甘蔗TB1基因的克隆與生物信息學(xué)分析

李旭娟　林秀琴　劉洪博　李純佳　徐超華　劉新龍

摘 要 以負(fù)調(diào)控禾本科植物分蘗的關(guān)鍵基因TB1為研究對象，根據(jù)水稻、玉米、高粱TB1同源基因保守序列設(shè)計(jì)引物，使用RT-PCR方法和RACE技術(shù)從甘蔗莖尖處克隆到該基因的同源基因ScTB1。ScTB1 cDNA全長1 668 bp，包含274 bp的5′ UTR，1 149 bp的CDS和245 bp的3′ UTR。生物信息學(xué)分析表明該基因可編碼382個氨基酸殘基，編碼產(chǎn)物含有保守的SP區(qū)、TCP區(qū)和R區(qū)，屬于TCP家族轉(zhuǎn)錄因子。其分子量為40.7 ku，理論等電點(diǎn)為8.55，蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測其主要定位于細(xì)胞質(zhì)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明ScTB1屬于CYC/TB1亞族蛋白，與高粱TB1和玉米TB1聚為一個亞類。根據(jù)序列的保守性和預(yù)測結(jié)果可推測ScTB1很可能也參與了甘蔗分蘗性狀的調(diào)控。

關(guān)鍵詞 甘蔗；分蘗；TB1基因；克??；生物信息學(xué)分析

中圖分類號 S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract In this study， TB1 homolog of sugarcane was cloned from the stem apex by using RT-PCR and RACE method referring to the conserved sequence of TB1 homologs in rice， maize and sorghum. The cDNA length of ScTB1 is 1 668 bp， which contains 274 bp 5′ UTR， 1 149 bp CDS and 245 bp 3′ UTR. Bioinformatics analysis showed that ScTB1 belonged to the TCP family of transcription factors， which is composed of 382 amino acid residues and contains three conservative domains（SP， TCP and R domains）. The molecular weight and theoretical isoelectric point of ScTB1 was 40.7 ku and 8.55， respectively， and the gene was likely located in cytoplasm. Phylogenetic tree analysis indicates that ScTB1 belonged to CYC/TB1 subfamily and had a very close relationship with TB1 homologs of maize and sorghum. Based on the sequence conservation， it is suggested that ScTB1 may be required for the regulation of tillering trait. This study provides important information for further research on the functional analysis and regulating mechanisms of ScTB1 in future.

Key words Sugarcane； Tillering； TB1 gene； Cloning； Bioinformatics analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.010

甘蔗（Saccharum spp.）是主產(chǎn)于熱帶和亞熱帶區(qū)域的重要糖料經(jīng)濟(jì)作物，全世界近80%以上的食糖來自于甘蔗。此外，甘蔗還因蘊(yùn)含較高的生物量而成為世界上最重要的能源作物之一[1-2]。甘蔗屬無性繁殖作物，蔗莖為其主要收獲產(chǎn)品，主要由單一的主莖和有效分蘗莖組成，其中有效分蘗莖數(shù)量的多少對于甘蔗最終產(chǎn)量的大小具有重要影響，由此可見，分蘗性狀表現(xiàn)對于甘蔗產(chǎn)量具有舉足輕重的作用。而從甘蔗分蘗性狀著手，研究其分子基礎(chǔ)，對于利用分蘗性狀改良甘蔗品種產(chǎn)量具有重要意義。

