蔡孝莉　冉麗丹　文國容　金　?！♀毡毓庾窳x醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科，貴州遵義563000

泮托拉唑對肝癌細胞SMCC-7721遷移、侵襲及凋亡的影響

蔡孝莉冉麗丹文國容金海庹必光
遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科，貴州遵義563000

目的觀察泮托拉唑對人肝癌細胞SMMC-7721遷移、侵襲及凋亡的影響，預測其對人肝癌的抗癌作用。方法體外培養(yǎng)人肝癌細胞SMMC-7721細胞，細胞遷移和侵襲實驗分為對照組和泮托拉唑不同濃度組（20、40、80、120、160μmol/L），對其進行干預，用細胞小室（Transwell）觀察其對肝癌細胞遷移能力的影響；用Transwell小室上鋪設基質膠觀察泮托拉唑對細胞侵襲的影響；細胞凋亡實驗分為對照組和泮托拉唑不同濃度組（40、80、160、320、640μmol/L），用流式細胞儀檢測其對細胞凋亡的影響。結果泮托拉唑20μmol/L組對人肝癌細胞SMMC-7721的遷移和侵襲與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而泮托拉唑40、80μmol/L組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并且泮托拉唑120、160μmol/L組與對照組比較差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；另外，泮托拉唑40μmol/L組對人肝癌細胞SMMC-7721的凋亡與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而泮托拉唑80、160、320、640μmol/L組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結論泮托拉唑能抑制人肝癌細胞SMMC-7721遷移和侵襲，并促進凋亡，可能對人肝癌具有一定的抗癌作用。

泮托拉唑；肝癌細胞；細胞運動

肝癌是我國最高發(fā)的惡性腫瘤之一，因其高侵襲、高轉移和復發(fā)，多數(shù)患者在確診以后的生存時間較短。目前除了手術、化療等，尚無很好的治療方法，且療效不如人意。研究發(fā)現(xiàn)［1-3］，質子泵抑制劑（PPIs）對實體瘤細胞具有抗腫瘤活性，但對正常細胞則無影響。但目前國內外關于PPIs對惡性腫瘤的研究甚少。本實驗選用不同濃度的泮托拉唑作用于肝癌細胞SMMC-7721，觀察其對肝癌細胞的遷移、侵襲及凋亡能力的影響，為肝癌的治療提供新的思路和方向。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人肝癌細胞SMCC-7721購于中國科學院上海細胞所；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶均購于美國Hyclone公司；泮托拉唑購于美國Sigma公司；Matriger基質膠購于美國BD公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司；圖像分析系統(tǒng)購于德國Lecia公司；流式細胞儀購于美國BD公司。

1.2分組與給藥

細胞遷移及侵襲實驗分為對照組（細胞懸液不加任何藥物）、泮托拉唑不同濃度組（20、40、80、120、160μmol/L）；細胞凋亡實驗分為對照組和泮托拉唑不同濃度組（40、80、160、320、640μmol/L）；將用無血清培養(yǎng)基配制好的相應濃度的泮托拉唑加入事先準備好的細胞懸液中。

1.3實驗方法

1.3.1細胞遷移實驗取對數(shù)生長期細胞，用無血清培養(yǎng)饑餓24 h后，加入胰酶消化，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化，并制成細胞懸液，使細胞懸液的終濃度為2×104/mL以備用；取孔徑為8μm的Transwell小室，上室分別加入以上配置好的終濃度為2×104/mL細胞懸液100μL，其中，在對照組中上室再加入含無血清的培養(yǎng)基100μL，實驗組則分別再加入事先用無血清培養(yǎng)基配制的各濃度的泮托拉唑100μL，使上室細胞懸液血清濃度為5%，下室則加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基500μL；于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后，取出細胞小室，用棉簽擦掉上室中的液體，用PBS緩沖液淋洗2遍，晾干；4%多聚甲醛固定15min后，用蒸餾水沖洗2遍，每次2min；然后蘇木精復染7min后，再用自來水沖洗10min；95%乙醇5 s，晾干；伊紅染色2min；75%酒精清洗2遍，每次2min；95%酒精清洗2遍，每次2min；二甲苯透明5 min后，用鑷子將Transwell的膜取下，置于載玻片上，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察細胞從上室遷移到下室膜表面的細胞個數(shù)并拍照，隨機選取10個低倍視野進行細胞計數(shù)，并計算平均值。

1.3.2細胞侵襲實驗事先將基質膠取出，置于4℃過夜備用；在Transwell小室上室鋪設基質膠，基質膠用無血清培養(yǎng)基按1∶3稀釋，37℃孵育30 min，待其凝固后用無血清培養(yǎng)基水化備用；上室加入細胞懸液100μL，其濃度為1×105/mL；其中，對照組再加入無血清培養(yǎng)基100μL，其余各組加入用無血清培養(yǎng)基配制的不同濃度的泮托拉唑100μL；于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，取出細胞小室，用棉簽輕輕擦掉上室中的基質膠；用PBS清洗2遍，晾干；其余操作步驟同細胞遷移實驗。

