min離心6 min，取上清液測胞內(nèi)ATP含量。取100 ?L熒光素-熒光素酶試劑和上清液樣品混合，用酶標(biāo)儀熒光光度計(jì)測定10 s后的相對光單位（relative light units，RLU）為胞內(nèi)外ATP值［15］。

2　結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌素質(zhì)量濃度及抑菌效價(jià)

對氯仿萃取粗提的細(xì)菌素及層析后的洗脫液進(jìn)行抑菌效價(jià)、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定，其結(jié)果見表1。細(xì)菌素抑菌效價(jià)為380.60 AU/mL，而蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度降低為68.52 μg/mL。以下實(shí)驗(yàn)均采用離子交換純化后抑菌效價(jià)和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為380.60 AU/mL、68.52 μg/mL的細(xì)菌素做抑菌機(jī)理研究。

表1　嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH2純化結(jié)果Table1 Purification of Lactobacillin XH2

2.2細(xì)菌素對大腸桿菌的致死率

表2　嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH2作用下的大腸桿菌致死率Table2 Effects of Lactobacillin XH2 on the mortality rate of

細(xì)菌素Lactobacillin XH2處理大腸桿菌3 h內(nèi)的變化如表2所示。嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH2作用下的大腸桿菌在0～1.5 h內(nèi)迅速減少，致死率達(dá)91.00%，之后基本趨于穩(wěn)定。在3 h內(nèi)大部分大腸桿菌由于細(xì)菌素的作用而死亡。

2.3光鏡及掃描電鏡下大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的變化

圖1　光鏡及掃描電鏡下嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH2對大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effect of Lactobacillin XH2 on the structure of Escherichia coli under optical microscope and scanning electron microscope

細(xì)菌素Lactobacillin XH2作用大腸桿菌前后，細(xì)胞光鏡及電鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖1所示。由圖1b、1d可知，細(xì)菌素作用后的大腸桿菌，菌體表面出現(xiàn)明顯的孔洞，菌體變得短粗?？梢?，細(xì)菌素Lactobacillin XH2作用大腸桿菌可在細(xì)胞表面形成明顯的孔洞，同時(shí)引起膜透性增大，致使細(xì)胞質(zhì)外泄，胞內(nèi)物質(zhì)的損失及部分細(xì)胞壁缺失最終導(dǎo)致了菌體細(xì)胞的變形。這一結(jié)果與Altena等［16］對Nisin吸附與靶細(xì)胞膜上，致使靶細(xì)胞細(xì)胞膜形成孔洞的結(jié)論類似。

2.4大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)外K+質(zhì)量濃度的變化

圖2　大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)外KK+質(zhì)量濃度的變化Fig.2 K+leakage from Escherichia coli cells

由圖2可知，嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH2作用于大腸桿菌，胞外K+質(zhì)量濃度在0.5 h內(nèi)迅速上升到6.78 ?g/mL后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，胞內(nèi)K+質(zhì)量濃度在0.5 h內(nèi)由12.57 ?g/mL迅速降到0.04 ?g/mL后達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。由此可見該細(xì)菌素吸附在靶細(xì)胞膜上形成穿膜“孔道”，可允許分子質(zhì)量為0.5 ku的親水離子通過［17］，引起大腸桿菌K+迅速外泄，胞內(nèi)K+大量泄露可導(dǎo)致細(xì)胞膜電位失衡。

2.5大腸桿菌胞外紫外吸收物質(zhì)的變化

細(xì)菌素Lactobacillin XH2處理不同時(shí)間，大腸桿菌胞外紫外吸收物質(zhì)變化，如圖3所示，未經(jīng)Lactobacillin XH2處理的大腸桿菌，在0.5～3.0 h內(nèi)，其胞外紫外吸收物質(zhì)的OD260nm值處于0.05以下的較低范圍，而細(xì)菌素處理后其OD260nm介于0.3～0.4的較高水平，約為對照的10.0 倍。同時(shí)，隨著作用時(shí)間延長，大腸桿菌胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)外泄程度越來越嚴(yán)重。

圖3　大腸桿菌胞外紫外吸收物質(zhì)外泄情況Fig.3 Leakage of UV-absorbing substances from Escherichia coli cells

