汪招雄，楊玉瑩，歐陽(yáng)金旭，楊豐利，江 濤，陳雪嬌

（1. 長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，荊州434023；2. 湖北省荊州市畜牧獸醫(yī)局，荊州434020）

·研究論文·

湖北省部分地區(qū)規(guī)?；半u場(chǎng)H5N1 Re-6亞型禽流感疫苗免疫效果調(diào)查

汪招雄1，楊玉瑩1，歐陽(yáng)金旭2，楊豐利1，江 濤1，陳雪嬌1

（1. 長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，荊州434023；2. 湖北省荊州市畜牧獸醫(yī)局，荊州434020）

禽流感（avian infl uenza，AI）是由A型流感病毒（Avian infl uenza virus，AIV）感染禽類(lèi)引起的一種從呼吸系統(tǒng)到全身嚴(yán)重?cái)⊙Y等多種癥狀的高度接觸性傳染病。目前，對(duì)我國(guó)家禽產(chǎn)業(yè)危害最大的高致病性禽流感病毒是H5禽流感病毒，幾乎所有的規(guī)?；半u場(chǎng)都進(jìn)行了H5禽流感疫苗的預(yù)防接種。為了解湖北省規(guī)模化蛋雞場(chǎng)H5N1 Re-6亞型疫苗免疫后抗體滴度，本研究于2014年1～12月期間在湖北省13個(gè)地區(qū)選擇不同規(guī)?；半u場(chǎng)，隨機(jī)采集2079份蛋雞血樣，用血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了H5N1 Re-6亞型禽流感抗體，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)與分析。結(jié)果顯示，規(guī)?；半u場(chǎng)H5N1 Re-6亞型抗體滴度在6 log2以上的樣品數(shù)占89.2%，能夠保護(hù)雞群抵抗同型病毒的感染。但H5N1 Re-6亞型禽流感抗體滴度整體不高，且仍有少量地區(qū)H5N1 Re-6亞型禽流感免疫合格率為60%～80%，提示部分雞群一旦感染該型病毒，仍然存在發(fā)病的危險(xiǎn)。

禽流感病毒；H5N1 Re-6亞型；規(guī)?；半u場(chǎng)；免疫效果

禽流感（avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）感染家禽后引起的多種癥狀的高度接觸性傳染病。近些年來(lái)，高致病性禽流感疫情已呈全球蔓延之勢(shì)，呈現(xiàn)出發(fā)生頻率加快，暴發(fā)次數(shù)增多，宿主范圍擴(kuò)大，危害更為嚴(yán)重的特點(diǎn)。H5N1高致病性禽流感的暴發(fā)，給家禽養(yǎng)殖業(yè)可造成毀滅性的打擊。病毒毒力較強(qiáng)時(shí)雞群可表現(xiàn)嚴(yán)重的全身性、出血性、敗血性癥狀，死亡率較高［1，2］。易感動(dòng)物包括雞、火雞、鴨、鵝、野生水禽等動(dòng)物。H5N1 AIV也可感染人類(lèi)，甚至導(dǎo)致患者死亡，對(duì)公共衛(wèi)生安全造成極大威脅［3］。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WHO）將禽流感歸納為A類(lèi)傳染病，我國(guó)將其定義為一類(lèi)傳染病。

我國(guó)將H5N1高致病性禽流感列為強(qiáng)制免疫的疫病之一，采取疫苗免疫和撲殺相結(jié)合的綜合策略，收到了比較好的防控效果［1，4］。近年來(lái)，流行的高致病性禽流感病毒在不斷的發(fā)生變異，疫苗的選擇根據(jù)流行毒株的變化需要進(jìn)行不斷的調(diào)整。2014年湖北省蛋雞群中流行的H5N1亞型禽流感毒株主要為2.3.2分支，市場(chǎng)上流通的疫苗也相應(yīng)的調(diào)整為H5N1 Re-6和Re-7二價(jià)滅活疫苗［5-9］。然而，由于防疫意識(shí)不高，免疫程序不合理，該疾病在部分蛋雞場(chǎng)仍然時(shí)有發(fā)生。疫苗免疫抗體監(jiān)測(cè)是了解疫苗免疫效果的有效方法，及時(shí)對(duì)疫苗免疫效果進(jìn)行檢測(cè)尤為必要［10］。本研究從湖北省不同地區(qū)隨機(jī)采集不同日齡蛋雞樣本，監(jiān)測(cè)H5N1 Re-6亞型禽流感疫苗免疫效果，以期制定符合當(dāng)?shù)仉u群防控H5N1亞型Re-6株禽流感免疫程序，從而對(duì)預(yù)防H5N1禽流感的發(fā)生和流行產(chǎn)生十分重要的生產(chǎn)指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 禽流感病毒 H5N1 Re-6亞型血凝抑制試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)抗原（生產(chǎn)批號(hào)：201305）；陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 血液采集及血清制備 對(duì)湖北省蛋雞養(yǎng)殖密集區(qū)域不同地區(qū)（安陸市、公安縣、荊門(mén)市、潛江市、石首市、松滋市、天門(mén)市、浠水縣、仙桃市、襄陽(yáng)市、孝感市、應(yīng)城市、棗陽(yáng)市）規(guī)模蛋雞場(chǎng)隨機(jī)采集血樣2079份。靜置1 h后離心5 min，取上層血清待檢。