TB1（TEOSINTE BRANCHED 1）基因，是一個作用于獨(dú)腳金內(nèi)酯（Strigolactones， SLs）下游的基因，屬植物所特有的TCP家族轉(zhuǎn)錄因子，編碼含有不典型的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)（non-canonical basic-Helix-Loop-Helix strueture，bHLH）的DNA結(jié)合蛋白，主要在分生組織中起作用，與細(xì)胞分化和生長有很大的關(guān)系[3]。研究發(fā)現(xiàn)，TB1對禾本科植物側(cè)枝的發(fā)生有著重要的作用，是多條信號調(diào)節(jié)通路的一個節(jié)點(diǎn)，它和上下游基因互作共同參與禾本科植物分蘗性狀的調(diào)控[4-6]。TB1最先從玉米中克隆出來[4]，后又在水稻[7]、高粱[8]、擬南芥[9]等作物中克隆出其同源基因并進(jìn)行了功能分析，結(jié)果表明TB1在單子葉植物和雙子葉植物中結(jié)構(gòu)和功能方面都表現(xiàn)出高度的保守性。目前有關(guān)甘蔗TB1基因的研究報道還十分少，Pribil等[10]曾在研究報道中簡單提到轉(zhuǎn)入水稻或甘蔗TB1基因的轉(zhuǎn)基因甘蔗株高有顯著增加，但分蘗數(shù)有所降低；Aitken[11]等檢測了一個從甘蔗TB1基因EST序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記對甘蔗分蘗性狀影響的效應(yīng)較??；而關(guān)于甘蔗TB1基因的結(jié)構(gòu)和功能尚不清楚，限制了利用甘蔗TB1基因調(diào)控甘蔗品種分蘗性狀表現(xiàn)、形態(tài)建成和產(chǎn)量改良。鑒于TB1基因在植物分枝（蘗）調(diào)控中的重要作用和在甘蔗研究中的滯后，本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆到甘蔗TB1基因（ScTB1），并對其開展生物信息學(xué)分析，以期初步探索ScTB1的結(jié)構(gòu)和功能，為后續(xù)該基因的功能解析、分子調(diào)控機(jī)制研究和分子輔助育種利用奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以國內(nèi)甘蔗主栽品種新臺糖22號（ROC22）為研究材料，選分蘗盛期的分蘗苗莖尖組織部位，用于后續(xù)RNA的提取，所有研究材料由國家甘蔗種質(zhì)資源圃提供。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 取甘蔗品種ROC22分蘗苗莖尖新鮮組織于液氮中迅速研磨成粉末，使用全式金TransZolTM Plant RNA提取試劑盒提取總RNA，并用1.0%的瓊脂糖凝膠和Bio Drop Lite PC超微量可見紫外分光光度計(jì)檢測RNA質(zhì)量和濃度，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Trans Script One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因克隆 （1）基因片段擴(kuò)增。使用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)水稻、玉米、高粱等作物TB1基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)RT-PCR引物：ScTB1-113-F和ScTB1-815-R（見表1）。以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，使用Trans Taq DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)片段，并用pEASY-T5 Zero Cloning Kit進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選取5個克隆交由深圳華大基因研究院測序，測序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對分析。

（2）RACE擴(kuò)增ScTB1 3′和5′端。以比對正確的克隆序列為模板，設(shè)計(jì)3′和5′ RACE基因特異引物（GSP）（見表1），使用SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得5′ RACE cDNA和3′ RACE cDNA模板，按照試劑盒說明書進(jìn)行5′ RACE和3′ RACE產(chǎn)物PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收、連接轉(zhuǎn)化、測序和序列比對同上。使用Vector NTI 11.5軟件將基因片段與比對正確的RACE產(chǎn)物序列拼接得到甘蔗ScTB1 cDNA全長序列，根據(jù)所拼接的cDNA序列的編碼區(qū)外側(cè)設(shè)計(jì)引物ScTB1-131-F和ScTB1-1609-R擴(kuò)增真實(shí)的ScTB1編碼區(qū)序列，測序分析進(jìn)一步驗(yàn)證拼接序列的正確性。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 首先利用在線工具ORF Finder查找所得序列的開放閱讀框（ORF）；然后使用ExPASy服務(wù)器中的ProtScale和ProtParam軟件、SOP-MA在線軟件、PSORT軟件、ProtFun軟件、TMHMM軟件和SIGNA-IP軟件分別預(yù)測ScTB1的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、功能、跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽；再通過DNAMAN和MEGA等生物學(xué)軟件對TB1同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取及ScTB1基因片段擴(kuò)增

總RNA提取后電泳結(jié)果顯示3條完整的條帶（如圖1-A）， OD260/280在1.98～2.00之間，OD260/230在2.00～2.20間，表明所提RNA質(zhì)量完整，鹽離子去除干凈，符合實(shí)驗(yàn)要求。RT-PCR產(chǎn)物電泳后在750 bp上下處有一條帶（圖1-B），回收克隆測序并比對分析證實(shí)其為ScTB1基因的部分片段，長706 bp。

