孫曉晨　孫磊磊　李小東

【摘要】 目的：克隆大鼠膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）的全長(zhǎng)基因，并構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。方法：運(yùn)用已合成的GDNFcDNA，加入自行設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增GDNF基因，并與質(zhì)粒pEGFP-C3連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。結(jié)果：PCR擴(kuò)增的目的基因?yàn)?30bp，對(duì)構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒雙切酶電泳及測(cè)序證明基因片段為630bp。 結(jié)論：正確克隆了GDNF基因并成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，為下一步進(jìn)行載體介導(dǎo)的體內(nèi)轉(zhuǎn)基因奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子； 載體； 克隆

【中圖分類號(hào)】R562.21 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2015）02-0101-01

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）是1993年Lin等從大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞B49中純化獲得的一種新型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，化學(xué)結(jié)構(gòu)為糖蛋白，并發(fā)現(xiàn)它具有促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元存活的功能[1] . Lin LFH，Doherty DH，Lile JD，et al.GDNF：a glial cell line-derived neurotrophic factor for midobrai dopaminergic neurons.[J].Science，1993，260（5111）：1130-1132]，后來進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)運(yùn)功、感覺等多種神經(jīng)元有營(yíng)養(yǎng)作用。Oorschot等研究發(fā)現(xiàn)GDNF對(duì)培養(yǎng)的大鼠胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活具有重要作用，其效應(yīng)分別是腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）和人類膽堿能分泌因子-白血病抑制因子（CDF/LIF）的75倍，650倍，和2500倍[2] Oorschot DE，Mclennan IS.The trophic requirements of mature motoneurons.[J].Brain Res，1998，789（2）：315-321]，Annette等發(fā)現(xiàn)GDNF在胚胎期可以促進(jìn)感覺神經(jīng)元軸突的發(fā)育，在成熟期可以促進(jìn)軸突的延長(zhǎng)[3] Annette Markus，Tushar D，Patel，William D.Snider. Neurotrophic factors and axonal growth[J].Curr Opin Neurobiol，2002，12（5）：523-53]。由于其對(duì)神經(jīng)的營(yíng)養(yǎng)作用，目前被應(yīng)用到腦缺血，帕金森病等的研究中。后來，在研究疼痛的過程中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)神經(jīng)源性疼痛具有強(qiáng)烈的鎮(zhèn)痛與抑痛作用。但由于其在腦組織含量低，提取復(fù)雜，價(jià)格昂貴而限制了他的進(jìn)一步引用。為此我們克隆了大鼠的GDNF基因，連于pcDNA3質(zhì)粒，制備了帶有目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，為下一步研究載體介導(dǎo)的GDNF質(zhì)粒的治療作用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1GDNFcDNA菌種與質(zhì)粒

鼠GDNFcDNA及質(zhì)粒pEGFP-C3購自北京泛基諾公司。大腸桿菌JM109由西安交通大學(xué)遺傳學(xué)教研室提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

限制性內(nèi)切酶BamHI，XhoI購自Promega，T4 DNA連接酶、T4DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶及dNTPs均購自華美生物公司，DNA合成試劑盒、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生物工程公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純及西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室自備。

1.2方法

1.2.1鼠GDNFcDNA的擴(kuò)增

參照GeneBank和文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)計(jì)上下游引物，上游：5'-AGGATCCATGAAGTTATGGGATGTCGT-3'，下游：5'-ACTCGAGTCAGATACATCCACACCGTT-3'。由上海生物工程公司代替合成。按PCR試劑盒說明書將無RNA酶水、dNTPs，5×buffer、已合成的上下游引物、25mmolMgSO4加入到置于冰上的0.2ml離心管中反應(yīng)條件，混勻后加入T4 DNA連接酶、T4DNA聚合酶。震蕩10秒混勻，放入PCR儀擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)條件和反應(yīng)體系如下：

樣品于94℃變性5min，加入2U的Taq聚合酶，按下列參數(shù)循環(huán)30次：94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，最后一個(gè)循環(huán)72℃，延伸5min。

結(jié)束后擴(kuò)增樣品在0.8%瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，用DNA marker判斷擴(kuò)增片段的大小。同時(shí)切出GDNFcDNA條帶，用膠回收試劑盒予以回收純化。