1.2.2 1%紅細(xì)胞懸液制備 用一次性注射器采取健康非免疫公雞血液，放入加有抗凝劑的離心管中，抗凝劑與全血的比例約為1∶2，迅速混勻。然后離心5 min，吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，加入生理鹽水，慢慢混合均勻，離心5 min，棄去上清液，按照上述方法反復(fù)操作4～5次，制備紅細(xì)胞泥。配置1%紅細(xì)胞懸液。

1.2.3 抗原配制 取出凍干的濃縮抗原，加入2 mL生理鹽水稀釋融化后，測(cè)其抗原效價(jià)。能夠完全引起血凝的病毒最高稀釋度即為抗原效價(jià)，以此稀釋度作為1個(gè)HA單位抗原，配制4個(gè)HA單位抗原。

1.2.4 待檢樣品測(cè)定 根據(jù)血凝抑制試驗(yàn)操作規(guī)范對(duì)血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照［10］。

1.2.5 結(jié)果判定 在紅細(xì)胞對(duì)照出現(xiàn)完全沉淀，病毒對(duì)照出現(xiàn)完全凝集的情況下，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)作為該血清的血凝抑制滴度。當(dāng)被檢血清HI效價(jià)≥6log2時(shí)，判為合格；當(dāng)被檢血清HI效價(jià)≥9log2時(shí)，判為優(yōu)秀。

2 結(jié)果

2.1 不同月份樣本H5N1 Re-6亞型禽流感抗體效價(jià)按照不同月份，對(duì)2014年1～12月蛋雞血清共2079份進(jìn)行抗體分析，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

1～12月的HI抗體滴度平均值為8.14 1og2，達(dá)到合格水平。5月和7月H5N1 Re-6亞型禽流感平均抗體滴度最高，均為9.26 1og2，1月平均抗體滴度最低，為6.49 1og2。1月和12月樣本平均抗體效價(jià)均偏低，且與其他月份免疫合格率有很大差距。3月開(kāi)始平均抗體效價(jià)開(kāi)始升高，5月和7月達(dá)到最高，9～12月的平均抗體滴度逐漸降低（表1）。

所有檢測(cè)樣本的H5N1 Re-6亞型禽流感病毒抗體的總合格率為89.2%，總優(yōu)秀率為49.5%。其中合格率最低的是1月，為67.3%。抗體滴度最高的是7、9、10月，均為100.0%，10月以后逐漸降低。優(yōu)秀率最低的是12月，為13.4%，最高的是7月，為80.0%。其中1月和12月的優(yōu)秀率要明顯低于其他幾個(gè)月（表2）。

表1 規(guī)?；半u場(chǎng)不同月份 H5N1 Re-6亞型禽流感抗體效價(jià)Table 1 The antibody titer against H5N1 Re-6 subtype AIV in diff erent month from large scale layer farm

表2 規(guī)模化蛋雞場(chǎng)不同月份 H5N1 Re-6亞型禽流感抗體效價(jià)合格率和優(yōu)秀率Table 2 The qualifi ed rate and excellent rate of antibody titer against H5N1 Re-6 subtype AIV in diff erent month from large scale layer farm

