張桂濤　陽　勇　李慶昌　何　凱　韓為躍

（廣東聯(lián)康生物與醫(yī)藥研究院，廣東 東莞 523581）

紫外法測(cè)定重組人紅細(xì)胞生成素（Fc）融合蛋白的含量

張桂濤陽勇李慶昌何凱韓為躍

（廣東聯(lián)康生物與醫(yī)藥研究院，廣東 東莞 523581）

目的 建立紫外法測(cè)定重組人紅細(xì)胞生成素（Fc）融合蛋白（rhEPO-Fc）含量的方法。方法 利用Edelhoch法測(cè)定rhEPO-Fc的摩爾消光系數(shù)，計(jì)算得到其溶液百分比消光系數(shù)，并測(cè)定rhEPO-Fc溶液A280值，依據(jù)公式c=A/ε計(jì)算rhEPO-Fc的含量。結(jié)果 rhEPO-Fc溶液百分比消光系數(shù)為1.3，在0.02～1.28 mg/mL濃度范圍內(nèi)，測(cè)定含量結(jié)果偏差＜4%。結(jié)論 該方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于rhEPO-Fc含量測(cè)定。

消光系數(shù)；紅細(xì)胞生成素；融合蛋白

蛋白質(zhì)定量是重組蛋白藥物研究開發(fā)中最基本的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，常用的定量方法包括Bradford、Lowry和HPLC法等，這些方法需要對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，而重組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品一般情況下無法獲取，以前多采用牛血清白蛋白或者人血清白蛋白作為替代標(biāo)準(zhǔn)品用于重組蛋白的含量測(cè)定，但不同蛋白質(zhì)的氨基酸組成不同，其理化性質(zhì)不同，因此用非同質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定蛋白含量偏差比較大，不能準(zhǔn)確反映待測(cè)蛋白的真實(shí)含量。近年來，紫外吸光法已成為FDA、EMA推薦的重組蛋白藥物含量測(cè)定方法之一。在摩爾消光系數(shù)及相對(duì)分子質(zhì)量已知的情況下，僅需要測(cè)定樣品的光吸收值，即可計(jì)算出蛋白濃度，而不需要蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。

目前已知的摩爾消光系數(shù)的測(cè)定有幾種方法，包括dry weight［1］、nitrogen determination［2］和spectral method［3］，這幾種方法都存在蛋白質(zhì)用量大、過程繁瑣等缺點(diǎn)，限制了它們?cè)趯?shí)驗(yàn)室的使用。

rhEPO-Fc為創(chuàng)新蛋白質(zhì)藥物，擬用于腎性貧血治療，該藥物制劑在臨床預(yù)試驗(yàn)中表現(xiàn)出長(zhǎng)效化特征，該蛋白利用EPO融合Fc片段后以同源二聚體形式存在，理論上其半胱氨酸都以二硫鍵形成胱氨酸，因此其變性狀態(tài)下的摩爾消光系數(shù)為111280；而二聚體的氨基酸相對(duì)分子質(zhì)量為88629.2。

本研究中，筆者采用Edelhoch法測(cè)定rhEPO-Fc的摩爾消光系數(shù)，計(jì)算得到其溶液百分比消光系數(shù)，從而依據(jù)公式（1）測(cè)定其蛋白質(zhì)含量；本法具有的優(yōu)點(diǎn)：在確定溶液百分比消光系數(shù)后，不需要任何反應(yīng)，可直接測(cè)定該蛋白溶液的吸收值，從而計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量，操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)性良好且專屬性強(qiáng)。

1　材料與儀器

rhEPO-Fc原液（純度＞95%，自制），脫鹽柱為Amersham Biosciences產(chǎn)品（貨號(hào)：52-13080-00）。紫外分光光度計(jì)（Beckman DU730）。鹽酸胍、氯化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1rhEPO-Fc消光系數(shù)的測(cè)定：將經(jīng)脫鹽得到的rhEPO-Fc水溶液用超純水稀釋3、6、12、24、48倍，分別測(cè)定A280。由于在蛋白溶液中蛋白顆粒會(huì)出現(xiàn)光散射現(xiàn)象，因此必須對(duì)A280進(jìn)行校正，即扣除光散射值A(chǔ)光散射。A光散射的測(cè)定方法是測(cè)定溶液在320、325、330、335、340、345、350 nm波長(zhǎng)處的吸光度，用線性回歸法，以吸光度的對(duì)數(shù)值與其相對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的對(duì)數(shù)值繪圖，獲得最適標(biāo)準(zhǔn)曲線，將此標(biāo)準(zhǔn)曲線外推至280 nm波長(zhǎng)，從而確定A280光散射。同樣，將EPO-Fc蛋白水溶液用相同的稀釋倍數(shù)溶解在6mol/L鹽酸胍溶液中，分別測(cè)定其A280和A280光散射。計(jì)算同一濃度的rhEPO-Fc在水溶液和6mol/L鹽酸胍溶液中紫外吸收值的比值，并利用公式（3）（4）（5）計(jì)算rhEPO-Fc水溶液中的溶液百分比消光系數(shù)。結(jié)果：rhEPO-Fc的消光系數(shù)為1.3，RSD=0.41%，見表1。

