乳酸和氫鹽水聯(lián)合后適應(yīng)減輕心肌細(xì)胞凋亡

張國(guó)明 劉科衛(wèi) 李曉燕 許琳 孫媛媛 談紅 沈虹 王曉菲

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.014

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（30740080）;濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院院長(zhǎng)青年基金（2011Q08）

作者單位： 250031 濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科（張國(guó)明、劉科衛(wèi)、李曉燕、許琳、談紅、沈虹），超聲科（孫媛媛），聯(lián)勤部門診部（王曉菲）

通信作者： 談紅，Email：tanhongpaper@126.com

【摘要】目的 探討乳酸和飽和氫鹽水能否模擬后適應(yīng)通過絲裂原活化蛋白激酶途徑（MAPK）減輕心肌細(xì)胞凋亡。方法 在濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院108 只SD大鼠隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為假手術(shù)組、缺血-再灌注組（R/I組， 移除球囊后立即在缺血部位分三點(diǎn)注射生理鹽水共計(jì)60 μL，而后持續(xù)再灌注）、后適應(yīng)組（M-Post組，后適應(yīng)處理方案為20/20 s×4， 移除球囊后立即在缺血部位分三點(diǎn)注射生理鹽水共計(jì)60 μL，而后持續(xù)再灌注）、乳酸組（Lac組，再灌注即刻微量注射器在缺血心肌部位分三點(diǎn)注射乳酸60 μL，而后持續(xù)再灌注）、飽和氫鹽水組（Hyd組，再灌注即刻微量注射器在缺血心肌部位分三點(diǎn)注射氫鹽水60 μL，而后持續(xù)再灌注）、乳酸+飽和氫鹽水組（Lac+Hyd組，再灌注即刻微量注射器在缺血心肌部位分三點(diǎn)注射乳酸和氫鹽水各60 μL，而后持續(xù)再灌注），每組18只。心肌缺血45 min制作急性心肌梗死模型，測(cè)定每只大鼠再灌注3 min后右心房血漿pH值。再灌注3 min后每組取6只處死，取心肌組織采用硫代巴比妥酸法和分光光度計(jì)法測(cè)定心肌組織MDA含量和SOD活性。另再灌注30 min后每組取6只處死，取心肌組織用Western blot方法分別測(cè)定磷酸化MAPK（p38/JNK 和ERK）、TNF-α、Caspase-8的表達(dá)。另再灌注24 h后各組剩余6只大鼠測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)，處死后取心臟進(jìn)行TUNEL凋亡檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，如組間差異顯著則兩兩比較應(yīng)用q檢驗(yàn)。結(jié)果 Lac+Hyd組再灌注后3 min 右心房血漿pH值顯著低于R/I組（7.32±0.06）vs.（7.43±0.03），P<0.05;MDA含量顯著低于R/I組（1.14±0.16）nmol/mgpro vs.（1.56±0.21）nmol/mgpro，P<0.05;SOD含量顯著高于R/I組（57.92±15.12）U/mgpro vs.（35.48±12.46）U/mgpro，P<0.05。Lac+Hyd組再灌注30 min后心肌組織P-p38（0.46±0.06）vs.（2.18±0.32）， P<0.05;和P-JNK含量（0.59±0.03）vs.（1.62±0.29）， P<0.05，顯著低于R/I 組，TNF-α含量（0.34±0.08）vs.（1.78±0.31）， P<0.05;和Caspase-8含量（0.31±0.07）vs.（1.52±0.28）， P<0.05，均顯著低于R/I 組;心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于R/I組（9.50±1.51）% vs.（15.21±1.91）%， P<0.05。以上指標(biāo)均與M-Post組相比均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。再灌注30 min后缺血心肌組織P-ERK含量Lac+Hyd組與R/I組相似（0.55±0.13）vs.（0.57±0.05），P>0.05;Hyd組顯著低于R/I組（0.30±0.09）vs.（0.57±0.05），P<0.05;Lac、Hyd和Lac+Hyd組P-ERK表達(dá)均顯著低于M-Post組（1.21±0.13），（0.30±0.09），（0.55±0.13）vs.（1.96±0.39），P<0.05。結(jié)論 乳酸和飽和氫鹽水聯(lián)合使用可較好模擬后適應(yīng)上游觸發(fā)因子，抑制p38/JNK和ERK的磷酸化，減輕心肌細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 凋亡;藥物后適應(yīng);乳酸;氫鹽水;再灌注損傷;絲裂原活化蛋白激酶

