王小雄 司瑞 邵虹 林晨 王春茹 郭文怡

紅景天苷抑制缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

王小雄 司瑞 邵虹 林晨 王春茹 郭文怡

目的 探討紅景天苷對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）缺血/再灌注損傷的影響及其可能的機(jī)制。方法 分離培養(yǎng)大鼠CMECs，建立模擬缺血/再灌注模型，分為對照組、模擬缺血/再灌注（SI/R）組、SI/R+紅景天苷組（1.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L）組。待紅景天苷最適濃度確認(rèn)為5 μmol/L后，增加SI/R+紅景天苷+LY［磷酯酰肌醇3激酶（PI3k）特異性抑制劑LY294002］組。MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，采用Western blot檢測Akt磷酸化水平，以及凋亡抑制蛋白生存素和Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果 與對照組相比較，SI/R組CMECs增殖能力明顯降低（0.410±0.011比0.200±0.014，P=0.041），凋亡率顯著上升（4.15%± 0.12%比26.05%±0.97%，P=0.018），而與SI/R組相比，SI/R+紅景天苷組（1.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L）細(xì)胞增殖能力明顯升高并呈劑量依賴性，細(xì)胞遷移率，而凋亡率則明顯下降（均為P＜0.05），LY294002組凋亡指數(shù)與SI/R+紅景天苷組相比顯著提高（22.03%±0.98%比16.28%± 1.40%，P=0.029）。與SI/R組相比較，紅景天苷可顯著上調(diào)Akt的磷酸化，以及上調(diào)抗凋亡蛋白生存素和Bcl-2的表達(dá)（均為P＜0.05），而此作用可被LY294002顯著抑制（均為P＜0.05）。結(jié)論 紅景天苷可顯著抑制缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的CMECs凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，改善細(xì)胞功能，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt，以及上調(diào)凋亡抑制蛋白生存素和Bcl-2表達(dá)相關(guān)。

缺血/再灌注損傷； 紅景天苷； 心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

我國急性冠狀動脈綜合征的發(fā)病率逐年增高，且出現(xiàn)年輕化的趨勢。盡快恢復(fù)堵塞血管血流是治療的關(guān)鍵，然而常常伴隨缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/RI），會部分抵消由血管再通治療帶來的臨床受益。研究表明，在心臟I/R時心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（cardiac microvascular endothelial cell，CMECs）也會受累，且I/RI誘導(dǎo)的CMECs凋亡要早于心肌細(xì)胞［1］，提示CMECs扮演著重要角色。

紅景天苷是傳統(tǒng)中藥紅景天的主要有效成分，以往研究表明其具有抗疲勞和抗輻射等多種藥理作用［2］。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其對心臟等多個重要器官具有保護(hù)作用［3-4］，我們前期研究證實紅景天苷可通過激活PI3k/Akt信號通路激活HIF-1a，抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［4］。然而，其對CMECs是否有保護(hù)作用其可能的機(jī)制仍不明確。本研究旨在探討紅景天苷對I/RI誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用，并探討其作用的可能機(jī)制。

1　材料和方法

1.1材料

紅景天苷（純度＞99%）購自中國藥品生物制品鑒定所。新生牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基購自Gibco公司。膠原酶Ⅰ、噻唑藍(lán)（MTY）、5-溴-2'-脫氧尿苷（bromodeoxyuri.dine，BrdU）、LY294002、RNaseA均購自Sigma公司。Hoechst33258染料、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。蛋白酶K購自Merck。Akt、磷酸化Akt、生存素和Bcl-2抗體均購自CST。HRP、FITC標(biāo)記羊抗兔二抗均購自北京中山。

1.2方法

1.2.1CMECs分離培養(yǎng)及鑒定

按照本實驗室建立的常規(guī)方法分離CMECs，免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定，具體步驟見參考文獻(xiàn)［5］，實驗所用細(xì)胞為穩(wěn)定生長的第2～3代細(xì)胞。

1.2.2SI/R模型的建立與分組

模擬缺血/再灌注（simulatedischemia/ reperfusion，SI/R）模型的建立見參考文獻(xiàn)［6］。CMECs隨機(jī)分組：（1）對照組：正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，不加任何干預(yù)；（2）SI/R組；（3）SI/R+紅景天苷組（再灌注時分別給予不同濃度的紅景天苷1.0、2.5、5.0和10.0 μmol/L，SI/R+紅景天苷）。比較各組CMECs細(xì)胞活性，確定最適濃度5 μmol/L后分組如下：（1）對照組；（2）SI/R組；（3）SI/R+5 μmol/L紅景天苷（SI/R+紅景天苷組）；（4）SI/R+紅景天苷+LY組（LY294002，PI3k特異性抑制劑，20 μmol/L。