2.2 不同地區(qū)蛋雞場(chǎng)樣本H5N1 Re-6亞型禽流感抗體效價(jià)分析 湖北省13個(gè)地區(qū)樣本中，抗體滴度平均值最低的樣本來(lái)源于應(yīng)城市，H5N1 Re-6亞型禽流感抗體效價(jià)平均為4.65 1og2；抗體滴度最高的樣本來(lái)源于安陸市，H5N1 Re-6亞型禽流感抗體效價(jià)平均為8.82 1og2。除了應(yīng)城市和松滋市的蛋雞樣本外，其他各個(gè)地區(qū)的H5N1 Re-6亞型禽流感抗體效價(jià)平均滴度值均在7.00 log2 以上（表3）。

表3 不同地區(qū)規(guī)?；半u場(chǎng) H5N1 Re-6 亞型禽流感抗體效價(jià)Table 3 The antibody titer against H5N1 Re-6 subtype AIV from diff erent area

各個(gè)地區(qū)采集來(lái)的血液樣本中，來(lái)源于應(yīng)城市血樣中H5N1 Re-6亞型禽流感抗體合格率最低，為15.0%，其次為公安縣，合格率為77.4%，其他地區(qū)合格率均在80.0%以上。來(lái)源于安陸市、潛江市、石首市、浠水縣的血樣合格率均為100.0%。來(lái)源于應(yīng)城市和松滋市的血樣的優(yōu)秀率最低，為0.0%和6.7%，浠水縣的血樣優(yōu)秀率最高，為70.0%，安陸市、潛江市、棗陽(yáng)市的樣本中 H5N1 Re-6 禽流感抗體優(yōu)秀率均高于60.0%（表4）。

2.3 不同日齡蛋雞場(chǎng)樣本H5N1 Re-6亞型禽流感抗體效價(jià)分析 不同日齡蛋雞血液樣本中，日齡小于等于120的樣本H5N1 Re-6亞型禽流感平均抗體滴度值最低，為7.44log2，隨著日齡的不斷上長(zhǎng)，樣本中H5N1 Re-6亞型禽流感平均抗體滴度值在120日齡到200日齡之間達(dá)到最高值，為8.83 log2（表5）。

不同日齡蛋雞樣本的H5N1 Re-6亞型禽流感抗體合格率均在80.0%以上，蛋雞日齡在120到200之間的合格率最高，為94.9%；蛋雞≥120日齡時(shí)，H5N1 Re-6亞型禽流感抗體優(yōu)秀率最低，為37.0%，明顯低于其他日齡蛋雞的血液樣本。不同日齡蛋雞中，H5N1 Re-6亞型禽流感抗體滴度≥9log2的低于70.0%（表6）。

3 討論

2014年對(duì)湖北省13個(gè)地區(qū)（縣、市）規(guī)?；半u場(chǎng)雞群H5N1 Re-6亞型禽流感病毒滅活疫苗免疫抗體水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，在不同月份、不同區(qū)域和蛋雞不同日齡，整體上H5N1 Re-6亞型禽流感抗體滴度較高，高水平維持時(shí)間較長(zhǎng)，基本可以保護(hù)蛋雞群免受同型病毒的感染。免疫效果與合理的免疫程序、合適的接種劑量以及對(duì)疫苗的正確選擇有著必不可分的聯(lián)系［12］。

表4 規(guī)?；半u場(chǎng)不同地區(qū) H5N1 Re-6亞型禽流感抗體效價(jià)合格率和優(yōu)秀率Table 4 The qualifi ed rate and excellent rate of antibody titer to H5N1 Re-6 subtype AIV from diff erent area

表5 不同日齡蛋雞 H5N1 Re-6 亞型禽流感抗體效價(jià)Table 5 The antibody titer against H5N1 Re-6 subtype AIV from diff erent layer farms