Pharmacological post-conditioning with lactic acid and saturated hydrogen saline could attenuate myocardial apoptosis

Zhang Guoming，Liu Kewei，Li Xiaoyan，Xu Ling，Sun Yuanyuan， Tan Hong， Shen Hong， Wang Xiaofei.Department of Cardiology， the General Hospital of Jinan Military Command， Jinan 250031，China

Corresponding author：Tan Hong，Email：tanhongpaper@126.com

【Abstract】Objective To study the hypothesis about the pharmacological post-conditioning with lactic acid and saturated hydrogen saline after ischemic injury of myocardium instead of post-conditioning with mechanical dilatation of severely occluded coronary vessels to attenuate apoptosis of cardiocyte by mitogen-activated protein kinases （MAPK） pathway. Methods A total of 108 rats were randomly（random number） divided into 6 groups （n=18 in each group）： sham operated group （received 60 μL normal saline without ischemia）， reperfusion/injury group（R/I， received 60 μL normal saline solution and routine ischemic-reperfusion [IR] procedure）， post-conditioning group （M-Post， received 60 μL normal saline and post-conditioning treatment， 4 cycles of 20/20 s of reperfusion/re-occlusion）， lactic acid group （Lac， received 60 μL lactic acid and routine IR procedure）， saturated hydrogen saline group （Hyd， received 60 μL hydrogen rich saline and routine IR procedure）， and lactic acid + saturated hydrogen saline group （Lac+Hyd， received a combination of 60 μL of lactic acid and 60 μL of hydrogen rich saline along with routine IR procedure）. Acute myocardial infarction model was made by ischemia for 45 min， and pH value of blood from right atrium was detected in rats of all groups. After 3 min reperfusion， 6 rats of each group were sacrificed and myocardial tissue was taken out to measure the level of MDA and SOD. After 30 min reperfusion， other 6 rats of each group were sacrificed and myocardial tissue was taken out to measure the level of phosphorylated MAPK （p38/JNK and ERK）， TNF- α， Caspase-8 by Western-blot method. After 24 h reperfusion， there were only 6 rats in each group， and hemodynamics were measured in each rat， and then rats were sacrificed and hearts were taken out to detect cell apoptosis by TUNEL method. A one-way analysis of variance （ANOVA） was used， and q tests were employed to determine if any significant differences in individual variable existed between groups.Results The pH of blood from right atrium after 3 min of reperfusion in Lac+Hyd group was significantly lower than that in R/I group （7.32±0.06 vs. 7.43±0.03，P<0.05）， the content of MDA was lower（1.14±0.16 vs.1.56±0.21，P<0.05）and the content of SOD was higher in Lac+Hyd group than those in R/I group （57.92±15.12 vs.35.48±12.46，P<0.05）. Apoptotic index of Lac+Hyd group was much lower than that of R/I group （9.50±1.51）% vs. （15.21±1.91）%， P<0.05. After 30 min of reperfusion， the level of P-p38 in ischemic myocardia in Lac+Hyd group was significantly lower than that in R/I group （0.46±0.06 vs.2.18±0.32， P<0.05）， the levels of P-JNK （0.59±0.03 vs.1.62±0.29， P<0.05）， TNFα （0.34±0.08 vs.1.78±0.31， P<0.05） and Caspase-8 （0.31±0.07 vs.1.52±0.28， P<0.05） were all lower than those in R/I group. However， there were no significant differences in levels of all above variables between Lac+Hyd group and M-Post group（P>0.05）. After 30 min of reperfusion， there was no significant difference in the level of P-ERK between Lac+Hyd group and R/I group （0.55±0.13 vs.0.57±0.05， P>0.05），and the level of P-ERK in Hyd group was significantly lower than that in R/I group（0.30±0.09 vs.0.57±0.05， P<0.05）， And the level of P-ERK in Lac、Hyd and Lac+Hyd groups was significantly lower than that in M-Post group （1.21±0.13，0.30±0.09， 0.55±0.13 vs.1.96±0.39， P<0.05）.Conclusion Pharmacological post-conditioning with lactic acid and saturated hydrogen saline could be used instead of mechanical post-conditioning to inhibit the phosphorylation of p38/JNK and ERK， attenuating myocardial cell apoptosis.

