趙真真， 王忠敏， 陸 健， 茅愛武， 劉芬菊

目前美國癌癥統(tǒng)計學數(shù)據(jù)表明，肺癌發(fā)病率位居惡性腫瘤第2位、死亡率居惡性腫瘤之首［1］，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的 80%～85%［2］。除放射治療、化學治療外，手術(shù)治療仍是早期NSCLC患者治愈的主要手段，但相當一部分NSCLC患者確診時病情已至中晚期，喪失了手術(shù)根治切除機會，5年生存率約為15%［3］。對這部分NSCLC患者，放射治療發(fā)揮著重要作用。本研究采用125I粒子持續(xù)低劑量率（CLDR）內(nèi)照射和60Co γ射線高劑量率（HDR）外照射方式照射NSCLC細胞株，探討照射后細胞生物學效應之間的差異。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和細胞照射

NSCLC細胞株H1299由蘇州大學醫(yī)學部放射與防護學院放射生物學實驗室惠贈，在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。125I粒子組BT-125-1型125I粒子購于上海欣科醫(yī)藥有限公司，采用室內(nèi)125I粒子照射模型，CLDR照射初始劑量率為18.32 cGy/h，照射期間125I粒子模型始終置于細胞培養(yǎng)箱中；60Co γ射線組采用蘇州大學輻照中心鈷源60Co γ射線，HDR照射初始劑量率為0.5 Gy/min；空白對照組實驗條件與照射組相同。所有實驗均在蘇州大學醫(yī)學部放射醫(yī)學與防護重點實驗室完成，并在細胞指數(shù)生長期進行；實驗組以不同劑量125I粒子和60Co γ射線分別作CLDR照射和HDR照射，對照組照射劑量為0 Gy。

1.2 克隆形成實驗

取指數(shù)生長期H1299細胞，經(jīng)胰酶消化后以不同細胞數(shù)接種于35 mm培養(yǎng)皿中。接種24 h后分別以 0、2、4、6、8 Gy 劑量行125I粒子 CLDR 照射和60Co γ射線HDR照射，照射后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育10～14 d。然后經(jīng)甲醇固定、結(jié)晶紫染色，計算克隆數(shù)。

1.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

取指數(shù)生長期 H1299 細胞，分別以 0、2、4、6、8 Gy劑量行125I粒子 CLDR照射和60Co γ射線HDR照射。照射后將細胞繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱中孵育 24 h，經(jīng)胰酶消化、離心、冰磷酸緩沖液（PBS）清洗，70%乙醇4℃固定過夜，再次離心、PBS清洗，加10 mg/ml RNA 酶、1 500 μg/ml碘化丙啶（PI）300 U室溫避光染色15～30 min后，采用流式細胞術(shù)檢測照射后細胞周期分布情況。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

H1299 細胞接種 24 h 后，分別以 0、2、4、6、8 Gy劑量行125I粒子CLDR照射和60Co γ射線HDR照射。照射后48 h按照膜聯(lián)蛋白（annexin）Ⅴ-異硫氰酸熒光素（FITC）/PI雙染凋亡試劑盒（南京鉑優(yōu)生物技術(shù)有限公司）說明書，依次加入500 μl緩沖液重懸細胞、5 μl annexinⅤ-FITC、5 μl PI室溫避光染色15～30 min，然后用流式細胞術(shù)檢測照射后細胞凋亡率變化。細胞受到電離輻射損傷后，一旦DNA損傷修復失敗或不可逆損傷積累到一定程度，將誘導細胞凋亡［4］。

1.5 Western blot檢測 Bax、Bcl-2蛋白表達

取指數(shù)生長期H1299細胞，分別以0、4、8 Gy劑量行125I粒子CLDR照射和60Co γ射線HDR照射。照射后24 h胰酶消化、離心、冰PBS清洗，蛋白裂解液抽提總蛋白，二辛可酸（BCA）法測定蛋白濃度。制備終體積20 μl含50 μg蛋白樣品，經(jīng)十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Bio-Rad Laboratories公司），5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4℃孵育一抗：β-肌動蛋白（actin）、Bax、Bcl-2（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）過夜。用TBST洗膜，室溫孵育辣根過氧化物酶（HRP）-山羊抗兔 IgG（H+L）、HRP-山羊抗大鼠IgG（H+L）二抗（中國碧云天生物技術(shù)有限公司）1 h，再次洗膜，等比例涂A、B發(fā)光液，最后用增強化學發(fā)光（ECL）技術(shù)檢測蛋白分子條帶。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 克隆細胞存活分數(shù)