1.3.3細胞凋亡實驗取對數(shù)生長期的肝癌細胞SMCC-7721，接種在35mm×12mm的培養(yǎng)皿中，細胞濃度調節(jié)為1×105/mL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待其貼壁。細胞貼壁后，棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌2次，加入含泮托拉唑的新培養(yǎng)基，泮托拉唑終濃度分別為40、80、160、320、640μmol/L，每濃度設置3個復孔，對照組用不含藥物的10%FBS的DMEM培養(yǎng)基代替。培養(yǎng)24 h后，收集上清液中細胞及貼壁細胞，用PBS洗滌2次，用1×Binding Buffer懸浮細胞，調細胞濃度為1×106/mL，取300μL放入5 mL離心管中，各管分別先加5μL Annexin V-FITC，混勻，再加5μL PI混勻。避光反應15min后用流式細胞儀檢測凋亡。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1泮托拉唑對肝癌細胞SMMC-7721細胞遷移的影響

與對照組比較，泮托拉唑20μmol/L組對人肝癌細胞SMMC-7721的遷移沒有影響（P＞0.05），泮托拉唑40、80、120、160μmol/L組能抑制細胞的遷移，并隨著藥物濃度的提高，抑遷移作用逐漸增強（P＜0.05或P＜0.01）。見圖1、表1。

2.2泮托拉唑對肝癌細胞SMMC-7721細胞侵襲的影響

與對照組比較，泮托拉唑20μmol/L組對人肝癌細胞SMMC-7721的侵襲沒有影響（P＞0.05），泮托拉唑40、80、120、160μmol/L組能抑制細胞的侵襲作用，且隨著藥物濃度的提高，抑制侵襲作用逐漸增強（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2、表2。

圖1　不同濃度泮托拉唑對肝癌細胞SMMC-7721細胞遷移的影響（HE染色，200×）

表1　泮托拉唑對肝癌細胞SMMC-7721細胞遷移的影響（個，±s，n=8）

表1　泮托拉唑對肝癌細胞SMMC-7721細胞遷移的影響（個，±s，n=8）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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圖2　不同濃度泮托拉唑對肝癌細胞SMMC-7721細胞侵襲的影響（HE染色，200×）

表2　泮托拉唑對對肝癌細胞SMMC-7721細胞侵襲的影響（個s，n=8）

表2　泮托拉唑對對肝癌細胞SMMC-7721細胞侵襲的影響（個s，n=8）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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2.3泮托拉唑對肝癌細胞SMMC-7721細胞凋亡的影響

與對照組比較，泮托拉唑40μmol/L組對人肝癌細胞SMMC-7721的凋亡沒有影響（P＞0.05），泮托拉唑80、160、320、640μmol/L組能促進細胞的凋亡，且隨著藥物濃度的提高，促凋亡作用逐漸增強（P＜0.05或P＜0.01）。見圖3、表3。

圖3　不同濃度泮托拉唑對肝癌細胞SMMC-7721細胞凋亡的影響

表3　不同濃度泮托拉唑對肝癌細胞SMMC-7721細胞凋亡的影響（%，±s，n=8）

表3　不同濃度泮托拉唑對肝癌細胞SMMC-7721細胞凋亡的影響（%，±s，n=8）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別凋亡率對照組泮托拉唑40μmol/L組泮托拉唑80μmol/L組泮托拉唑160μmol/L組泮托拉唑320μmol/L組泮托拉唑640μmol/L組2.10±0.80 2.10±1.06 5.03±0.51*28.20±2.26*34.20±8.45**70.70±12.02**

3　討論

隨著腫瘤逐漸成為人類健康的主要威脅，尋找既能殺傷腫瘤細胞，又對人體正常細胞不良反應小或無不良反應的化療藥物成為近年來腫瘤治療方面的新方向。V-ATPases是一種多蛋白復合物，廣泛分布于真核細胞的囊泡膜和細胞膜，依賴ATP逆濃度梯度將H+泵出細胞外或者泵入細胞器囊泡腔內，維持細胞器的pH在7.0左右［4-5］。在大多數(shù)實體腫瘤細胞中，V-ATPases表達過量，并且與腫瘤的轉移和浸潤呈正相關，從而造就了腫瘤酸性微環(huán)境。有學者認為，腫瘤酸性微環(huán)境是癌癥進展和轉移的關鍵因素［6-8］。Chen等［6］發(fā)現(xiàn)PPI能抑制V-ATPases的表達，并扭轉轉運膜pH的梯度。研究發(fā)現(xiàn)人肝癌細胞中的V-ATPases明顯上調，抑制V-ATPases可延緩肝癌細胞的生長［9］。因此，阻斷V-ATPases的表達可以抑制人類癌癥的生長和轉移。最近研究腫瘤酸化的機制為針對VATPases提供了新的策略［10］。PPIs這類藥物符合這一目標［11］。

