張圓 周國(guó)旺 李海濤 劉榮梅 趙一夔 高繼國(guó)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱　150030）

蘇云金芽胞桿菌chiA73基因的克隆、表達(dá)和酶活性分析

張圓 周國(guó)旺 李海濤 劉榮梅 趙一夔 高繼國(guó)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

旨在對(duì)蘇云金芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行分子鑒定和酶活測(cè)定，從產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力高的Bt DLD171菌株中提取基因組DNA，通過(guò)PCR法克隆得到幾丁質(zhì)酶chiA73 基因（GenBank登錄號(hào)為KJ508093）。結(jié)果顯示，對(duì)chiA73 基因進(jìn)行表達(dá)，獲得大小約74 kD的表達(dá)產(chǎn)物。用熒光底物對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物只能水解熒光底物4-甲基傘形酮幾丁三糖［4-MU-（GlcNAc）3］，而不能水解4-甲基傘形酮幾丁單糖（4-MU-GlcNAc）。結(jié)果表明，ChiA73為一種內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，在pH值為8、溫度為40℃時(shí)酶活性最高。

蘇云金芽胞桿菌；幾丁質(zhì)酶；chiA73；熒光底物；酶活性

在自然界中，除纖維素外，幾丁質(zhì)是存在最廣泛的有機(jī)化合物。幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GlcNAc）以β-1，4糖苷鍵連接而成的高分子聚合物［1］，它可以與蛋白質(zhì)結(jié)合形成多種組織結(jié)構(gòu)，如許多無(wú)脊椎動(dòng)物的外骨骼、大多數(shù)真菌和藻類的細(xì)胞壁［2］。此外，幾丁質(zhì)蛋白復(fù)合物是圍食膜的重要組成部分，圍食膜是昆蟲(chóng)防止病原侵入的一道天然屏障［3］。近期研究發(fā)現(xiàn)由于幾丁質(zhì)及其衍生物具有無(wú)毒的生物降解性和生物相容性，因此被廣泛應(yīng)用于食品、制藥和生物技術(shù)等行業(yè)［4］。

幾丁質(zhì)酶是細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)、植物和動(dòng)物體內(nèi)普遍合成的一種具有生物催化活性的水解酶類［5］，它能特異地催化水解幾丁質(zhì)的 β-1，4-糖苷鍵生成 N-乙酰-D-氨基葡萄糖。幾丁質(zhì)酶的作用十分廣泛，不僅用于甲殼素衍生物的生產(chǎn)，而且用于控制植物病原真菌的代謝，以及增強(qiáng)蘇云金芽胞桿菌的殺蟲(chóng)活性［6，7］。由細(xì)菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶主要分為兩大類：一類為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（endochitinase，EC3.2.1.14），此類酶可隨意裂解幾丁質(zhì)和幾丁質(zhì)寡聚物并釋放出可溶性低分子量混合物；另一類為外切幾丁質(zhì)酶（exochitinase），分為兩個(gè)亞類：一類為幾丁二糖酶（chitobiosidase，EC3.2.1.29），可從非還原端裂解幾丁質(zhì)和幾丁質(zhì)寡聚物，釋放的最終產(chǎn)物主要是二乙酰幾丁二糖［（GlcNAc）2］；另一類為N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（N-acetylglucosaminidases，EC3.2.1.30），同幾丁二糖酶一樣可從非還原端裂解幾丁質(zhì)和幾丁質(zhì)寡聚物，釋放N-乙酰葡糖胺單體（GlcNAc），它也是唯一可以水解（GlcNAc）2的酶［8-10］。

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）因?yàn)閷?duì)多種害蟲(chóng)具有毒殺作用而一直為人們所關(guān)注，目前已有十多個(gè)亞種的蘇云金芽胞桿菌被證明能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。目前，對(duì)Bt幾丁質(zhì)酶的研究已經(jīng)從最初的酶的分離純化發(fā)展到幾丁質(zhì)酶基因的克隆表達(dá)，從對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選發(fā)展到幾丁質(zhì)酶的定向改造，但這些過(guò)程均與酶活性的檢測(cè)緊密相連。目前，大多數(shù)報(bào)道采用DNS方法測(cè)定幾丁質(zhì)酶活性［11，12］，本研究在完成對(duì)蘇云金芽胞桿菌DLD171菌株中幾丁質(zhì)酶chiA73基因克隆表達(dá)的基礎(chǔ)上，采用熒光底物對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶活測(cè)定［19］，旨在為幾丁質(zhì)酶的后期開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 Bt DLD171菌株由本實(shí)驗(yàn)室自己分離得到，表達(dá)菌株E. coli Rosetta（DE3）與載體pEB由本實(shí)驗(yàn)室自己保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 液體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 mL，pH7.0。固體LB培養(yǎng)基：在液體LB培養(yǎng)基中加13 g/L的瓊脂。固體1/2LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g、酵母提取物2.5 g、氯化鈉5 g、瓊脂13 g、蒸餾水1 000 mL，pH7.0。

幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基［13］：（NH4）2SO43 g、K2HPO40.7 g、KH2PO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·H2O 0.5 g、膠體幾丁質(zhì)3 g、酵母粉3 g、瓊脂13 g、蒸餾水 1 000 mL，pH7.2。

幾丁質(zhì)酶發(fā)酵培養(yǎng)基［8］：蛋白胨2 g、酵母提取物 2 g、K2HPO40.7 g、KH2PO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·H2O 0.5 g、細(xì)粉幾丁質(zhì)12 g、蒸餾水1 000 mL，pH6.8。

1.2 方法

1.2.1 幾丁質(zhì)酶產(chǎn)酶菌的篩選 幾丁質(zhì)酶的篩選通過(guò)水解圈法進(jìn)行，將Bt菌株直接接種在幾丁質(zhì)誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基上，觀察其生長(zhǎng)情況和水解圈的有無(wú)［14］。

1.2.2 晶體形態(tài)觀察 將Bt菌株DLD171在1/2LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，將胞晶混合液滴于載玻片上，涂抹均勻，烘干固定，石炭酸復(fù)紅染液染色3 min，清水沖洗，100×油鏡進(jìn)行鏡檢［15］。

1.2.3 幾丁質(zhì)酶基因的克隆和測(cè)序 Bt DLD171菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取基因組DNA。使用引物上游序列（5'-ATGGCTATGAGGTCTCAAAAATT-3'）和下游序列（5'-CTAGTTTTCGCTAATGACGGC-3'）擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶基因［16］，引物設(shè)計(jì)基于chiA HD-73的全長(zhǎng)序列［19］。PCR擴(kuò)增時(shí)使用KOD高保真酶，PCR反應(yīng)程序：94℃ 2 min；98℃ 10 s，52℃ 30 s，68℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并與pEB載體連接，轉(zhuǎn)化到E. coli Rosetta（DE3）中［17］。提取質(zhì)粒，送至北京金維智公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 基因誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析 將重組的大腸桿菌菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件為：IPTG 1 mg/mL，30℃，150 r/min，震蕩培養(yǎng)6 h。將誘導(dǎo)的培養(yǎng)液在4 000 r/min的條件下離心5 min并收集菌體，用預(yù)冷的20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）懸浮菌體兩次。最后用2 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）懸浮菌體，并在冰水混合物中超聲波破碎菌體，超聲時(shí)工作3 s，間歇3 s，將破碎完全的菌液離心取上清備用［18］。

1.2.5 幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定 挑取Bt單菌落于5 mL LB試管中，30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，按1%的接種量接種在幾丁質(zhì)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、220r/min振蕩培養(yǎng)5 d。將培養(yǎng)物在4℃、12 000 r/min條件下離心20 min取上清備用。使用熒光幾丁質(zhì)低聚糖進(jìn)行幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定，4-甲基傘形酮幾丁三糖［4-MU-（GlcNAc）3］和4-甲基傘形酮幾丁單糖（4-MU-GlcNAc）作為反應(yīng)底物。使用的酶液為上述表達(dá)的幾丁質(zhì)酶和Bt直接發(fā)酵的酶，測(cè)定體系為：熒光底物10 μL，幾丁質(zhì)酶10 μL，磷酸緩沖液（pH7）580 μL，37℃反應(yīng)1 h后加入600 μL Na2CO3終止反應(yīng)［20］。使用熒光分光光度計(jì)（LS45）對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光測(cè)定，測(cè)定時(shí)儀器的參數(shù)設(shè)為激發(fā)光340 nm和發(fā)射光415 nm，用于測(cè)量4-甲基傘型酮（4-methylumbelliferone）發(fā)出的熒光。為了量化這種酶，一個(gè)酶活力單位定義為在1 h釋放1 μmol的4-methylumbelliferone 所需的酶量［19］。每個(gè)實(shí)驗(yàn)一次平行3次，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 pH值和溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響 用4-MU-（GlcNAc）3作為底物，測(cè)定表達(dá)的幾丁質(zhì)酶ChiA73的最適pH，緩沖溶液為pH 4-10的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液。在最適pH時(shí)，使用4-MU-（GlcNAc）3作為底物測(cè)定ChiA73在溫度為20-80℃時(shí)酶活性的大小。每個(gè)實(shí)驗(yàn)一次平行3次，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 晶體形態(tài)觀察

