康曉靜劉廣勇柴 莉彭呂嬌王 朋趙 娟靳 穎

PNL2在皮膚黑素瘤的表達及與預(yù)后的相關(guān)性

康曉靜1劉廣勇2柴 莉1彭呂嬌1王 朋1趙 娟1靳 穎1

目的： 檢測PNL2在皮膚黑素瘤中的陽性表達率，明確其與預(yù)后的關(guān)系。方法： 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測PNL2在60例皮膚黑素瘤石蠟包埋組織切片中的表達，并分析PNL2在不同年齡、性別、民族、發(fā)病部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Clark分級、浸潤深度及預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果： PNL2在皮膚黑素瘤中的陽性表達率為90%，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Clark分級、浸潤深度及預(yù)后密切相關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、民族、發(fā)病部位不相關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論： PNL2與皮膚黑素瘤的病情發(fā)展及預(yù)后具有相關(guān)性。

皮膚黑素瘤； PNL2； 侵襲； 預(yù)后

PNL2是針對黑素細胞抗原的一種新單克隆抗體。目前國內(nèi)外對PNL2的研究報道較少，與PNL2相對應(yīng)的抗原尚未明確。PNL2染色不會因為組織標本的漂白或脫鈣作用而改變，有利于PNL2對發(fā)生于高度染色細胞組織病變的黑素瘤和發(fā)生骨轉(zhuǎn)移病變黑素瘤進行免疫檢測的診斷。PNL2在黑素瘤診斷中顯示出高度靈敏度和特異性，對診斷黑素瘤具有很大價值。1，2目前，黑素瘤中PNL2表達情況與黑素瘤臨床表型的相關(guān)性研究甚少。本研究用免疫組化方法檢測60例皮膚黑素瘤組織中 PNL2的表達，探討PNL2的表達與皮膚黑素瘤的診斷、臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系及意義。

1　資料與方法

1.1研究病例 60例明確診斷為皮膚黑素瘤的石蠟包埋組織均選取新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院病理科及皮膚科2004年1月至2013年12月存檔蠟塊，病史完整。所有標本均經(jīng)HE及病理診斷證實。60例皮膚黑素瘤患者均未做化療、放療及抗免疫治療。其中維吾爾族29例，漢族31例；男32例，女28例；年齡22～94歲，平均57.5歲；肢端型42例，非肢端型18例；浸潤深度：組織學(xué)表現(xiàn)為原位皮膚黑素瘤（腫瘤細胞未突破基底膜）16例，侵襲性皮膚黑素瘤（腫瘤細胞突破基底膜向真皮內(nèi)侵襲）44例。組織學(xué)Clark分級：I-III級17例，IV-V級43例；伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例；3年內(nèi)隨訪出現(xiàn)多器官轉(zhuǎn)移或死亡29例，預(yù)后良好14例，失訪17例。

主要試劑 一抗是小鼠抗人皮膚黑素瘤PNL2單克隆抗體（IgG，產(chǎn)地英國，產(chǎn)品編號：ab12502）；鼠兔通用型二抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑均購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司。

1.2方法 免疫組織化學(xué)法將10%福爾馬林固定、石蠟包埋的皮膚黑素瘤組織制成4～5μm切片，常規(guī)烤片、脫蠟、水化；浸入0.01 mol/L，pH值為6.0的枸櫞酸鹽緩沖液內(nèi)，熱抗原修復(fù)3 min；3%H2O2室溫作用10min以消除內(nèi)源性過氧化氫酶；滴加一抗（稀釋度為1∶800）；4℃過夜后在室溫復(fù)溫20 min后滴加1 mmol EDTA緩沖液，滴加一抗（稀釋度為1∶10-1∶25）調(diào)pH值為9.0的稀釋液中進行原位染色，熱抗原修復(fù)3min；室溫孵育30～60 min；DAB顯色1 min左右；自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，通透、脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。PBS代替一抗作為空白對照，已知PNL2染色陽性的皮膚黑素瘤切片作為陽性對照。

結(jié)果判斷：所有切片做免疫組化前均現(xiàn)切現(xiàn)用，所有免疫組化結(jié)果由2位病理科專家雙盲閱片判讀結(jié)果，PNL2陽性染色為棕黃色顆粒，主要定位于細胞質(zhì)。觀察全片，借助高分辨顯微鏡隨機取不重疊的5個200倍視野，得出陽性細胞所占百分比。采用半定量積分法，對每張切片的陽性細胞率及陽性細胞著色強度進行分級計分。染色強度分為3級：無著色0分，淺著色1分，棕黃色2分；按陽性細胞百分比分4級：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。每張切片最后的得分為兩次評分的乘積：≥3分是陽性，＜3分是陰性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS l7.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用χ2檢驗四格表確切概率法分析皮膚黑素瘤中與不同年齡、性別、民族、發(fā)病部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Clark分級、浸潤深度及預(yù)后中PNL2表達的差異，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PNL2在皮膚黑素瘤組織中表達分析 60例皮膚黑素瘤石蠟包埋組織中，PNL2陽性表達54例，表現(xiàn)為胞漿的棕黃色顆粒狀著色，表達率為90%（54/ 60）（圖1）。