1.2.3MTT法檢測CMECs的細(xì)胞活性

取同一批分離的CMECs，將細(xì)胞密度調(diào)整至1× 105/ml接種于96孔板，每孔接種100 μl，每組設(shè)8個復(fù)孔待細(xì)胞生長至70%匯合后，按上述方法進(jìn)行分組及造模復(fù)氧結(jié)束后加MTT 20 μl培養(yǎng)4 h，吸棄上清后，每孔加入150 μl DMSO震蕩10 min待結(jié)晶物溶解，用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測各組吸光度值。

1.2.4 細(xì)胞遷移能力測定

取同一批分離的CMECs，細(xì)胞密度調(diào)整至1× 105/ml接種于24孔板，孵育24 h后吸棄培養(yǎng)液，100 μl移液器滴頭沿培養(yǎng)板底劃痕，每孔任選3個視野拍照，記錄劃痕區(qū)的相對距離。按上述方法進(jìn)行隨機(jī)分組，模型建立后繼續(xù)以含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，參照先前拍照方式，記錄各組劃痕后的相對距離，測定CMECs的遷移能力。

1.2.5TUNEL法檢測CMECs的凋亡率

制備細(xì)胞爬片，建立模型后，按照TUNEL試劑盒說明書操作。熒光顯微鏡下觀察并拍照TUNEL染色陽性為凋亡細(xì)胞，呈綠色熒光，DAPI對所有細(xì)胞核進(jìn)行染色，呈藍(lán)色熒光每張爬片隨機(jī)選取10個視野進(jìn)行計數(shù)，每個實驗組計數(shù)80個視野，統(tǒng)計內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，取其平均值A(chǔ)I=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達(dá)

將細(xì)胞重懸至細(xì)胞裂解液中，低溫離心取上清液備用100 ml/L聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂乳的TBST封閉緩沖液中，加入Akt（1∶1 000）或磷酸化Akt抗體（1∶1 000）、生存素抗體（1∶1 500）或Bcl-2抗體（1∶1 500）。4℃孵育過夜加入相應(yīng)二抗，37℃孵育1 h后，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法曝光后觀察結(jié)果，以β肌動蛋白作為內(nèi)參，采用Bio-image（Bio-Rad）分析軟件采集信號和灰度掃描。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1CMECs形態(tài)觀察及鑒定

CMECs分離培養(yǎng)第2天呈梭形或者多角形，培養(yǎng)至第5天呈鋪路石樣排列，單層貼壁生長（圖1A）。免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定，CMECs吞噬紅色熒光標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍缀?，細(xì)胞質(zhì)呈紅色熒光，DAPI染色后細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光（圖1），提示分離培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞，且具有較高的純度，實驗所用細(xì)胞為穩(wěn)定生長的第2～3代細(xì)胞。

圖1　CMECs培養(yǎng)與鑒定

2.2各組CMECs細(xì)胞活性的比較

與對照組相比較，SI/R組的吸光度值明顯下降（0.410± 0.011比0.200±0.014，P= 0.041）。與SI/R相比較，SI/R +紅景天苷（5 μmol/L）組的吸光度值明顯升高（0.350±0.010比0.200±0.014，P=0.037），SI/R組+紅景天苷組中吸光度隨著紅景天苷濃度的升高而增加，顯示經(jīng)紅景天苷刺激后，SI/R組細(xì)胞增殖能力升高有濃度依賴性（圖2），而5 μmol/L與10 μmol/L紅景天苷組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（0.350± 0.010比0.360±0.015，P= 0.976），確定5 μmol/L紅景天苷為最適濃度。

圖2　MTT法檢測CMECs細(xì)胞活性

2.3不同組間CMECs遷移能力的比較見圖3。

圖3　細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力（×100）

2.4 不同組間CMECs凋亡率的比較

與對照組相比較，SI/R組的CMECs凋亡率明顯增加（26.5%±0.97%比4.16%±0.22%，P=0.018）與SI/R相比較，SI/R+紅景天苷（5 μmol/L）組CMECs凋亡率顯著降低（15.78% ±1.07%比26.5%±0.97%，P=0.032）。而加入PI3k特異性抑制劑后與SI/R+紅景天苷相比，細(xì)胞凋亡則增加，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（22.5%±0.87%比15.78%±1.07%，P =0.029）（圖4）。

圖4　TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡（×200）

2.5紅景天苷對PI3K/Akt信號通路活化水平及生存素和Bcl-2的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與SI/R組相比較，紅景天苷可顯著上調(diào)Akt的磷酸化水平（P=0.043）；而是用PI3K特異性抑制劑LY294002后，磷酸化Akt水平顯著下降（P=0.039），見圖5。進(jìn)一步的研究提示紅景天苷可顯著上調(diào)抗凋亡蛋白生存素和Bcl-2表達(dá)水平。前期研究證實上調(diào)抗凋亡蛋白生存素可顯著抑制I/RI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞和心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［7-8］，Western blot結(jié)果表明，與SI/R組比較紅景天苷可顯著上調(diào)生存素和Bcl-2水平（均為P＜0.05），而使用PI3K特異性抑制劑LY294002后，上調(diào)的生存素和Bcl-2明顯被抑制（均為P＜0.05，見圖6）。