BtDLD171菌株產(chǎn)生的晶體形態(tài)，光學(xué)顯微鏡（圖1）下箭頭所示，從左到右依次為菌體、芽胞和晶體。

圖1 Bt DLD171的光學(xué)顯微鏡圖片

2.2 幾丁質(zhì)酶基因chiA73的克隆和序列分析

PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖2）所示，將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank，獲得登錄號(hào)為KJ508093。并將其命名為chiA73，幾丁質(zhì)酶chiA73序列全長(zhǎng)為2 031 bp，編碼676個(gè)氨基酸殘基。chiA73與其他來(lái)源于GenBank報(bào)道的Bt幾丁質(zhì)酶基因有94%-99%的相似度。

圖2 chiA73基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3 幾丁質(zhì)酶ChiA73蛋白結(jié)構(gòu)分析

使用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Sig nalP/）分析結(jié)果（圖3）表明，幾丁質(zhì)酶ChiA73的切割位點(diǎn)在Ala-34和Asp-35之間，催化區(qū)域由Gly-147 到Ser-222共76個(gè)氨基酸組成，粘蛋白III型同源區(qū)（FN3）由Ile-479到Thr-574共96個(gè)氨基酸組成，幾丁質(zhì)結(jié)合域（CBD）由Val-587 到Lys-629共43個(gè)氨基酸組。

2.4 chiA73在大腸桿菌中的表達(dá)

對(duì)chiA73基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，提取蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果（圖4）顯示，表達(dá)產(chǎn)物的大小約74 kD。以空質(zhì)粒 pEB 轉(zhuǎn)入 Rosetta（DE3）菌株作為陰性對(duì)照，未發(fā)現(xiàn)74 kD的蛋白，說(shuō)明在大腸桿菌中成功表達(dá)了幾丁質(zhì)酶ChiA73。

2.5 原菌發(fā)酵液與表達(dá)蛋白ChiA73的活性檢測(cè)

用兩種熒光幾丁質(zhì)低聚糖作為底物對(duì)幾丁質(zhì)酶酶活進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（表1）顯示，在pH值為7時(shí)，原菌發(fā)酵液對(duì)4-MU-（GlcNAc）3具有較高的水解活性，同時(shí)對(duì)4-MU-GlcNAc具有一定的水解活性。表達(dá)的幾丁質(zhì)酶ChiA73只對(duì)4-MU-（GlcNAc）3具有高的水解活性，對(duì)4-MU-GlcNAc沒(méi)有水解活性。E. coli DE3自身的蛋白未檢測(cè)到水解活性。結(jié)果表明原菌發(fā)酵液不僅具有內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性，還具有N-乙酰氨基葡萄糖酶活性。而表達(dá)的幾丁質(zhì)酶ChiA73只具有內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性，說(shuō)明幾丁質(zhì)酶ChiA73是一種內(nèi)切幾丁質(zhì)酶。

圖3 ChiA73的氨基酸序列

圖4 ChiA73表達(dá)蛋白SDS-PAGE電泳

表1 不同底物下幾丁質(zhì)酶的活性分析/（U·m L-1）

2.6 pH值和溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶ChiA73活性的影響

在37℃下，改變酶活測(cè)定體系的pH值，結(jié)果（圖5-A）顯示，在pH 4-10范圍內(nèi)，幾丁質(zhì)酶均具有一定活性，pH為8時(shí)酶活性最高。在pH為8時(shí)，改變測(cè)活體系的反應(yīng)溫度，結(jié)果（圖5-B）顯示，在溫度20-80℃范圍內(nèi)幾丁質(zhì)酶均有活性，在40℃時(shí)幾丁質(zhì)酶酶活性最高。

圖5 pH（A）和溫度（B）對(duì)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性的影響

3 討論

幾丁質(zhì)酶酶活的檢測(cè)方法有很多種，如DNS試劑檢測(cè)法，此方法可快速測(cè)定幾丁質(zhì)酶總酶活，但無(wú)法測(cè)定單個(gè)幾丁質(zhì)酶的活性，更不能用于鑒定幾丁質(zhì)酶的種類［12］。而使用熒光幾丁質(zhì)低聚糖對(duì)幾丁質(zhì)酶酶活進(jìn)行測(cè)定，可以彌補(bǔ)DNS試劑檢測(cè)法的不足。最為常用的熒光劑是4-甲基傘形酮，此方法區(qū)分3種幾丁質(zhì)酶的原理為：內(nèi)切幾丁質(zhì)酶能水解4-MU-（GlcNAc）3但不能水解4-MU-GlcNAc；只有N-乙酰氨基葡萄糖酶可以水解4-MU-GlcNAc；而幾丁二糖酶只能水解4-MU-（GlcNAc）2生成4-甲基傘形酮［21］。本研究從Bt DLD171菌株中克隆得到幾丁質(zhì)酶基因ChiA73，并證實(shí)ChiA73為一種內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，這與Barboza-Corona等［19］對(duì)ChiA-HD73的鑒定結(jié)果一致。