圖1　PNL2表達陽性：細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒（HE，a×100，b×400）

2.2皮膚黑素瘤組織中PNL2的表達與臨床病理特征關(guān)系 PNL2陽性表達的皮膚黑素瘤組織與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Clark分級及預(yù)后存在差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且PNL2的陽性表達率隨皮膚黑素瘤組織Clark分級升高及浸潤深度加深而增高。見表1、2。PNL2的陽性率表達在不同年齡、性別、民族、發(fā)病部位之間分布無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

表1　皮膚黑素瘤PNL2表達與臨床病理特征的關(guān)系

表2　皮膚黑素瘤PNL2表達與臨床預(yù)后的關(guān)系

3　討論

生物學(xué)標記物是近年來醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域上的熱點。大多數(shù)的黑素瘤標記物其靈敏度和特異性有限。探索黑素瘤的病因及發(fā)病機制，以期找到黑素瘤早期有效診斷指標及分子靶向治療方法已成為目前治療黑素瘤中迫切的問題。

PNL2單克隆抗體是相對較新的黑素瘤標記物，目前認為可作為轉(zhuǎn)移性黑素瘤診斷的補充標記物。最初，PNL2是以人生長抑素受體為抗原而生產(chǎn)的單克隆抗體，理論上該重組蛋白可以與人生長抑素受體第2亞型（SST2）的羧基端相結(jié)合。最終發(fā)現(xiàn)PNL2不能與SST2相結(jié)合，但可以與黑素細胞和粒細胞中的某種未知抗原相結(jié)合。3目前與PNL2相對應(yīng)的抗原尚未明確，但資料顯示PNL2相對應(yīng)的抗原與HMB -45/MelanA相對應(yīng)的抗原 PMEL17/gp100是不同的。4有猜測是與PNL2相對應(yīng)的抗原具有與TAP1或網(wǎng)格蛋白17相同的分子量，而被這些大量的蛋白所掩蓋。5PNL2對黑素瘤具有高度特異性。Busam等1對38例黑素瘤樣本研究發(fā)現(xiàn)PNL2陽性表達率為87%、Melan-A陽性率為82%、HMB-45陽性率為76%、酪氨酸酶陽性率為92%、MITF陽性率為82%。Rochaix等5對49例黑素瘤樣本進行免疫組化實驗研究發(fā)現(xiàn)PNL2陽性表達率為94%、Melan-A為90%、HMB-45為90%。在這些樣本中PNL2比HMB-45具有更強的一致性和陽性表達率，在49個樣本中有1例黏膜黑素瘤PNL2呈陽性表達。本研究顯示60例皮膚黑素瘤樣本中PNL2的陽性表達率高達90%（54/60），進一步說明PNL2對皮膚黑素瘤具有高度靈敏性。PNL2更易染色于真表皮連接處和上皮樣黑素瘤。另外PNL2也是血管周上皮樣細胞腫瘤的很好的補充標記物。

PNL2僅染色于黑素細胞病變、透明細胞肉瘤、黑素性神經(jīng)鞘瘤、血管肌脂肪瘤和淋巴管肌瘤病，而其他非黑素細胞腫瘤的研究均為陰性。6PNL2與MelanA，HMB-45抗體有著相似的特異性，但PNL2著色強度及一致性都強于HMB-45抗體。同時HMB-45表現(xiàn)陰性的黑素瘤在PNL2表現(xiàn)出強陽性。7Aung等8研究發(fā)現(xiàn)214例轉(zhuǎn)移性黑素瘤中PNL2陽性表達率為89%（190/214），其中對KBA62、S100、HMB45、MelanA、MITF及酪氨酸酶呈陰性反應(yīng)的黑素瘤中PNL2的陽性表達率分別為83%（25/30）、70%（7/10）、25%（7/28）、44%（12/27）、52%（16/31）及25%（4/16）。除了上述S100標記物外對剩余的標記物全部顯示陰性的黑素瘤標本中PNL2陽性反應(yīng)率為10%（1/10）。PNL2在淋巴管肌瘤病，血管平滑肌脂肪瘤非黑素細胞病變著色仍強于 HMB-45抗體。9進一步說明PNL2對黑素瘤的診斷具有優(yōu)越性。