1.2.2構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-GDNFcDNA

將回收的GDNFcDNA和載體質(zhì)粒用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢切出DNA條帶用膠回收試劑盒純化后合并，加入T4 DNA連接酶16℃連接過夜

1.2.3轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌、細(xì)菌的擴(kuò)增及質(zhì)粒提取

取上述連接后反應(yīng)液10ul，加感受態(tài)細(xì)菌JM109 100ul冰上放置20min，然后420C熱休克2min， 加1ml LB，37 0C震蕩培養(yǎng)30min， 取100ul涂布到卡那霉素培養(yǎng)平皿上，370C培養(yǎng)過夜。然后挑起單個(gè)克隆接種到5ml LB+Kana培養(yǎng)液中37 0C震蕩培養(yǎng)18小時(shí)提取質(zhì)粒.質(zhì)粒提取方法按質(zhì)粒提取試劑盒操作手冊(cè)中常規(guī)堿裂解法提取。質(zhì)粒命名為pEGFP-GDNG（代號(hào)為C3M-GDNF）。

1.2.4質(zhì)粒的鑒定及pEGFP-GDNF的測(cè)序。

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-GDNF予以雙酶切（BamHI / XhoI）后電泳鑒定及測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 GDNFcDNA PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增結(jié)果

用大鼠的GDNFcDNA中加入設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)，純化后獲得的GDNF片段長(zhǎng)度630bp，與預(yù)期片段長(zhǎng)度相一致，無明顯非特異性擴(kuò)增帶（圖-1）。

2.2 重組質(zhì)粒pEGFP-GDNFcDNA的雙酶切鑒定結(jié)果

將pEGFP-GDNFcDNA用BamHI / XhoI雙酶切，切出GDNAcDNA及pEGFP-C3進(jìn)行電泳（圖-2），pEGFP-GDNFcDNA經(jīng)雙酶切后分別切出GDNFcDNA及載體質(zhì)粒，很據(jù)酶切電泳圖譜，重組質(zhì)粒pEGFP-GDNFcDNA總大小約6.0kb，及雙酶切后切出630bp與5.4kb兩條電泳帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 pEGFP-GDNFcDNA測(cè)序結(jié)果

將最終構(gòu)建成功的pEGFP-GDNFcDNA送交測(cè)序，結(jié)果如圖（圖-3），與GeneBanK結(jié)果一致，測(cè)序正確。

3 討論

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NTFs）在神經(jīng)再生、突觸形成以及神經(jīng)損傷修復(fù)過程中起著重要作用，NTFs由神經(jīng)元及神經(jīng)元支配的靶器官或膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，可以在神經(jīng)軸突中進(jìn)行順行、逆行性轉(zhuǎn)運(yùn)[4] Curtis R，Scherer SS，Somogyi R，Ip NY.Retrograde axonal transport of LIF is increased by peripheral nerve injury：correlation with increased LlF expression in distal nerve.[J].Neuron，1994，12（）：19l-204.，到達(dá)神經(jīng)中樞，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。其中GDNF在促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化和損傷后的修復(fù)方面被認(rèn)為是最有效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[5] Barbara F，Macie JF，Jurgen E，et al.CNS glial are targets for GDNF and neurturin.[J].Histochem Cell Biol，1998，110（2）：595-601.，不僅對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且對(duì)周圍的運(yùn)動(dòng)、感覺和自主神經(jīng)系統(tǒng)也有同樣的作用[[[6] Choir DL，Lin Q，Chang YN，et al.Dopaminergic neurons protected from degeneration by glial cell linedderived neurotrophic factor gene therapy[J].Science，1997，275（5）：838-841.，同時(shí)在防止神經(jīng)元的損傷，損傷后的修復(fù)再生等方面有其他生長(zhǎng)因子無法比擬的作用[7] Hisashi K，Chihoko S，Wen RZ，et al.Induction of glialcell line-derived neurotrophic factor receptor proteins incerebral cortex and striatum after permanent middle cerebral artery occlusion in rat.[J].Brain Research，1999，834（5）：190-195]]。由于GDNF在腦內(nèi)含量較少，單純依賴生物提取無法大量獲得。而且目前在研究GDNF生物學(xué)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中，給藥方式絕大多數(shù)都是脊髓鞘內(nèi)或者蛛網(wǎng)膜下腔局部注射治療。局部注射GDNF有很多缺點(diǎn)：首先注射部位定位困難，一次給藥后很快降解，多次給藥使治療復(fù)雜，增大了創(chuàng)傷和感染的機(jī)會(huì)，而且過量的GDNF注射會(huì)帶來副作用[8] Georgievska B，Kirik D，Bjorklund A，et al. Aberrant sprouting and downregulation of tyrosine hydroxylase in lesioned nigrostriatal dopamine neurons induced by long-lasting overexpression of glial cell line derived neurotrophic factor in the striatum by lentiviral gene transfer.[J].Exp Neurol，2002，177（2）：461-474]，最后由于GDNF是大分子物質(zhì)，難以通過血腦屏障，使得其很難到達(dá)腦內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)作用。因此，學(xué)者們將目光集中到基因治療上，及通過一定的載體將GDNA轉(zhuǎn)入體內(nèi)，使其在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，長(zhǎng)期發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。