2.6大腸桿菌胞外乳酸脫氫酶活力的變化

圖4　大腸桿菌胞內(nèi)乳酸脫氫酶外泄情況Fig.4 LDH leakage from Escherichia coli cells

由圖4可知，隨著嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH2處理時(shí)間的延長，大腸桿菌胞外LDH活力逐漸上升，在0～1.5 h內(nèi)變化緩慢，之后迅速上升，在3.0 h時(shí)達(dá)3 554.32 U/L。乳酸脫氫酶是催化乳酸脫氫生成丙酮酸的糖酵解酶，會由破損的細(xì)胞內(nèi)滲出，因此，可通過細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活力大小評價(jià)細(xì)胞受損情況［18］，這與周偉等［19］報(bào)道的植物乳桿菌素L-1對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌作用下的LDH變化有類似的趨勢，但較該課題研究的LDH泄露量少，表明本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞受到較大的損傷。這些小分子生命物質(zhì)的大量外泄，致使大腸桿菌細(xì)胞物質(zhì)能量代謝失常。

2.7大腸桿菌胞內(nèi)外ATP的含量變化

由圖5可知，細(xì)菌素Lactobacillin XH2作用后的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)外ATP含量都發(fā)生了較大的變化，0～1 h內(nèi)，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)ATP的RLU值由112 861.000迅速下降至7.047較低的水平，胞外ATP呈逐漸增加趨勢，作用3 h后ATP的RLU值由0升高到235.805 。該結(jié)果與Naghmouchi等［20］研究的Divergicin M35細(xì)菌素對單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）細(xì)胞內(nèi)ATP的影響有類似的趨勢。

圖5　大腸桿菌胞內(nèi)（b）外（a）ATP含量的變化趨勢Fig.5 Effects of Lactobacillin XH2 on intracellular （b） and extracellular （a） ATP levels in Escherichia coli cells

3　結(jié) 論

研究前期通過離子交換色譜法分離純化得到細(xì)菌素Lactobacillin XH2，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌具有較高的抑制活性，在此基礎(chǔ)上對抑菌機(jī)理進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH2作用于大腸桿菌，3 h內(nèi)大腸桿菌大部分死亡，菌體細(xì)胞變形并出現(xiàn)孔洞，細(xì)胞壁缺失；大腸桿菌胞內(nèi)K+快速大量泄露，紫外吸收物質(zhì)、乳酸脫氫酶等生命大分子物質(zhì)大量流失；同時(shí)導(dǎo)致了ATP外泄，細(xì)胞物質(zhì)能量代謝失常。由此推測Lactobacillin XH2作用大腸桿菌主要是通過膜透化作用而引起胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，電鏡下觀察到的大腸桿菌細(xì)胞孔洞的形成，可能是由于細(xì)菌素分子嵌入細(xì)胞膜內(nèi)而形成，使得膜通透性增加，形成穿膜“孔道”，導(dǎo)致紫外吸收物質(zhì)、乳酸脫氫酶等生命物質(zhì)大量流失，細(xì)胞物質(zhì)代謝失常，并且K+的大量外泄導(dǎo)致膜電位的消散、細(xì)胞膜去極化，ATP維持膜電位而大量消耗，細(xì)胞外水分子流入，最終導(dǎo)致菌體死亡，可見，Engelke等［21］提出的“孔道形成（pore formation）”理論可能同樣適用于Lactobacillin XH2作用革蘭氏陰性菌大腸桿菌。該細(xì)菌素對大腸桿菌作用機(jī)理的探討可為進(jìn)一步研究該細(xì)菌素的應(yīng)用及其構(gòu)效關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

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Antibacterial Mechanism of Lactobacillin XH2 from Lactobacillus acidophilus on Escherichia coli

ZHAO Ruixiang1， DUAN Gaili1， YANG Tianyou2， SUN Junliang1， NIU Shengyang1， WANG Ying1
（1. College of Food Science， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， China； 2. College of Life Science and Technology， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， China）

Lactobacillin XH2 with antibacterial potency of 380.60 AU/mL was purified from the culture supernatant of Lactobacillus acidophilus by ion-exchange chromatography. Its antibacterial mechanism on Escherichia coli （E. coli） was investigated by examining its effects on mortality rate， cell membrane damage and leakage of intracellular contents from E. coli cells. Most E. coli cells died in 3 h and their cell walls were partially damaged. The concentration of intracellular K+in E. coli decreased rapidly， which resulted in imbalance of the membrane potential. The leakage of large amounts of macromolecules such as ultraviolet-absorbing substances， lactate dehydrogenase and intracellular ATP led to disruption of the cellular structure and abnormal energy metabolism， causing the cells to die eventually. These observations i ndicate that the pore formation theory could apply to Gram-negative bacteria E. coli.

Lactobacillus acidophilus； bacteriocin； Gram-negative bacteria； antibacterial mechanism

TS201.3

A

1002-6630（2015）03-0075-05

10.7506/spkx1002-6630-201503014

2014-04-09

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（12A550004）；河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（122102110117）；新鄉(xiāng)市科技創(chuàng)新平臺建設(shè)項(xiàng)目（CP1310）

趙瑞香（1966—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zrx338@163.com