禽流感冬季與春季多發(fā)，相較于其他幾個(gè)月檢測(cè)樣本，1月和12月樣本平均抗體效價(jià)均偏低，且與其他幾個(gè)月免疫合格率有很大差距，這可能與冬季來(lái)臨有關(guān)。一方面天氣寒冷引起雞體產(chǎn)生較強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)，影響疫苗免疫效果，另一方面寒冷季節(jié)造成部分養(yǎng)殖企業(yè)減低疫苗密度，延長(zhǎng)H5N1 Re-6亞型禽流感疫苗免疫時(shí)間。冬季禽流感多發(fā)，雞群會(huì)面臨更大威脅，因此養(yǎng)殖企業(yè)要在冬季做好保溫措施，盡量降低蛋雞群機(jī)體的免疫應(yīng)激反應(yīng)，加強(qiáng)日常管理，注意通風(fēng)與保暖，并根據(jù)實(shí)際情況加強(qiáng)免疫，保證雞群對(duì)H5N1 Re-6亞型禽流感的合理免疫密度。2～7月的平均抗體效價(jià)和合格率、優(yōu)秀率都呈逐漸增高的趨勢(shì)，并且在7月達(dá)到最高值，這與天氣逐漸變暖前高免疫密度有關(guān)。8月的平均抗體效價(jià)、合格率優(yōu)秀率降低，這可能與夏季氣溫升高，雞群應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)和免疫力降低導(dǎo)致雞群產(chǎn)生抗體能力下降有關(guān)。9月的平均抗體效價(jià)、合格率優(yōu)秀率明顯高于8月，顯示雞場(chǎng)明顯加強(qiáng)了疫苗的免疫。9～12月平均抗體效價(jià)、合格率優(yōu)秀率逐漸降低，這可能與氣溫逐漸降低，雞群免疫力減弱有關(guān)。

表6 不同日齡蛋雞 H5N1 Re-6 亞型禽流感抗體效價(jià)合格率和優(yōu)秀率Table 6 The qualifi ed and excellent rate of antibody titer against H5N1 Re-6 subtype AIV from diff erent layer farms

在不同地區(qū)，蛋雞群H5N1 Re-6亞型禽流感疫苗免疫效果存在一定的差異，導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因可能與各地的免疫程序和選擇的疫苗有很大的關(guān)系。由于各個(gè)地方蛋雞場(chǎng)養(yǎng)殖習(xí)慣不一樣，養(yǎng)殖水平存在一定的差異，免疫程序、免疫途徑、免疫劑量和所免疫的疫苗也存在差異，因此建議養(yǎng)殖者根據(jù)最近幾年病原流行的變化調(diào)整免疫程序，及時(shí)進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)，提高這些地區(qū)雞群H5N1 Re-6亞型禽流感抗體水平［12］。

免疫接種是預(yù)防H5N1 Re-6亞型禽流感的最有效方法之一。為了切實(shí)防止H5N1 Re-6亞型禽流感的發(fā)生，還必須采取科學(xué)的方法進(jìn)行預(yù)防，比如在日常管理中認(rèn)真做好衛(wèi)生消毒等全方位的安全防護(hù)措施等。另外在禽流感疫苗的免疫接種過(guò)程中一定要注意注射部位、深度、劑量和衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，這樣才能保證確實(shí)的免疫效果。

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INVESTIGATION INTO FIELD EFFICACY OF H5N1 RE-6 AVIAN INFLUENZA VIRUS VACCINE ON LAYER FARMS IN HUBEI

WANG Zhao-xiong1， YANG Yu-ying1， OUYANG Jin-xu2， YANG Feng-li1， JIANG Tao1， CHEN Xue-jiao1
（1. College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou 434023， China； 2. Animal Husbandry Bureau of Jingzhou City， Heibei Province Jingzhou 434020， China）

Avian infl uenza is a highly contagious disease causing seriously systemic sepsis. At present， the most devastating agent for poultry industry in China is the H5 subtype Avian infl uenza virus （AIV）. Accordingly， almost all the laying hens of large-scale layer farms have been inoculated with H5 subtype AIV vaccine. In order to understand the fi eld eff i cacy of the H5N1 Re-6 subtype avian infl uenza vaccine， 2079 serum samples were randomly collected in 2014 from large-scale layer farms in thirteen regions of Hubei province to evaluate antibody levels in hemagglutination inhibition （HI） test. The H5N1 Re-6 subtype antibody titers were more than 6 log2 in 89.2% tested samples， which was believed to protect chickens against infection. However， the test results also showed that the antibody titers induced by Re-6 H5N1 subtype AIV were not high so that the risks of AIV infection remains in the regions with low antibody levels.

Avian infl uenza virus； H5N1 Re-6 subtype； large-scale layer farm； immune eff ect

S852.659.3

A

1674-6422（2015）06-0021-06

2015-11-17

長(zhǎng)江大學(xué)?；?/p>

汪招雄，男，博士，講師，主要從事動(dòng)物病毒致病機(jī)制研究

汪招雄，E-mail：luke751751@163.com