武專昌，王 鑫，魏建超，楊逸凡，趙秋華，邵東華，李玉明，齊鵬飛，劉 珂，李蓓蓓，邱亞峰，馬志永

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨沂 276000；3.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240；4.上海市閔行區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海201109）

·研究論文·

Tet-On系統(tǒng)調(diào)控p53穩(wěn)定表達(dá)的H1299細(xì)胞系的建立與應(yīng)用

武專昌1，王 鑫2，魏建超1，楊逸凡3，趙秋華4，邵東華1，李玉明1，齊鵬飛1，劉 珂1，李蓓蓓1，邱亞峰1，馬志永1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨沂 276000；3.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240；4.上海市閔行區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海201109）

應(yīng)用Tet-on系統(tǒng)和H1299細(xì)胞，建立了p53誘導(dǎo)表達(dá)的H1299細(xì)胞系p53-Tet H1299，p53表達(dá)受強力霉素（doxycycline，Dox）調(diào)控，存在一定的劑量依賴性。誘導(dǎo)表達(dá)的p53蛋白有很好的核定位能力和轉(zhuǎn)錄活性，能顯著上調(diào)p21、TLR3、Bax等多種p53轉(zhuǎn)錄激活的下游靶基因表達(dá)，同時還可顯著抑制水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）的復(fù)制，說明p53-Tet H1299可作為研究p53抗病毒作用的細(xì)胞模型。p53誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞系的建立為進(jìn)一步研究p53抗病毒作用機制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的篩選及其他生物學(xué)功能研究提供了很好的研究工具。

p53；Tet-on；H1299；Dox；抗病毒

腫瘤抑制因子p53在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期捕獲、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老、代謝和先天性免疫調(diào)控等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［1-6］，p53作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其功能發(fā)揮多依賴于p53激活后細(xì)胞核定位，轉(zhuǎn)錄起始或抑制許多靶基因的表達(dá)，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。近年來，p53與先天性免疫，特別是I型干擾素（I-IFN）信號通路的關(guān)系逐漸被揭示。p53具有增強I-IFN信號通路的抗病毒作用，一些在抗病毒先天性免疫中發(fā)揮重要作用的干擾素誘導(dǎo)基因也是p53直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶基因，如干擾素調(diào)節(jié)因子：IRF9、IRF5，模式識別分子：TLR3、RIG-I，抗病毒基因：干擾素刺激基因ISG15、蛋白激酶PKR等［7-10］。另外p53也是I-IFN直接轉(zhuǎn)錄的靶基因，I型IFN能轉(zhuǎn)錄p53基因，增加p53的蛋白水平，并且能增強IFN誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用［11］。

四環(huán)素（tetracycline，Tet）誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)是在大腸桿菌Tn10轉(zhuǎn)座子中特異的Tet抗性操縱子基礎(chǔ)上建立的一種用于調(diào)控基因表達(dá)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于基因功能和基因治療研究［12，13］。Teton調(diào)控系統(tǒng)主要由反義Tet轉(zhuǎn)錄活化因子（reverse tetracycline transcriptional activator，rtTA）、Tet應(yīng)答元件（Tet-responsive element，TRE）和誘導(dǎo)物（Tet衍生物、強力霉素Doxycycline）組成。在無Doxycycline（Dox）時，rtTA不能結(jié)合TRE，基因表達(dá)關(guān)閉；而Dox存在時，與rtTA結(jié)合，使其構(gòu)象改變，結(jié)合在TRE上，啟動基因表達(dá)。Tet-on誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)具有本底低、高誘導(dǎo)表達(dá)、特異性強和毒性小等優(yōu)點［12］。

為了更好的研究p53抗病毒的分子機制及其他生物學(xué)功能，選用p53表達(dá)缺失的H1299細(xì)胞和Teton 3G系統(tǒng)，建立了Dox誘導(dǎo)p53表達(dá)的H1299細(xì)胞系p53-Tet H1299，其p53表達(dá)受Dox的嚴(yán)格控制，并存在一定的Dox劑量依賴性。誘導(dǎo)表達(dá)的p53蛋白主要定位于細(xì)胞核中，能有效轉(zhuǎn)錄調(diào)控p53下游靶基因p21、Bax、TLR3、RIG-I和IRF9的表達(dá)。另外，在Dox存在條件下，p53拮抗的水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）［11］在p53-Tet H1299中的復(fù)制能力顯著受到抑制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299、乳倉鼠腎細(xì)胞BHK-21購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞保藏中心；水泡性口炎病毒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬病研究室保存；人p53真核表達(dá)質(zhì)粒p3xFlag-p53為本實驗室保存；Tet-on 3G誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)購自Clontech公司，包含質(zhì)粒pCMV-Tet3G、pTRE3G、pTRE3G-Luc和線性嘌呤霉素抗性DNA（Linear Puromycin Marker）。