【Key words】Apoptosis;Pharmacological postconditioning;Lactic acid;Hydrogen;Reperfusion injury;Mitogen activated protein kinase

再灌注治療是影響急性心肌梗死急診介入和溶栓治療療效的重要因素，Zhao等[1]發(fā)現(xiàn)的缺血后適應(yīng)可有效降低心肌梗死面積、減輕細(xì)胞凋亡、改善血管內(nèi)皮功能，在多種屬研究中均發(fā)現(xiàn)后適應(yīng)具有保護(hù)作用[2-6]。但在臨床應(yīng)用中，閉塞部位反復(fù)機(jī)械擴(kuò)張和堵塞，容易導(dǎo)致冠脈斑塊碎裂、遠(yuǎn)端栓塞乃至冠脈夾層等并發(fā)癥，存在一定風(fēng)險(xiǎn)。故國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出了藥物后適應(yīng)的概念，即使用藥物模擬機(jī)械后適應(yīng)的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，無需機(jī)械刺激卻發(fā)揮同樣的心肌保護(hù)作用。

機(jī)械后適應(yīng)的最上游觸發(fā)因子目前尚未完全明確Penna 等[7]和Cohen等[8]提出的酸中毒和適量氧自由基假說引起了學(xué)者關(guān)注。既往研究發(fā)現(xiàn)在缺血心肌局部注射乳酸可較好模擬心肌酸中毒[9];另外，近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)氫氣可有效清除羥自由基（·OH）和過氧亞硝基陰離子（ONOO^-），而對(duì)超氧負(fù)離子（O₂^-）和雙氧水（H₂O₂）等無抑制作用[10-13]。造成組織損傷的自由基主要是羥自由基和過氧亞硝基陰離子，而超氧負(fù)離子和雙氧水可激活多條細(xì)胞保護(hù)通路。因此本研究擬在活體大鼠急性心肌梗死再灌注模型中，使用乳酸和飽和氫鹽水模擬Cohen提出的觸發(fā)因子，并重點(diǎn)觀察上述藥物對(duì)心肌細(xì)胞凋亡以及MAPK 途徑的影響，以進(jìn)一步探討后適應(yīng)保護(hù)機(jī)制的上游觸發(fā)因子。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

1.1.1 實(shí)驗(yàn)分組 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠108 只，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為6 組。（1）假手術(shù)組（Sham）：開胸并分離左冠狀動(dòng)脈，穿線但不結(jié)扎，曠置45 min后在心臟前壁注射生理鹽水60 μL;（2）缺血-再灌注組（R/I）：缺血45 min后將壓力泵壓力調(diào)至0 atm（1 atm=101.325 Pa），移除球囊后立即在缺血部位分三點(diǎn)注射生理鹽水共計(jì)60 μL，而后持續(xù)再灌注;（3）后適應(yīng)組（M-Post）：缺血45 min后、再灌注前通過球囊放氣-充盈實(shí)現(xiàn)再灌注和缺血反復(fù)4 輪，其時(shí)間為20/20 s×4，移除球囊后立即在缺血部位分三點(diǎn)注射生理鹽水共計(jì)60 μL，而后持續(xù)再灌注;（4）乳酸組（Lac）：缺血45 min移除球囊后，立即在缺血部位分三點(diǎn)注射乳酸共計(jì)60 μL，而后持續(xù)再灌注;（5）氫飽和鹽水組（Hyd）：缺血45 min移除球囊后，立即在缺血部位分三點(diǎn)注射氫飽和鹽水60 μL，而后持續(xù)再灌注;（6）乳酸+氫飽和鹽水組（Lac+Hyd）：缺血45 min移除球囊后，立即在缺血部位分三點(diǎn)注射乳酸和氫飽和鹽水稀釋液各60 μL，而后持續(xù)再灌注。

1.1.2 模型制備 大鼠稱質(zhì)量后腹腔注射麻醉（2%戊巴比妥鈉， 0.23 mL/100 g），氣管插管成功后呼吸機(jī)輔助呼吸（HX-200 型小動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量 30 mL/ kg ，頻率50～60 次/min ，吸呼比1∶2）開胸顯示心臟后，于左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐間用5-0無創(chuàng)帶針縫合線穿過前降支深部，將后擴(kuò)張冠脈球囊墊于血管與結(jié)扎線之間用力結(jié)扎（Grip，3.0×12 mm，Acrostak 公司，瑞士，壓力調(diào)為1 atm），而后迅速調(diào)整為12 atm。45 min后壓力迅速減為0 atm，根據(jù)分組給予不同處理。再灌注3 min后以1 mL注射器抽取右心房血液0.5 mL，立即使用血?dú)夥治鰞x測(cè)定pH值。術(shù)后24 h再次麻醉后經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入左心室導(dǎo)管，使用生物信號(hào)及壓力測(cè)試系統(tǒng)監(jiān)測(cè)主動(dòng)脈及左心室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。最后通過頸動(dòng)脈插管抽取血3～4 mL，處死大鼠取心臟，準(zhǔn)備行心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)。另術(shù)后30 min每組各取6只大鼠直接處死取左心室缺血心肌組織冷凍后，擬行Western blot檢測(cè)。