基因治療的步驟包括：目的基因的獲得，表達(dá)載體的構(gòu)建，靶細(xì)胞的選擇，將目的基因?qū)氚屑?xì)胞的方法，目的基因在宿主細(xì)胞的表達(dá)。本研究根據(jù)GeneBank報(bào)道的GDNF基因序列，自行設(shè)計(jì)引物，使GDNFcDNA大量擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增的DNA長(zhǎng)630bp，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。接著對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物及脂質(zhì)體進(jìn)行酶切，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-GDNF cDNA。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，GDNF的N末端氨基酸殘基對(duì)其生物活性的維持作用不大[9]Eigenbrot C，Gerber N. X-ray structure of glial cell-derived neurotrophic 1.9 resolution and implications for receptor binding[J].Nat Struct Biol，1997，4：435-438.]]，因此目前絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)是將EGFP基因連接到GDNF基因的5‘端，兩者之間以編碼柔軟肽段的核苷酸連接以保持EGFP與GDNF各自的活性，這樣既保留了GDNF蛋白對(duì)神經(jīng)的營(yíng)養(yǎng)活性，又可以通過EGFP觀察GDNF蛋白在體內(nèi)的表達(dá)[10] Che ZY，He ZY，He C，et al.Human glial cell-derived neurotrophic factor：a [11]structure-function analysis[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，268（3）：692-696..。本實(shí)驗(yàn)同樣將質(zhì)粒連接到GDNF基因的5‘端，為下一步觀察將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞后的生物學(xué)效應(yīng)提供了依據(jù)。但通過該方法構(gòu)建的重組質(zhì)粒在動(dòng)物體內(nèi)是否可以發(fā)揮正常生物學(xué)活性，還需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)。目的基因與載體形成重組體的過程中需要特異性核酸內(nèi)切酶，限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生的是兩種不相同的粘性末端，提高了基因重組技術(shù)中T4 DNA連接酶連接反應(yīng)的效率。及確保GDNFcDNA片段是正向、單倍插入到載體pEGFP-C3中。對(duì)重組質(zhì)粒再次用限制性內(nèi)切酶BamHI 、XhoI雙酶切進(jìn)行雙酶切，根據(jù)電泳條帶重組質(zhì)粒大小6.0Kb，切出的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約630bp，pEGFP-C3大小為5400bp，兩者之和為重組質(zhì)粒的大小，證明通過雙酶切連接后確實(shí)得到了需要的重組質(zhì)粒。抽提質(zhì)粒DNA成功的關(guān)鍵是把染色體DNA、蛋白質(zhì)、RNA去除干凈，獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。由圖-2第3道電泳圖譜可以看出有兩條電泳亮帶，其中分子量小的大約相當(dāng)于3.5kb的條帶可能就是未除去的蛋白質(zhì)或RNA，也有可能是質(zhì)粒酶切不完全導(dǎo)致連接產(chǎn)物中含有空質(zhì)粒。針對(duì)這一問題，我們加強(qiáng)了對(duì)電泳膠帶的回收純化，并應(yīng)用YT豐富的培養(yǎng)基，用多級(jí)培養(yǎng)的方法，在大腸桿菌的培養(yǎng)基內(nèi)挑取一個(gè)單一菌落在接種到一個(gè)新的培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后再次挑取單一菌落接種只新的培養(yǎng)基，如此反復(fù)多次，則可保證提取質(zhì)粒DNA的參量和純度，另外在抽提過程中要把握好變性和復(fù)性的時(shí)機(jī)，使試劑與染色體充分作用變性，又要使染色體DNA不至斷裂與質(zhì)粒DNA相混淆。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是較為常用的一種。其優(yōu)點(diǎn)是遺傳背景比較清楚，表達(dá)水平較穩(wěn)定，易操作，有許多菌株突變體和含強(qiáng)啟動(dòng)子的載體可供選擇，并且成本低、蛋白表達(dá)量高、容易純化等。在重組質(zhì)粒的構(gòu)建中，本實(shí)驗(yàn)是通過化學(xué)法將GDNF和質(zhì)粒連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，感受態(tài)是本實(shí)驗(yàn)室通過CaCl2法制備獲得，將PCR陽性單菌落挑至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，第二天將菌液送西安交通大學(xué)法醫(yī)學(xué)司法鑒定中心代為測(cè)序，結(jié)果表明片段為630bp，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，且未發(fā)生突變。

