邵向麗，趙　爽，劉書(shū)亮，李建龍，胡欣潔，趙　勤，何　利，鄧維琴，韓新鋒

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

四川麩醋醋醅中優(yōu)良醋酸菌的篩選及其產(chǎn)酸特性

邵向麗，趙爽+，劉書(shū)亮*，李建龍，胡欣潔，趙勤，何利，鄧維琴，韓新鋒

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

從四川麩醋醋醅中篩選獲得5株高產(chǎn)酸菌株（C9-4、C12-4、A30-16、A12-7和A30-14-2），對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定及16S rDNA分子鑒定，結(jié)果顯示，5株菌均為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）。其產(chǎn)酸特性表明，菌株C9-4、A30-16和A30-14-2能耐受9%（v/v）乙醇；5株菌均能耐受4%（v/v）底酸；補(bǔ)加酒精實(shí)驗(yàn)表明，菌株C9-4的連續(xù)產(chǎn)酸能力最強(qiáng)；菌株C9-4、A30-16、A30-14-2在40℃時(shí)仍能產(chǎn)酸；相同條件下，菌株C9-4、A30-16、A30-14-2產(chǎn)酸速率優(yōu)于菌株C12-4和A12-7。5株醋酸菌產(chǎn)酸總量從高到低依次為：A30-16＞C12-4＞C9-4＞A30-14-2＞A12-7。

四川麩醋，醋酸菌，篩選，鑒定，特性

食醋作為一種重要的傳統(tǒng)調(diào)味品，不僅具有特殊的風(fēng)味，而且對(duì)一些食源性致病細(xì)菌具有一定的抑制作用［1］，長(zhǎng)期食用還能達(dá)到緩解疲勞、調(diào)節(jié)血糖、脂質(zhì)代謝及促進(jìn)食欲的功效［2］。四川麩醋以麩皮等為主要原料，采用生料固態(tài)發(fā)酵的傳統(tǒng)工藝，以獨(dú)特的藥曲加黑曲為糖化劑，加入酵母菌與麩皮拌和后入池發(fā)酵，主要依靠環(huán)境中的醋酸菌進(jìn)行，發(fā)酵周期一個(gè)月以上［3-4］。四川麩醋的傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工藝在實(shí)際生產(chǎn)中存在淀粉利用率低、生醋酸度低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等問(wèn)題，因此篩選出優(yōu)良的醋酸菌對(duì)食醋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要［5-6］。

王電壘等［7］篩選到兩株耐高溫醋酸菌Ⅱ9、Ⅵ13，菌株在40℃酒精中轉(zhuǎn)化率均可達(dá)到73.2%以上；席青等［8］從山西醋醅中篩選出1株優(yōu)勢(shì)產(chǎn)酸菌（醋化醋桿菌奧爾蘭亞種），其產(chǎn)酸量為66.92g/L，酒精轉(zhuǎn)化率為72.42%；Maria Gullo等［9］從意大利香醋中分離出的部分菌株可耐25%高濃度葡萄糖；T T Kadere等［10］從肯尼亞棕櫚酒中篩出的醋酸菌在25～40℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好；朱其瀚等［11］從鎮(zhèn)江恒順醋廠的醋醅中分離純化出1株巴氏醋桿菌，該菌株能產(chǎn)生3種有機(jī)酸：乳酸、乙酸、酒石酸；而許偉從鎮(zhèn)江香醋醋醅中篩選到1株能產(chǎn)乙酸、琥珀酸、焦谷氨酸、α-酮戊二酸、酒石酸5種有機(jī)酸的醋酸菌；通過(guò)生物強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)，菌株總酸最高達(dá)到74g/L，出醋率提高7%～25%［12］，與山西陳醋、鎮(zhèn)江香醋等食醋中篩選到的優(yōu)良醋酸菌株相比較，從四川麩醋中篩選優(yōu)良醋酸菌的報(bào)道并不多見(jiàn)，陳娟等［13］從四川保寧醋醋醅中篩選出1株惡臭醋桿菌，相同條件下，其產(chǎn)酸量（33.8g/L）明顯低于其他醋酸菌菌株。