1.1.3 主要試劑 乳酸（北京化學(xué)試劑公司，中國(guó)）為分析純產(chǎn)品，注射前使用4 mol/L NaOH滴定pH至5.5備用;氫氣飽和鹽水按文獻(xiàn)[14]方法制作， 將高壓氫氣（輸出壓力0.4 MPa）通人0.9%氯化鈉6 h以達(dá)到飽和，4 ℃保存，3 d內(nèi)使用;注射用生理鹽水使用4 mol/L NaOH滴定pH至7.4備用。微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物岐化酶（superoxide dismutase ，SOD）試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司。凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司（美國(guó)）。P-ERK、P-p38、P-JNK、TNF-α、Caspase-8多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司（美國(guó)），相應(yīng)二抗購(gòu)自Amersham公司（瑞典）。

1.1.4 指標(biāo)測(cè)定 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)：再灌注后24 h大鼠腹腔注射麻醉后，經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入左心室導(dǎo)管，使用生物信號(hào)及壓力測(cè)試系統(tǒng)描記頸動(dòng)脈和左心室壓力曲線，以MFL lab 200軟件分析心率、平均主動(dòng)脈壓（mean artery pressure， MAP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dt_max）和左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dt_max）。

血漿pH值測(cè)定：再灌注3 min后，以1 mL注射器抽取右心房血液0.5 mL，立即使用血?dú)夥治鰞x測(cè)定pH值，同時(shí)無菌棉球填塞止血。

缺血心肌組織丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定：分別采用硫代巴比妥酸法和分光光度計(jì)法測(cè)定心肌組織MDA含量和SOD活性，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的檢測(cè)：處死大鼠取缺血心肌組織置于中性甲醛固定24 h， 常規(guī)石蠟包埋， 用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的 dUTP 缺口末端標(biāo)記法進(jìn)行心肌組織切片細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)。每張切片于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域各取5個(gè)高倍視野，計(jì)算平均每100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，并以百分?jǐn)?shù)（%）表示心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

既往研究發(fā)現(xiàn)缺血后適應(yīng)可通過MAPK途徑發(fā)揮保護(hù)作用，后適應(yīng)可增強(qiáng)ERK磷酸化，抑制p38和JNK的磷酸化[15-18]，繼而通過抑制TNF-α進(jìn)一步抑制NF-κB等，從而抑制凋亡信號(hào)瀑布的激活[19]。本研究發(fā)現(xiàn)Lac+Hyd組P-p38/JNK濃度顯著低于R/I組，同M-Post組相似，上述結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了乳酸和氫鹽水組合模擬機(jī)械后適應(yīng)的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。但Lac+Hyd組P-ERK較M-Post組顯著降低，同R/I組相似;同時(shí)Hyd組P-ERK顯著低于R/I組，以上結(jié)果同Cardinal等[20]關(guān)于氫氣對(duì)ERK磷酸化的影響相一致。雖P-ERK的激活上同機(jī)械后適應(yīng)不同，但在下游TNF-α、Caspase-8表達(dá)方面，Lac+Hyd組同M-Post組相似，最終凋亡指數(shù)也同M-Post組相似。上述結(jié)果再次說明缺血后適應(yīng)和氫鹽水減輕細(xì)胞凋亡機(jī)制的復(fù)雜性。

本研究的不足之處是未能測(cè)定缺血心肌組織的pH值，而是使用右心房血漿pH值作為替代指標(biāo);另外，未能直接測(cè)量羥自由基、超氧陰離子和雙氧水的濃度，未能直接判斷其對(duì)下游信號(hào)分子的影響，這也是本研究的不足之處。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)乳酸和飽和氫鹽水聯(lián)合使用可較好模擬機(jī)械后適應(yīng)的上游觸發(fā)因子，有效減輕心肌細(xì)胞凋亡;但會(huì)抑制ERK的磷酸化，故具體保護(hù)機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2014-07-21）

（本文編輯：鄭辛甜）

P293-296