如圖1所示，實驗組兩種電離輻射照射后H1299細胞克隆存活分數(shù)均較對照組明顯降低（P＜0.05），4、6、8 Gy照射時125I粒子組 H1299 細胞克隆存活分數(shù)較60Co γ 射線組降低更顯著（P＜0.05），但兩者差異在照射劑量為2 Gy時并不明顯。

圖1 兩種電離輻射照射后H1299細胞克隆存活分數(shù)

2.2 細胞周期分析

如圖2所示，與對照組相比，實驗組兩種電離輻射以4、6、8 Gy照射時均使H1299細胞發(fā)生較明顯的G2/M期阻滯，但此差異在2 Gy時并不顯著。125I粒子組比60Co γ射線組G2/M期阻滯效應更顯著（P＜0.05），其中 4 Gy照射時125I粒子組 H1299細胞 G2/M 期百分比為（21.77±0.31）%，而60Co γ 射線組僅為（18.85±0.99）%。

圖2 兩種電離輻射照射后H1299細胞周期改變

2.3 細胞凋亡分析

如圖3所示，與對照組相比，125I粒子組和60Co γ射線組在4、6、8 Gy照射時均使H1299細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），但2 Gy照射時細胞凋亡率差異不明顯；相同照射劑量下，125I粒子組H1299細胞凋亡率較60Co γ 射線組更明顯（P＜0.05）。 4 Gy照射時125I粒子組和60Co γ射線組H1299細胞凋亡率分別為（13.79±0.50）%和（8.79±0.22）%（P＜0.05）。

圖3 兩種電離輻射照射后H1299細胞凋亡率差異

2.4 Bcl-2/Bax蛋白比失衡

如圖4所示，與對照組相比，125I粒子組和60Co γ射線組在4、8 Gy照射時均使H1299細胞中Bax蛋白表達明顯上調(diào)，同時Bcl-2蛋白表達明顯下調(diào)，這一效應在125I粒子組更明顯。

圖4 兩種電離輻射照射后Bax、Bcl-2表達水平

3 討論

在我國，肺癌發(fā)病率、死亡率均居惡性腫瘤之首。放射治療在中晚期NSCLC綜合治療中占有重要地位。60Co γ射線HDR照射作為傳統(tǒng)外照射治療代表，在多種惡性腫瘤治療中發(fā)揮重要作用，但由于其療效與劑量相關(guān)，隨著劑量增加，射線對病灶周圍正常組織的損傷也增加，臨床應用時受到一定限制［5］。近年來，125I粒子CLDR內(nèi)照射治療以操作簡單、定位精準、靶區(qū)內(nèi)劑量高、靶區(qū)外劑量低等優(yōu)點，逐漸應用于局部治療中晚期惡性腫瘤，如胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等［6-9］。125I粒子 CLDR 內(nèi)照射治療是通過放射性核素125I在腫瘤組織局部釋放出持續(xù)、近距離的射線，最大程度殺傷腫瘤組織，而正常組織損傷很小。有關(guān)125I粒子CLDR內(nèi)照射和60Co γ射線HDR外照射作用于NSCLC細胞系的生物學效應的比較性研究卻鮮見報道，本研究采用兩種照射方式照射NSCLC細胞株，探討照射后細胞生物學效應之差異。