表1　溶液百分比消光系數(shù)測(cè)定結(jié)果

2.2溶液百分比消光系數(shù)測(cè)定干擾性試驗(yàn)

2.2.1糖基化對(duì)rhEPO-Fc溶液百分比消光系數(shù)的影響：對(duì)于糖蛋白，雖然單糖分子在280 nm處沒有紫外吸收值，但是其糖鏈組成可能會(huì)影響到蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而影響糖蛋白的紫外吸收值。為了研究糖基化是否對(duì)rhEPO-Fc的消光系數(shù)存在影響，取rhEPO-Fc蛋白原液，用肽N-糖苷酶F酶切N-糖鏈，酶切完成后，蛋白質(zhì)用Protein A柱進(jìn)行純化，去除肽N-糖苷酶F和反應(yīng)緩沖液，用上述方法測(cè)定無糖基化的rhEPO-Fc的溶液百分比消光系數(shù)，結(jié)果為1.2，去除糖基后的rhEPO-Fc消光系數(shù)下降了約7%，這說明糖基化會(huì)影響糖蛋白的消光系數(shù)，但是并不顯著，可能是由于蛋白糖基化后構(gòu)象發(fā)生改變引起。

2.2.2離子強(qiáng)度對(duì)rhEPO-Fc溶液百分比消光系數(shù)的影響：取適量的rhEPO-Fc蛋白水溶液，調(diào)整A280在0.6～1.4，用不同濃度的氯化鈉分別進(jìn)行倍比稀釋，使rhEPO-Fc蛋白溶液中氯化鈉的濃度分別為0、0.25、0.5、1.00、1.50、2.00mol/L，混合靜置2～3min后用分光光度計(jì)分別測(cè)定其A280和A280光散射，校正A280，結(jié)果見表2，rhEPO-Fc蛋白在0.25～2.00mol/L的氯化鈉溶液中A280值變化不大，而且與在0mol/L氯化鈉溶液中相當(dāng)，說明2mol/L以下的氯化鈉不影響蛋白質(zhì)的光吸收值，即不影響其溶液百分比消光系數(shù)。見表2。

表2　rhEPO-Fc在不同濃度氯化鈉中的吸光值

2.3濃度測(cè)定范圍確定：取適量rhEPO-Fc蛋白原液，用超純水稀釋成濃度為1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01 mg/mL，分別測(cè)定其A280和A280光散射。同時(shí)，利用rhEPO-Fc溶液百分比消光系數(shù)計(jì)算理論吸收值，并比較由計(jì)算得到的吸收值相對(duì)于測(cè)定校正吸收值的偏差，結(jié)果見表3，rhEPO-Fc濃度在0.02～1.28 mg/mL范圍檢測(cè)紫外吸收值與計(jì)算吸收值的相對(duì)偏差＜4%，因此，在該濃度范圍內(nèi)，紫外法測(cè)定該rhEPO-Fc含量是可信的。見表3。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)：分別取同批rhEPO-Fc原液5份，分別測(cè)定A280和A280光散射，校正A280，利用公式（1）計(jì)算得到原液含量為0.97 mg/mL，RSD=0.65%（n=5），重復(fù)性良好。

表3　相同濃度rhEPO-Fc測(cè)定校正后A280與c=A/εAbs0.1%計(jì)算A280比較

3　討 論

利用Edelhoch法測(cè)定rhEPO-Fc蛋白的摩爾消光系數(shù)，操作簡(jiǎn)便，可用于rhEPO-Fc含量的測(cè)定。但考慮到消光系數(shù)的專屬性，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確，待檢樣品的純度應(yīng)不低于95%，即所含的目標(biāo)蛋白幾乎為rhEPO-Fc的情況下，計(jì)算的rhEPO-Fc原液含量才更準(zhǔn)確。筆者研究了數(shù)十種蛋白質(zhì)消光系數(shù)發(fā)現(xiàn)，利用Edelhoch法測(cè)定的摩爾消光系數(shù)和直接經(jīng)公式ε=（Trp數(shù)量）×5500+（Tyr數(shù)量）×1490+（cystine數(shù)量）×125計(jì)算的摩爾消光系數(shù)比較，大部分蛋白的偏差都5%左右，少數(shù)蛋白的偏差超過10%，如Rituximab。重組糖蛋白的糖基化程度、糖基化位點(diǎn)及糖基化的類型對(duì)其消光系數(shù)的影響也不盡相同，如rhEPO-Fc脫糖后的消光系數(shù)，相對(duì)于脫糖前下降約7%左右，而Rituximab脫糖前后幾乎無差異。該方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，可用于純度高rhEPO-Fc原液或制劑的定量。

［1］ Hunter MJ.A method for the determination of protein partial secific volum［J］.J Phys Chem，1996，70（10）：3285-3292.

［2］ Jaenicke L.A rapid micromethod for the determination of nitrogen and phosphate in biological material［J］.Anal Biochemis ty，1974，61（4）：623-627.

［3］ Whitaker JR， Granum PE.An absolute method for protein determination based on difference in absorbance at 235 and 280 nm［J］ .Anal Biochem，1980，109（1）：156-159.

R-3

B

1671-8194（2015）10-0065-02

廣東省重大科技專項(xiàng)（重大新藥創(chuàng)制）課題（編號(hào)：2011A080502001）