幾丁質(zhì)酶ChiA73由信號(hào)肽、催化區(qū)、粘蛋白III型同源區(qū)和幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。蛋白質(zhì)前體的信號(hào)肽斷裂位點(diǎn)在Ala-34和Asp-35之間，符合革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的斷裂位點(diǎn)，革蘭氏陰性菌的斷裂位點(diǎn)在Leu-33和Ala-34之間。 成熟的ChiA73蛋白質(zhì)在N端存在一個(gè)催化區(qū)，與糖基水解酶18家族的催化區(qū)有較高的同源性，其中Asp-207、Asp-209和Glu-211高度保守，與幾丁質(zhì)酶的活性相關(guān)。催化區(qū)之后是粘蛋白III型同源區(qū)，該結(jié)構(gòu)域?qū)锥≠|(zhì)酶與幾丁質(zhì)的結(jié)合作用無(wú)影響，卻與膠狀幾丁質(zhì)降解程度有關(guān)。除幾丁質(zhì)酶外，纖維素酶、α-淀粉酶、PHB解聚酶等也存在粘蛋白III型同源區(qū)域［22］。ChiA73蛋白質(zhì)C端幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)中的Trp-591、Tyr-595和Trp-626也是高度保守的，該結(jié)構(gòu)域能特異結(jié)合不可溶幾丁質(zhì)（如膠狀幾丁質(zhì)或再生幾丁質(zhì)）及晶體幾丁質(zhì)。

大多數(shù)幾丁質(zhì)酶在偏酸的環(huán)境下酶活最高，而對(duì)ChiA73理化性質(zhì)研究表明其最適pH值為8。研究表明，Bt幾丁質(zhì)酶可協(xié)同Bt產(chǎn)生的晶體蛋白進(jìn)行殺蟲(chóng)［23］，Bt在害蟲(chóng)體內(nèi)的作用位點(diǎn)是昆蟲(chóng)中腸，而中腸液偏堿性，堿性條件下ChiA73具有較高的活性為其殺蟲(chóng)增效作用提供了條件。此外，Bt幾丁質(zhì)酶還可以抑制真菌的生長(zhǎng)，本研究為Bt幾丁質(zhì)酶在生物防治及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了參考。

4 結(jié)論

本研究從Bt DLD171菌株中克隆得到幾丁質(zhì)酶chiA73基因，基因序列全長(zhǎng)為2 031 bp，編碼676個(gè)氨基酸殘基，分子量約為74 kD，GenBank登錄號(hào)為KJ508093。將該基因在大腸桿菌 Rosetta（DE3）中表達(dá)，表達(dá)的ChiA73蛋白只具有內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性，且最適pH為8、最適溫度為40℃。結(jié)果表明，熒光劑4-甲基傘形酮幾丁質(zhì)低聚糖法是一種行之有效的幾丁質(zhì)酶酶活檢測(cè)法，并且可以用于鑒定幾丁質(zhì)酶的種類。

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［23］韓苗苗， 肖亮， 蔡峻， 等. 一株抑真菌、對(duì)甜菜夜蛾高效的蘇云金芽胞桿菌菌株［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2008， 35（11）：1750-1754.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning，Expression and Enzymatic Activities of chiA73 Gene from Bacillus thuringiensis

Zhang Yuan Zhou Guowang Li Haitao Liu Rongmei Zhao Yikui Gao Jiguo
（College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin150030）

In order to identify and detect chitinase activities from Bacillus thuringiensis strains， chitinase gene chiA73（GenBank accession number：KJ508093）from genomic DNA of Bt DLD171 producing high-yield chitinase was cloned by PCR. Gene of chitinase chiA73 was expressed and the weight of expression product was approximate 74 kD. The results measured by fluorogenic substrates showed that the expression product of chiA73 hydrolyzed 4-MU-（GlcNAc）3only， but not 4-MU-GlcNAc. In conclusion， the work indicated that ChiA73 was one of endochitinase， and had the highest activity at pH8 and 40℃.

Bacillus thuringiensis；chitinase；chiA73；fluorogenic substrates；enzymatic activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.021

2014-12-08

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2014ZX0800913B-002），國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金資助項(xiàng)目（J1210069），國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃課題（2011AA10A203），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401812），黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12521021）

張圓，女，碩士，研究方向：生物防治微生物功能基因的發(fā)掘、研究和利用，E-mail：13009835138@126.com；周國(guó)旺為并列第一作者

高繼國(guó)，男，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物大分子的分離純化，蘇云金芽胞桿菌抗性機(jī)理、生物安全性；E-mail：gaojiguo1961@hotmail.com