PPIs是一類臨床治療酸相關疾病安全有效的藥物。泮托拉唑是一種PPIs，能在pH＜4的酸性環(huán)境下發(fā)揮抑制酸的作用，臨床常用來抑制胃酸和應用于酸相關的疾病，其具有良好的安全性，幾乎沒有副作用。本實驗選用不同濃度的PPIs泮托拉唑干預人肝癌細胞SMMC-7721，觀察其對人肝癌細胞SMMC-7721的遷移、侵襲及凋亡的情況，從PPIs對癌癥的影響這一角度著手探討，本實驗研究發(fā)現(xiàn)，選用不同濃度的泮托拉唑作用于SMMC-7721人肝癌細胞24 h后，與對照組比較，泮托拉唑20μmol/L組對細胞的遷移和侵襲無明顯影響（P＞0.05），在40μmol/L時有明顯的抑制作用（P＜0.05），并且隨著藥物濃度的增加作用逐漸增強。另外，選用不同濃度的泮托拉唑作用于SMMC-7721人肝癌細胞24 h后，與對照組比較，40μmol/L泮托拉唑對細胞的凋亡無明顯影響（P＞0.05），在80μmol/L時有明顯的促凋亡作用（P＜0.05），并且隨著藥物濃度的增加作用逐漸增強。

我國是全球肝癌發(fā)病率最高和病死數(shù)最多的國家，肝癌患者占全球的55%，腫瘤的侵襲與轉移是影響肝癌患者生存期的重要因素，肝癌的高轉移和復發(fā)率是直接導致肝癌患者死亡的主要原因［12］。尋找影響肝癌侵襲、轉移，及促進肝癌細胞凋亡的藥物已成為臨床亟待解決的問題。PPIs一直以抑制胃酸分泌而著稱，被廣泛運用于消化道潰瘍及反流性食管炎等酸相關性疾病。但新近的研究發(fā)現(xiàn)，PPIs可抑制腫瘤局部酸的分泌，從而抑制多種腫瘤的侵襲遷移等，如胃腺癌［13］、胰腺癌［14］、甲狀腺癌［15］、黑色素瘤［16］等，可是，目前泮托拉唑對肝癌的作用仍不清楚。本實驗研究結果提示，泮托拉唑能抑制肝癌細胞SMMC-7721細胞的侵襲和遷移，誘導細胞凋亡，泮托拉唑可能成為臨床治療肝癌的安全而有效的藥物，但本實驗僅從細胞水平探索泮托拉唑對肝癌細胞SMMC-7721的影響，而具體通過怎樣的機制發(fā)揮作用還有待進一步的研究發(fā)現(xiàn)。

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Effects of Pantoprazole on m igration，invasion and apoptosis of human liver carcinoma SMCC-7721 cells

CAIXiaoli RAN Lidan WEN Guorong JIN Hai TUO Biguang
Department of Gastroenterology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Guizhou Province，Zunyi 563000，China

Ob jective To investigate the effects of Pantoprazole on themigration，invasion and apoptosis of human liver carcinoma SMMC-7721 cell，and to predict its anti-cancer effect on liver cancer.Methods In vitro cultivation of human liver carcinoma SMMC-7721 cells，cellmigration and invasion experiments were divided into control group and different concentrations of Pantoprazole groups（20，40，80，120，160μmol/L），Transwell chamber assay was used to detect the migration of SMMC-7721 cells.Transwell chamber assay was used to detect the invasion of SMMC-7721 cells.Cell apoptosis experimentwas divided into control group and different concentrations of Pantoprazole groups（40，80，160，320，640μmol/L），F(xiàn)CM test was used to detect the apoptosis of SMMC-7721 cells.Results The migration and invasion of Pantoprazole 20μmol/L group had no statistically significant differences in SMMC-7721 cells compared with control group（P＞0.05），while Pantoprazole 40，80μmol/L group had a statistically significant difference compared with control group（P＜0.05），and Pantoprazole 120，160μmol/L group were highly statistically significant different compared with control group（P＜0.01）.In addition，apoptosis of Pantoprazole 40μmol/L group was not statistically significant in SMMC-7721 cells compared with control group（P＞0.05），and Pantoprazole 80，160，320，640μmol/L group were statistically significant compared with control group（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Pantoprazole can inhibit human liver carcinoma SMCC-7721 cellsmigration and invasion，and promote apoptosis，it may have certain anti-cancer effect on human liver.

Pantoprazole；Hepatoma cell；Cellmovement

R735.7

A

1673-7210（2015）05（a）-0007-05

2015-01-06本文編輯：張瑜杰）

國家自然科學基金項目（81360311）。

蔡孝莉（1987.1-），女，遵義醫(yī)學院2012級消化內科專業(yè)在讀碩士研究生，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤及離子通道轉運研究。

庹必光（1963.8-），男，博士，教授，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤及離子通道轉運研究。