本研究成功擴(kuò)增大鼠GDNFcDNA基因，并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-GDNFcDNA，經(jīng)雙酶切及測(cè)序證明與文獻(xiàn)報(bào)道一致，未發(fā)生異常突變。GDNF因其具有強(qiáng)大的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，而被越來越多的應(yīng)用到帕金森、腦缺血、脊髓損傷、神經(jīng)痛等的治療和神經(jīng)再生研究中，本課題成功擴(kuò)增并構(gòu)建重組質(zhì)粒，對(duì)于GDNF的基因治療及下一步利用合適的載體介導(dǎo)重組質(zhì)粒在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染，觀察GDNF基因治療的可行性并進(jìn)一步驗(yàn)證該重組質(zhì)粒的活性奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Lin LFH，Doherty DH，Lile JD，et al.GDNF：a glial cell line-derived neurotrophic factor for midobrai dopaminergic neurons.[J].Science，1993，260（5111）：1130-1132

[2]Oorschot DE，Mclennan IS.The trophic requirements of mature motoneurons.[J].Brain Res，1998，789（2）：315-321

[3]Annette Markus，Tushar D，Patel，William D.Snider. Neurotrophic factors and axonal growth[J].Curr Opin Neurobiol，2002，12（5）：523-53

[4]Curtis R，Scherer SS，Somogyi R，Ip NY.Retrograde axonal transport of LIF is increased by peripheral nerve injury：correlation with increased LlF expression in distal nerve.[J].Neuron，1994，12（）：19l-204.

[5]Barbara F，Macie JF，Jurgen E，et al.CNS glial are targets for GDNF and neurturin.[J].Histochem Cell Biol，1998，110（2）：595-601.

[6]Choir DL，Lin Q，Chang YN，et al.Dopaminergic neurons protected from degeneration by glial cell linedderived neurotrophic factor gene therapy[J].Science，1997，275（5）：838-841.

[7]Hisashi K，Chihoko S，Wen RZ，et al.Induction of glialcell line-derived neurotrophic factor receptor proteins incerebral cortex and striatum after permanent middle cerebral artery occlusion in rat.[J].Brain Research，1999，834（5）：190-195

[8]Georgievska B，Kirik D，Bjorklund A，et al. Aberrant sprouting and downregulation of tyrosine hydroxylase in lesioned nigrostriatal dopamine neurons induced by long-lasting overexpression of glial cell line derived neurotrophic factor in the striatum by lentiviral gene transfer.[J].Exp Neurol，2002，177（2）：461-474

[9]Eigenbrot C，Gerber N. X-ray structure of glial cell-derived neurotrophic 1.9 ？ resolution and implications for receptor binding[J].Nat Struct Biol，1997，4：435-438.

[10]Che ZY，He ZY，He C，et al.Human glial cell-derived neurotrophic factor：a [11]structure-function analysis[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，268（3）：692-696.