本文旨在從四川麩醋傳統(tǒng)生料固態(tài)釀造的醋醅中分離篩選出具有耐高溫、耐酒精、耐底酸的高產(chǎn)酸優(yōu)勢(shì)醋酸菌，為食醋生產(chǎn)提供菌種資源。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

醋醅采自四川閬中保寧醋廠不同發(fā)酵期的醋醅；菌株巴氏醋桿菌巴氏亞種（Acetobacter pasteurianus subsp.pasteurianus），CICC編號(hào)：7015；惡臭醋桿菌混濁變種1.41（Acetobacter rancens var. turbidans），CICC編號(hào)：20064均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；甲醇、乙酸、L-乳酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、丙酮酸、L-蘋果酸、琥珀酸均為色譜純；TIANDZ柱式細(xì)菌DNAOUT購(gòu)于四川省綿陽(yáng)天澤基因工程有限公司；Prem ix Taq、Gold View核酸染料、DNA Marker DL2000、瓊脂糖均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌通用引物，上游引物：5’-AGAG…TTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’ 由上海英駿（invitrogen）生物技術(shù)有限公司合成；其他試劑均為分析純。

PCR儀（My CyclerTM Thermal Cycler）Bio-Rad；凝膠成像儀（Quantity One System）Bio-Rad；LC-10A2010C HT型液相色譜儀、LC-solution工作站日本島津公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7890A-5975C）美國(guó)安捷倫公司；AS10200A超聲波清洗器天津奧特賽恩斯公司；Milli-Q超純水儀美國(guó)密理博公司。

1.2培養(yǎng)基

分離純化培養(yǎng)基：酵母膏10g，葡萄糖10g，瓊脂粉20g，CaCO320g，蒸餾水1000m L，培養(yǎng)基添加50m L溴甲酚紫溶液，pH為自然，使用前加3%（v/v）無(wú)水乙醇。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母膏10g，葡萄糖10g，使用前加入3%（v/v）無(wú)水乙醇。

產(chǎn)酸培養(yǎng)基：酵母膏10g，葡萄糖10g，使用前加入7%（v/v）無(wú)水乙醇。

斜面保藏培養(yǎng)基：酵母膏10g，葡萄糖10g，瓊脂粉20g，CaCO320g，蒸餾水1000m L使用前加入3%（v/v）無(wú)水乙醇。

以上培養(yǎng)基均需121℃，滅菌15m in。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1醋酸菌的分離篩選流程醋醅→增菌培養(yǎng)→稀釋涂布→分離純化［8］→鏡檢→斜面保藏→產(chǎn)醋酸定性實(shí)驗(yàn)［14］→產(chǎn)酸定量實(shí)驗(yàn)［15］→甘油保種。產(chǎn)酸定量實(shí)驗(yàn)以菌株20064和菌株7015為對(duì)照菌株。

1.3.2產(chǎn)醋酸菌株的鑒定通過(guò)16S rDNA遺傳學(xué)鑒定方法［16］和生理生化、形態(tài)學(xué)鑒定方法（參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第8版）》與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》）對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.3菌株的產(chǎn)酸特性

1.3.3.1不同乙醇濃度對(duì)菌株產(chǎn)酸的影響將通過(guò)產(chǎn)酸定量實(shí)驗(yàn)篩選得到的高產(chǎn)酸醋酸菌于30℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)（22±2）h活化后，分別接種于乙醇含量分別為3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%（v/v）的產(chǎn)酸培養(yǎng)基中，30℃、120r/m in振蕩培養(yǎng)72h，測(cè)定產(chǎn)酸量。相同條件下，測(cè)定菌株20064和7015的產(chǎn)酸量。

1.3.3.2補(bǔ)加乙醇對(duì)菌株產(chǎn)酸的影響將通過(guò)產(chǎn)酸定量實(shí)驗(yàn)篩選得到的高產(chǎn)酸醋酸菌于30℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)（22±2）h活化后，分別接種于乙醇含量為3%（v/v）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每隔24h補(bǔ)加1%（v/v）無(wú)水乙醇，30℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)72h，測(cè)定產(chǎn)酸量。相同條件下，測(cè)定菌株20064和7015的產(chǎn)酸量。