2.2 RACE擴(kuò)增ScTB1基因3'端和5'端

ScTB1 RACE結(jié)果如圖2所示，3′ RACE經(jīng)兩輪PCR反應(yīng)在500 bp附近出現(xiàn)2條條帶（圖2-B），大片段回收測序比對后為ScTB1基因的3′端序列，長度為479 bp。5′ RACE經(jīng)兩輪PCR反應(yīng)在700 bp左右出現(xiàn)一條帶（圖2-D），回收測序比對后為ScTB1基因的5′端序列，長度為670 bp。RT-PCR獲得片段和兩段RACE產(chǎn)物序列拼接后得到ScTB1基因的cDNA全長序列，該序列總長為1 668 bp，包含274 bp的5′ UTR，1 149 bp的CDS和245 bp的3′ UTR。利用cDNA編碼區(qū)全長引物RT-PCR擴(kuò)增得到1條長度為1 478 bp的片段（圖2-E），回收測序比對后為正確序列，證實(shí)所拼接獲得的cDNA序列正確，同時將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號：KP137673.1。

2.3 ScTB1基因序列的生物信息學(xué)分析

2.3.1 ScTB1編碼氨基酸序列結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分析

通過在線工具找到ScTB1中最大的ORF并翻譯成氨基酸序列，如圖3所示。該ORF長1 149 bp，共編碼382個氨基酸，其中包括SP、TCP、R 3個保守結(jié)構(gòu)域（圖3中加下劃線部分即為相應(yīng)結(jié)構(gòu)域），其中R域可能形成一個親水性α螺旋，這與Lukens等[12]的研究報道一致。

ScTB1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果表明該蛋白不穩(wěn)定，不穩(wěn)定系數(shù)為50.51；平均疏水性為-0.621，推測其可能是親水性氨基酸[13]，其親/疏水信號如圖4，圖4中峰值分布在-0.5以下的比分布在0.5以上的多，再次表明該蛋白為親水性蛋白。

2.3.2 ScTB1蛋白亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽預(yù)測 ScTB1蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)、線粒體基質(zhì)和溶酶體，其概率分別為0.650、0.100和0.100，分布在細(xì)胞質(zhì)的可能性較大。跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測結(jié)果（圖5、6）表明ScTB1不存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，可初步判斷ScTB1不屬于膜蛋白也不屬于分泌蛋白，因而可能定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器基質(zhì)中，這與上述亞細(xì)胞定位結(jié)果相吻合。

2.3.3 ScTB1的二級結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測 ScTB1的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖7所示，該蛋白主要由 α 螺旋（h）、延伸鏈（e）和無規(guī)則卷曲（c）構(gòu)成，其中無規(guī)則卷曲最多（53.93%），α螺旋次之（37.17%），延伸鏈最少（8.90%）。ScTB1功能預(yù)測結(jié)果表明，該基因行使復(fù)制和轉(zhuǎn)錄作用概率為0.373，調(diào)控作用概率為0.257，參與中心代謝的概率為0.153，參與翻譯的概率為0.077，推測其可能為轉(zhuǎn)錄因子。

2.3.4 ScTB1同源性分析 為了進(jìn)一步明確ScTB1的功能，了解它與其他植物TB1同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，筆者選擇了高粱（GenBank： XP_002466597.1、AAK37490.1、AAK37494.1和AAK37483.1）、玉米（AAL17103.1）、Chionachne koenigii（GenBank：AAK37504.1）、Tripsacum cundinamarcae（GenBank： AAK37480.1）、薏苡（Coix lacryma-jobi）（AAK37484.1）等幾種植物TB1蛋白序列與ScTB1蛋白序列進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果見圖8，發(fā)現(xiàn)它們在保守結(jié)構(gòu)域上氨基酸相似度很高，非保守結(jié)構(gòu)域上存在一定變化。