圖5　Western blot方法檢測Akt的磷酸化水平

圖6　Western blot方法檢測蛋白生存素、Bcl-2的表達(dá)

3　討論

心肌缺血再灌注損傷臨床較為常見，其機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明［9］，以往研究多集中在心肌細(xì)胞和冠狀動脈大血管的損傷和保護(hù)。然而近期的我們及其他實驗室的研究表明CMECs在I/RI過程中也扮演重要角色［7-8］，與冠狀動脈大血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，CMECs數(shù)量更多，并且在形態(tài)和功能上具有明顯的組織特異性，此外，CMECs同時接觸血液和組織細(xì)胞，接受來自兩方的理化刺激，功能特性更加復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，I/RI在微血管水平的病理變化主要表現(xiàn)為CMECs正常屏障功能損傷和細(xì)胞凋亡［10］，在再灌注早期，CMECs凋亡的發(fā)生早于心肌細(xì)胞［1］，綜上所述提示保護(hù)CMECs可能是早期減輕I/RI的關(guān)鍵。

紅景天是常用的傳統(tǒng)中藥材，紅景天苷是其主要的有效成分，除具有顯著的抗疲勞、抗輻射、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用外，近期的研究顯示對于腦和腎臟等重要臟器的缺血損傷具有顯著的抑制作用［2-3，11］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可通過PI3K/Akt通路激活HIF-1α抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，但紅景天苷是否對于扮演重要角色的CMECs是否有保護(hù)作用，尚未見報道。本研究采用體外培養(yǎng)大鼠CMECs，建立模擬的I/RI模型，從細(xì)胞水平觀察紅景天苷是否能夠保護(hù)CMECs，抑制I/ RI誘導(dǎo)的心肌冠狀動脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時探討其可能的分子機(jī)制。本研究表明，紅景天苷可顯著抑制模擬I/RI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并且MTT檢測結(jié)果表明其保護(hù)作用呈劑量依賴型，而5與10 μmol/L對于改善細(xì)胞活性方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比較，5 μmol/L紅景天苷可顯著改善CMECs的遷移能力，并減少損傷誘導(dǎo)的CMECs凋亡。生存素［7］及Bcl-2是重要的凋亡相關(guān)分子，本研究進(jìn)一步的Western blot結(jié)果提示，紅景天苷可顯著上調(diào)生存素和Bcl-2水平，其作用與激活PI3K/ Akt信號通路相關(guān)。紅景天苷在整體水平的保護(hù)作用，以及是否能激活其他重要凋亡相關(guān)分子如p53或caspase-3等，有待于進(jìn)一步研究探討。

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Protective effects of Salidroside against cardiac microvascular endothelial cell injury induced by ischemia/reperfusion

Wang Xiaoxiong1，Si Rui2，Shao Hong2，Lin Chen2，Wang Chunru1，Guo Wenyi2.1.Department of Cardiology，People's Hospital of Qionghai City，Qionghai 571400，China；2.Department of Cardiology，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an 710032

Guo Wenyi，Email：guowenyi@tom.com

Objective To explore the protective effect of salidroside against ischemia/reperfusion injury of cardiac microvascular endothelial cells（CMECs）and the underlying mechanisms.Methods CMECs isolated from the hearts of adult rats were divided to three groups：Control group，simulated ischemia/reperfusion（SI/R）group and simulated ischemia/reperfusion+Salidroside group.Then added with SI/R+Salidroside+LY（PI3k specific inhibitor LY294002）group after the optimal dose of Salidroside（5 μmol/L）was identified.The cell viability of CMECs was measured by MTT assay and migration ability of CMECs was detected by cell scratch wound assay.The apoptosis of CMECs was detected by TUNEL method.The phosphorylation of Akt and the expression the anti-apoptotic proteins survivin and Bcl-2 were analyzed by Western blot.Results Both of the cell viability and migration ability were impaired after SI/R（P＜0.05 vs.control），and the apoptosis index was increased compared with control group（26.05%±0.97%vs.4.15%±0.12%，P=0.018）.While administration of salidroside during reperfusion dramatically attenuate the dysfunction of CMECs and the apoptosis induced by I/RI（all P＜0.05）.WB assay proved that both phosphorylation of Akt and the expression the anti-apoptotic proteins survivin and Bcl-2 were increased when compared with SI/R group and which were all inhibited when added with LY294002 I（all P＜0.05）.Conclusions Salidroside has protective effect of CMECs against ischemia/reperfusion injury through activating Akt phosphorylation and might related with up-regulation of protein survivin and Bcl-2.

Ischemia/reperfusion injury； Salidroside； Cardiac microvascular endothelial cells；Apoptosis

2014-07-15）

（本文編輯：周白瑜）

10.3969/j.issn.1007-5410.2015.01.013

571400瓊海市人民醫(yī)院（王小雄、王春茹），第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管內(nèi)科（司瑞、邵虹、林晨、郭文怡）

郭文怡，電子信箱：guowenyi@tom.com