1.3.3.3不同濃度底酸對(duì)菌株產(chǎn)酸的影響將通過(guò)產(chǎn)酸定量實(shí)驗(yàn)篩選得到的高產(chǎn)酸醋酸菌于30℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)（22±2）h活化后，分別接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，底酸（乙酸）濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%（v/v），30℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)72h，測(cè)定產(chǎn)酸量。相同條件下，測(cè)定菌株20064和7015的產(chǎn)酸量。

1.3.3.4不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酸的影響將通過(guò)產(chǎn)酸定量實(shí)驗(yàn)篩選得到的高產(chǎn)酸醋酸菌于30℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)（22±2）h活化后，分別接入產(chǎn)酸培養(yǎng)基后，分別于28、30、35、37、40℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)72h，測(cè)定產(chǎn)酸量。相同條件下，測(cè)定菌株20064和7015的產(chǎn)酸量。

1.3.5產(chǎn)酸曲線的測(cè)定將菌株分別接入裝有100m L產(chǎn)酸培養(yǎng)基的300m L的三角瓶中，于30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)10d，每天測(cè)一次產(chǎn)酸量。相同條件下，測(cè)定菌株20064和7015的產(chǎn)酸量。

1.3.6發(fā)酵液中有機(jī)酸的測(cè)定將5株菌株（C9-4、C12-4、A12-7、A30-14-2、A30-16）分別接入產(chǎn)酸培養(yǎng)基100m L/300m L的三角瓶中，30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)72h，取發(fā)酵液，12000r/m in離心10m in，再取上清液，0.22μm濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液用于HPLC檢測(cè)。

色譜條件：Carbomix H-NP 10μm，7.8mm×300mm；柱溫58℃；流動(dòng)相2.5mmol/L H2SO4；進(jìn)樣體積10μL，流速0.6m L/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。

按不同樣品目標(biāo)峰的峰面積對(duì)應(yīng)的濃度進(jìn)行定量［17-18］。

2　結(jié)果與分析

2.1高產(chǎn)酸菌株的篩選

從自然發(fā)酵的麩醋醋醅中分離純化得到12株產(chǎn)酸菌株，其產(chǎn)酸量均高于對(duì)照菌株20064，其產(chǎn)酸量如表1所示，結(jié)合菌株分離至不同發(fā)酵天數(shù)的醋醅，由表得出菌株C9-4、C12-4、A 12-7、A30-14-2、A30-16為較高產(chǎn)酸菌株，因此選擇該菌株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。

表1　不同菌株的產(chǎn)酸量Table 1　Acid production of different strains

2.2菌株鑒定結(jié)果

菌株在碳酸鈣平板上的菌落形態(tài)及鏡檢的個(gè)體形態(tài)（10×100）如圖1所示。菌落呈淡黃色或乳白色，菌落形態(tài)圓形、隆起、光滑，邊緣不整齊，5株醋酸菌菌株經(jīng)革蘭氏染色，在油鏡下進(jìn)行觀察，其均呈桿狀或短桿狀，單生、對(duì)生或呈鏈狀。

圖1　菌株的菌落及個(gè)體形態(tài)特征Fig.1　The colony and individual characteristics of strains

對(duì)其中5株菌C9-4、C12-4、A12-7、A30-14-2、A30-16進(jìn)行了生理生化鑒定和16S rDNA遺傳學(xué)鑒定，生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2，從表2中可以看出5株菌均不能在Hoyer-Frateur培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，不能產(chǎn)5-酮基葡萄糖酸鹽和纖維素，但卻均可產(chǎn)醋酸，C12-4、A12-7菌株可以產(chǎn)葡萄糖酸鹽。

圖2為5株菌16S rDNA的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，經(jīng)檢測(cè)，其片段大小均在1500bp左右，將其測(cè)序結(jié)果提交NCBI后獲得登錄號(hào)，分別是KF707665、KF707666，KF707667、KF707668、KF707669。采用Blast在Genbank中進(jìn)行相似性比對(duì)，并對(duì)5株菌構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（如圖3所示）。根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)及16S rDNA序列分析可判定5株菌均為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）。

圖2　菌株16S rDNA的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2　Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA gene PCR products of strains

圖3　基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3　Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