TCP家族轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)功能、進(jìn)化差異等可分為兩個亞家族（CYC/TB1和PCFs），CYC/TB1亞族與植物頂端優(yōu)勢的維持和分蘗發(fā)生密切相關(guān)，PCFs亞族主要參與植物細(xì)胞周期調(diào)控[14]。本研究使用MEGA 6.06軟件，選擇鄰接法構(gòu)建了竹類、水稻、小麥、擬南芥等植物TCP家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖9）。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹，可將25個TCP家族蛋白聚為明顯的兩個大類群（clusterⅠ和clusterⅡ），大類群下又可聚為不同的亞類群，而且多數(shù)類群bootstrap值超過90%。ClusterⅠ主要由CYC/TB1亞家族蛋白組成，內(nèi)部又可分為兩個亞類，第1亞類主要由竹類、高粱、玉米、甘蔗、小麥和水稻等禾本科植物TB1家族蛋白組成，第2亞類主要由擬南芥、菊類的部分TCP家族基因組成。clusterⅡ主要由以水稻PCF1、PCF2和擬南芥部分TCP轉(zhuǎn)錄因子為代表的PCFs亞家族蛋白組成。ScTB1蛋白被歸到clusterⅠ類群，與高粱TB1和玉米TB1聚為一個亞類，并得到99%的bootstrap，因此屬于CYC/TB1亞族，由此推測ScTB1可能參與了植物頂端優(yōu)勢的維持和分蘗性狀的調(diào)控。

3 討論與結(jié)論

分蘗性狀是甘蔗品種重要的農(nóng)藝性狀，對于最終產(chǎn)量的形成具有重要作用，因此挖掘調(diào)控甘蔗分蘗性狀表現(xiàn)的基因，對于利用基因工程和分子育種手段精準(zhǔn)調(diào)控甘蔗有效分蘗莖數(shù)和理想株型的塑造都具有重要意義，本研究旨在初步預(yù)測ScTB1的結(jié)構(gòu)和功能，以期最終闡明其功能后通過基因沉默等分子技術(shù)將其運(yùn)用于甘蔗生產(chǎn)。TB1屬于TCP家族蛋白，是調(diào)控植物分枝（蘗）的關(guān)鍵調(diào)控基因[4-9]。TCP家族蛋白屬植物特有轉(zhuǎn)錄因子，含有不典型bHLH DNA結(jié)合蛋白，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能可將TCP家族分為兩個亞家族（CYC/TB1和PCF），CYC/TB1亞家族主要參與植物器官形態(tài)建成，PCF亞家族參與細(xì)胞周期調(diào)控[14]。TCP家族具SP、TCP和R結(jié)構(gòu)域，其中TCP和SP結(jié)構(gòu)域?yàn)閮蓚€亞家族共有，而R結(jié)構(gòu)域僅存在于CYC/TB1亞家族的某些基因當(dāng)中[3]。本研究克隆到的ScTB1編碼蛋白含有R結(jié)構(gòu)域，顯然屬于CYC/TB1亞族，在系統(tǒng)進(jìn)化上，其與玉米、水稻、高粱等TB1蛋白聚為一類，也初步證實(shí)筆者克隆的ScTB1屬于CYC/TB1亞族。

文中對ScTB1進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示其主要可能定位于細(xì)胞質(zhì)，這與其屬于轉(zhuǎn)錄因子這一說法似乎矛盾，但軟件預(yù)測結(jié)果只能作為初步參考，而且李超[15]碩士論文中也明確指出TCP家族蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的分布較細(xì)胞核中多，說明預(yù)測結(jié)果也具備一定參考性。此外，李超[15]論文中也指出TCP結(jié)構(gòu)域的堿性區(qū)域包含一個核定位信號，所以，TB1蛋白也可能定位于細(xì)胞核中，與其屬于轉(zhuǎn)錄因子一說吻合。生物信息學(xué)分析結(jié)果只是一個初步的預(yù)測，具體亞細(xì)胞定位還有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

前人研究表明TB1基因與分蘗的發(fā)生密切相關(guān)[16]，Doebley等[17]和Hubbard等[18]研究表明TB1基因在玉米葉腋分生組織表達(dá)，抑制側(cè)芽的生長。水稻OsTB1基因過表達(dá)植株表現(xiàn)出分蘗芽萌發(fā)受抑制和分蘗莖明顯減少現(xiàn)象[7]，玉米、小麥TB1基因在水稻中過表達(dá)水稻也表現(xiàn)出分蘗減少的現(xiàn)象[6]。Kebrom等[8]針對高粱TB1基因的功能分析也表明SbTB1對高粱分蘗芽的萌發(fā)具有明顯的抑制作用。本研究所克隆的ScTB1基因與高粱、玉米和水稻的TB1在基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出較高的保守性，系統(tǒng)進(jìn)化樹上聚為較為緊密的一類，加之TB1蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測等可初步推測ScTB1可能參與了甘蔗分蘗性狀的調(diào)控，該作用機(jī)制將在后續(xù)的功能分析中得到驗(yàn)證。

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