相關(guān)研究表明，P53缺失的癌細胞對放療和化療較為抵抗，P53野生型癌細胞對放療和化療敏感性較好。Nishizaki等［10］研究表明，137Cs γ 射線照射后細胞凋亡率為H460細胞＞A549細胞＞H1299細胞；重塑H1299細胞P53功能后，可增強H1299細胞對放療和化療的敏感性，進而使細胞凋亡率增加。本研究采用P53缺失的NSCLC細胞株H1299，結(jié)果提示125I粒子CLDR照射較60Co γ射線HDR照射抑制H1299細胞增殖的效應更顯著，這與Chen等［11］采用 NSCLC 細胞系 A549、小細胞肺癌（SCLC）細胞系 H446、Qu 等［12］采用 NSCLC 細胞系 A549 所作研究結(jié)果的趨勢一致?？紤]到125I粒子照射時程較長及后續(xù)細胞狀態(tài)等因素，本研究并未作野生型P53轉(zhuǎn)染及其它NSCLC相關(guān)實驗，但將會在本課題組后續(xù)研究中予以完善。

眾所周知，細胞DNA受到電離輻射損傷時，其周期關(guān)卡效應被激活并導致細胞周期阻滯，繼而激活DNA損傷修復信號通路或啟動死亡程序，導致細胞發(fā)生不同命運［13-14］。本研究中，125I粒子CLDR照射與60Co γ射線HDR照射相比，導致H1299細胞發(fā)生更明顯的G2/M 期阻滯，這與 Wang等［15］、Liao等［16］以胰腺癌細胞、前列腺癌細胞作為實驗模型的研究結(jié)果趨勢一致。相關(guān)研究表明，同樣電離輻射條件下H1299細胞發(fā)生G2/M期阻滯，而A549細胞發(fā)生G1期阻滯，p53基因缺失的細胞在照射后很少發(fā)生 G1 期阻滯［17］。

細胞凋亡是電離輻射誘導細胞死亡的一種主要機制。在應對電離輻射導致的DNA損傷時，細胞為了維持基因組穩(wěn)定性，將激活多個信號轉(zhuǎn)導通路，其中包括細胞周期關(guān)卡效應、DNA損傷修復通路，一旦損傷修復失敗或是不可逆損傷累積到一定程度，細胞凋亡將發(fā)生［4］。本研究表明125I粒子CLDR照射比60Co γ射線HDR照射引起更多H1299細胞發(fā)生凋亡。

以上實驗表明，125I粒子CLDR外照射比60Co γ射線HDR內(nèi)照射抑制NSCLC細胞系增殖的效應更明顯。隨后我們將著重于從蛋白水平探討125I粒子CLDR照射和60Co γ射線HDR照射抗增殖效應背后的潛在分子機制。電離輻射誘導凋亡主要經(jīng)過線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡途徑，凋亡進程中涉及一系列凋亡相關(guān)蛋白，如Bax、Bcl-2及半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）-3 等［18］。 相關(guān)研究表明，在前列腺癌、肺癌細胞中，125I粒子是通過下調(diào)促生長蛋白Bcl-2表達并激活caspase蛋白家族促使細胞凋亡，從而達到抑制腫瘤細胞生長的作用［19］。其中Bcl-2蛋白主要發(fā)揮抑制凋亡、延長細胞存活的作用，腫瘤細胞中過表達Bcl-2蛋白多提示腫瘤細胞對治療不敏感或不理想［20］。另外，Bcl-2蛋白家族中與Bcl-2蛋白作用相反的另一個成員Bax蛋白，也稱為促凋亡蛋白，主要發(fā)揮促進凋亡作用［5］。通常細胞是否發(fā)生凋亡取決于Bcl-2/Bax蛋白比［21］。本實驗中，照射劑量為4、8 Gy時，125I粒子CLDR照射與60Co γ射線HDR照射相比明顯上調(diào)H1299細胞促凋亡蛋白Bax表達，同時下調(diào)促生長蛋白Bcl-2表達；這表明Bcl-2/Bax蛋白比失衡可能加速H1299細胞凋亡發(fā)生，但并不排除其它可能存在的機制。

綜上所述，125I粒子CLDR內(nèi)照射比60Co γ射線HDR外照射抑制H1299細胞增殖效應更明顯，G2/M期阻滯、Bcl-2/Bax蛋白比失衡、最終誘導凋亡發(fā)生在125I粒子CLDR照射抗腫瘤效應中可能發(fā)揮重要作用。本研究雖僅著重于研究凋亡，但仍為中晚期NSCLC患者臨床治療提供了一些理論依據(jù)。

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