2.3菌株的產(chǎn)酸特性

2.3.1菌株對(duì)不同酒精濃度的適應(yīng)性如圖4所示，隨著乙醇含量的增加，菌株的產(chǎn)酸量均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。其中，菌株A30-16對(duì)乙醇的耐受性較好，在乙醇含量7%時(shí)，產(chǎn)酸量最高（55.51g/L），其和對(duì)照菌株7015（7%，54.18g/L）相當(dāng)，優(yōu)于菌株20064（6%，41.81g/L）；菌株C9-4、C12-4和A12-7的產(chǎn)酸量在乙醇含量為6%時(shí)最高，分別為45.51、42.98、39.46g/L；菌株A30-14-2的產(chǎn)酸量在乙醇含量為5%時(shí)達(dá)到最高值（41.54g/L）；菌株C9-4、A30-16和A30-14-2能耐受9%（v/v）乙醇。

2.3.2補(bǔ)加乙醇對(duì)菌株產(chǎn)酸的影響以菌株20064及7015作為對(duì)照，對(duì)5株高產(chǎn)酸醋酸菌進(jìn)行補(bǔ)加酒精實(shí)驗(yàn)，如圖5所示，補(bǔ)加乙醇后，5株菌的最終產(chǎn)酸量均高于對(duì)照菌株20064（34.48g/L）；菌株C9-4的產(chǎn)酸量最高，為43.60g/L，其次分別是菌株C12-4（41.83g/L）、菌株A30-14-2（41.61g/L）、菌株A30-16（41.46g/L）、菌株A12-7（39.83g/L）。

表2　菌株的生理生化鑒定結(jié)果Table 2　Physiological and biochemical identification results of different strains

圖4　菌株對(duì)不同酒精度濃度的適應(yīng)性Fig.4　Adaptability of strains to differentalcohol

圖5　補(bǔ)加乙醇對(duì)菌株產(chǎn)酸的影響Fig.5　The effectofadding ethanol test to strains producting acid

2.3.3菌株對(duì)不同濃度底酸的適應(yīng)性以菌株20064及7015作為對(duì)照，對(duì)5株高產(chǎn)酸醋酸菌進(jìn)行底酸適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示，5株菌均能耐受4%（v/v）底酸；菌株A30-16的產(chǎn)酸量在底酸濃度≤4%的范圍內(nèi)，隨底酸濃度的增加而增加；其他菌株的產(chǎn)酸量隨底酸濃度的增加均呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)；菌株A30-16、A30-14-2和C9-4對(duì)底酸的耐受力較菌株C12-4和A12-7強(qiáng)。

圖6　菌株對(duì)不同濃度底酸的適應(yīng)性Fig.6　Adaptability of strains to differentbottom acid concentration

2.3.4菌株對(duì)不同溫度的適應(yīng)性以菌株20064及7015作為對(duì)照，對(duì)5株高產(chǎn)酸醋酸菌進(jìn)行溫度適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)，如圖7所示，在28～40℃范圍內(nèi)，菌株C12-4的產(chǎn)酸量隨溫度的升高持續(xù)快速減少，菌株A30-14-2隨溫度的升高基本呈等差數(shù)列減少；菌株C9-4、A12-7、A30-16的產(chǎn)酸量隨溫度的升高均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，并在34℃達(dá)到最高值；菌株C9-4、A 30-14-2和A30-16的產(chǎn)酸量在28～40℃范圍內(nèi)波動(dòng)相對(duì)較小，對(duì)溫度的適應(yīng)范圍廣，尤其是菌株C9-4、菌株A30-14-2和菌株A30-16能耐受40℃的高溫并產(chǎn)酸，產(chǎn)酸量達(dá)到20g/L以上。

圖7　菌株對(duì)不同溫度的適應(yīng)性Fig.7　Adaptability of strains to different temperature

2.3.5菌株的產(chǎn)酸曲線以菌株20064及7015作為對(duì)照，繪制5株高產(chǎn)酸醋酸菌的產(chǎn)酸曲線。如圖8所示，菌株A30-14-2、C9-4、A30-16的產(chǎn)酸量在0～5d迅速增加，5～10d緩慢增加；菌株C12-4、A12-7的產(chǎn)酸量在0～10d內(nèi)呈“S”型變化趨勢(shì)，0～3d產(chǎn)酸量基本不增加，3～6d迅速增加，6～10d又呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)。表明菌株A30-14-2、C9-4和A30-16的產(chǎn)酸速率及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性優(yōu)于菌株C12-4和A12-7。