有報道稱與HMB-45和Melan-A相比，PNL2對黑素瘤具有更高的特異性，遠遠優(yōu)于S-100。目前對PNL2在黑素瘤免疫反應(yīng)的調(diào)查結(jié)果顯示PNL2是一種具有高度靈敏性和特異性的黑素瘤標記物，其在大多數(shù)原發(fā)性上皮樣黑素瘤中常呈陽性反應(yīng)（78%～100%）。1，3，5在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中陽性反應(yīng)率約為75%～100%。1，5，8非促結(jié)締組織增生梭形細胞黑素瘤也常呈陽性反應(yīng)（80%）。1類似于其它黑素瘤標記物，PNL2陽性反應(yīng)也可見于透明細胞瘤5，8、腎血管平滑肌脂肪瘤5、淋巴管肌瘤病5、黑素細胞性神經(jīng)鞘瘤。1，5其它所有的非黑素細胞腫瘤的研究包括各種類型的腫瘤、軟組織癌、成神經(jīng)細胞瘤、嗜絡(luò)細胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤其PNL2反應(yīng)為陰性。1，5，8

Clark分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度是影響黑素瘤預(yù)后的重要因素。本研究顯示PNL2陽性表達的皮膚黑素瘤患者多伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且皮膚黑素瘤PNL2陽性表達率隨Clark分級升高及浸潤深度加深而增高。PNL2陽性表達與預(yù)后具有高度相關(guān)性，有望成為一個重要的皮膚黑素瘤預(yù)后預(yù)測指標。本研究及其他文獻研究顯示的PNL2在皮膚黑素瘤中陽性高表達，說明PNL2對皮膚黑素瘤具有高度靈敏性和特異性，提示PNL2可作為皮膚黑素瘤臨床診斷潛在的補充標記物。

1 Busam KJ，Kucukg?l D，Sato E，et al.Immunohistochemical analysis of novelmonoclonal antibody PNL2 and comparison with other melanocyte differentiation markers.Am J Sun Pathol，2005，29（3）：400-406.

2 Nonaka D，Laser J，Tucker R，et al.Immunohistochemical evaluation of necrotic malignant melanomas.Am J Clin Pathol，2007，127（5）：787-791.

3 Morris LG，Wen YH，Nonaka D，et al.PNL2 melanocytic marker in immunohistochemical evaluation of primary mucosal melanoma of thehead and neck.Head Neck，2008，30（6）：771-775.

4Ordó?ez NG.Value ofmelanocytic-associated immunohistochemicalmarkers in the diagnosis of malignant melanoma：a review and update.Hum Pathol，2014，45（2）：191-205.

5 Rochaix P，Lacroix-Triki M，Lamant L，et al.PNL2，a new monoclonal antibody directed against a fixative-resistantmelanocyte antigen.Mod Pathol，2003，16（5）：481-490.

6Ramos-Vara JA，F(xiàn)rank CB，DuSold D，et al.Immunohistochemical expression of melanocytic antigen PNL2，melan A，S100，and PGP 9.5 in Equine Melanocytic Neoplasms.Vet Pathol，2014，51（1）：161-166.

7 Ramos-Vara JA，Miller MA.Immunohistochemical identification of canine melanocytic neoplasms with antibodies to melanocytic antigen PNL2 and tyrosinase：Comparison with melan A.Vet Pathol，2011，48（2）：443-450.

8 Aung PP，Sarlomo-Rikala M，Lasota J.KBA62 and PNL2：2 New melanoma markers immunohistochemical analysis of 1563 tumors includingmetastatic，desmoplastic，andmucosalmelanomas and theirmimics.Am J Surg Pathol，2012，36（2）：265-272.

9Giudice C，Ceciliani F，Rondena M.Immunohistochemical investigation of PNL2 reactivity of canine melanocytic neoplasms and comparison with melan a.JVet Diagn Invest，2010，22（3）：389-394.

（收稿：2015-05-05 修回：2015-06-04）

The expression of PNL2 and the correlation with prognosis ofmelanoma

KANG Xiao-jing，LIUGuang-yong，CHAILi，etal.DepartmentofDermatology，People'sHosptilalofXinjiang Uyqur Autonomous Kegion

Objective：To detect the expression of PNL2 in cutaneousmalignantmelanoma（MM）and to determine the relationship with the disease progression and prognosis.M ethods：The expression of PNL2 in paraffin-embedded tissue samples from 60 cases of MM was detected with immunohistochemistry.The correlation between PNL2 expression and age，gender，ethnicity，pathogenic site，lymph node metastasis，Clark grade，infiltration and prognosiswas analyzed.Results：The positivity rate of PNL2 was90%inmelanoma tissue.The PNL2 expression was positively correlated with lymph nodemetastasis，Clark grade，depth of invasion and prognosis（P＜0.05），but uncorrelated with age，gender，ethnicity and pathogenic site（P＞0.05）. Conclusion：PNL2 is correlated with the disease progression and prognosis in cutaneous MM.

melanoma；PNL2；invasion；prognosis

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1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科，烏魯木齊，830001

2山東省聊城市第二人民醫(yī)院風(fēng)濕科，聊城，252000