圖8　菌株的產(chǎn)酸曲線Fig.8　Acid producing curve of strains

2.3.6菌株產(chǎn)有機(jī)酸情況由表3可知，5株菌株均被檢出5種以上的有機(jī)酸，均未檢出乳酸；菌株C9-4、A 12-7未檢出檸檬酸，菌株C9-4、C12-4未檢出蘋果酸；菌株C12-4產(chǎn)酒石酸的量顯著高于其他菌株，菌株A30-16產(chǎn)乙酸的量顯著高于其他菌株；產(chǎn)酸總量從高到低依次為：A30-16＞C12-4＞C9-4＞A30-14-2＞A 12-7。

表3　不同菌株發(fā)酵液中有機(jī)酸的含量（mg/mL）Table 3　Contentof organic acids in the fermentation broth of different strains（mg/mL）

3　結(jié)論與討論

從四川麩醋醋醅中篩選到5株高產(chǎn)酸菌株C9-4、C12-4、A30-16、A12-7和A30-14-2均為巴氏醋桿菌。5株菌的產(chǎn)酸特性表明，菌株A30-16對(duì)酒精的耐受力最強(qiáng)，可耐受9%（v/v）乙醇，在乙醇含量7%時(shí)，產(chǎn)酸量最高為55.51g/L；補(bǔ)加乙醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示菌株C9-4的產(chǎn)酸量最高（43.60g/L）。底酸濃度適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株A30-16對(duì)底酸的耐受力最強(qiáng)；同時(shí)，5株醋酸菌均能產(chǎn)5種以上有機(jī)酸。獲得的5株醋酸菌尤其是菌株A30-16和C9-4可作為優(yōu)良菌種用于四川麩醋及其他種類食醋、果醋等發(fā)酵醋產(chǎn)品的釀造。

據(jù)余寧華等報(bào)道［19-20］，乳酸和酒石酸是以麩醋為代表的保寧醋的特征性有機(jī)酸，尤其是乳酸含量明顯高于其他有機(jī)酸，成就了保寧醋酸味柔和、酸中回甜的特點(diǎn)；但本文從四川麩醋醋醅中篩選的巴氏醋桿菌的醋酸發(fā)酵液中均未檢出乳酸；結(jié)合Shin Haruta等［21］和許瑋等［12］研究結(jié)果，可以推測(cè)四川麩醋中大量的乳酸可能來(lái)源于其醋醅中存在的乳酸菌。

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Screening of high quality acitic acid bacteria from grains of Sichuan bran vinegar and its characteristics of producting acid

SHAO Xiang-li，ZHAO Shuang+，LIU Shu-liang*，LI Jian-long，HU Xin-jie，ZHAO Qin，HE Li，DENG W ei-qin，HAN Xin-feng
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

Five high-yielding acetic acid bacteria（C9-4，C12-4，A30-16，A12-7 and A30-14-2）were screened from Sichuan b ran vinegar g rains，they were all identified as Acetobacter pasteurianus by analysis of morphological，physiological and biochem ical characteristics，and 16S rDNA genetic identification.The results of acid-p roducing characteristics of the 5 high-yield ing strains showed that C9-4，A30-14-2 and A30-16 could adap ted to 9%（v/v）ethanol，allof the 5 strains could stand 4%acid concentration.The results of ethanol addition tests showed that strain C9-4 could transform ethanol to acid continuously most.C9-4，A30-16 and A30-14-2 could stillp roduce acid at40℃.Acid p roducing rates of strains C9-4，A30-16 and A30-14-2 were higher than that of strains C12-4 and A12-7 under the same cond ition.The total amount of organic acids p roduced by the 5 strains were as follows：A30-16＞C12-4＞C9-4＞A30-14-2＞A12-7.

Sichuan bran vinegar；acetic acid bacteria；sc reening；identification；characteristics

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-0203-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.037

2014-07-04+并列第一作者

邵向麗（1990-），女，本科，研究方向：食品科學(xué)與工程。趙爽（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

劉書(shū)亮（1968-），男，博士，教授，主要從事食品微生物與發(fā)酵方面的研究。

四川省科技廳科技支撐計(jì)劃（2013NZ0055）資助。