1.2 試劑 抗生素G418、嘌呤霉素、多西環(huán)素（doxycyclin，Dox）和無四環(huán)素類抗生素的胎牛血清及XfectTM轉(zhuǎn)染試劑均購自Clontech公司；總RNA提取試劑盒（RNAiso Reagent）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR熒光定量試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTM）購自大連寶生物公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；快速限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶和胎牛血清購自Gibco公司；ECL發(fā)光試劑盒購自Pierce公司；Promega's Steady-Glo?螢光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；抗人p53單克隆抗體（DO-1）、p21單克隆抗體（F-5）和HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗購自Santa Cruz公司；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG熒光二抗購自Invitrogen公司；抗β-actin單克隆抗體購自Proteintech公司。

1.3 p53誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒pTRE-p53的構(gòu)建 p3× Flag-p53為模板，引物p53-Tet-F：5'-gaagatctAACCCC AATTGGGGAGGAGCCGCAGTCAG-3' 和p53-Tet-R：5'-cgggatcctcaGTCTGAGT-CAGGCCCTTC-3' 擴增p53基因，小寫部分為限制性內(nèi)切酶位點和保護(hù)性堿基，加粗部分為Kozak序列。擴增的1200 bp片段切膠回收，用Bgl II和Bam H I酶切位點連接到四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)載體pTRE3G中，測序陽性的重組質(zhì)粒命名為pTRE-p53。

1.4 H1299 嘌呤霉素和G418最小殺傷濃度的滴定H1299細(xì)胞傳代于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5×105細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24 h后，更換含不同濃度抗生素和5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，G418選擇0、100、200、300、400、500、600 μg/mL 6個梯度，嘌呤霉素選擇0、1、2、3、4、5、6 μg/mL的不同濃度處理，每3～4 d更換1次培養(yǎng)基和抗生素，選擇7～10 d內(nèi)細(xì)胞全部死亡的濃度作為細(xì)胞系抗性篩選的最小殺傷濃度。

1.5 p53-Tet H1299細(xì)胞系的建立 Tet-on 3G系統(tǒng)構(gòu)建p53誘導(dǎo)表達(dá)的H1299細(xì)胞系需要依次構(gòu)建pCMVTet3G（編碼反式激活因子Tet-on 3G和G418抗性）和pTRE3G-p53（編碼p53蛋白）的穩(wěn)定整合的細(xì)胞系。H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-Tet3G質(zhì)粒后，加300 μg/mL G418篩選，抗性克隆用熒光素酶報告試驗進(jìn)行篩選，選擇高誘導(dǎo)水平和低背景的克隆作為Tet-on 3G穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，命名為Tet-on 3G H1299。pTRE-p53和Linear Puromycin Marker共轉(zhuǎn)染Tet-on 3G H1299（pTRE-p53：Linear Puromycin Marker≥10∶1），用1 μg/mL 嘌呤霉素篩選，陽性克隆用Western blot進(jìn)行篩選，選擇p53蛋白受Dox誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控且表達(dá)水平最高的克隆命名為p53-Tet H1299。其他詳細(xì)步驟參照Clontech公司的Tet-on 3G誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)手冊。

1.6 熒光素酶活性試驗（luciferase reporter assay）將pCMV-Tet3G穩(wěn)定整合H1299細(xì)胞克隆傳代于24孔板，每個克隆接種2個孔。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%時，轉(zhuǎn)染pTRE3G-Luc質(zhì)粒和pTK-RL質(zhì)粒（10∶1比例），pTK-RL質(zhì)粒用于校正不同孔間轉(zhuǎn)染效率差異，轉(zhuǎn)染6 h后加1 μg/mL Dox處理或加等量滅菌ddH2O作未誘導(dǎo)對照，誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞樣品用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒（Promega）的方法，計算相對熒光素酶活性，篩選Tet-on 3G轉(zhuǎn)錄激活蛋白穩(wěn)定高效表達(dá)的克隆，相對誘導(dǎo)活性= （Luc+Dox/ RL+Dox）/（Luc-Dox/RL-Dox），其中Luc表示螢火蟲熒光素酶（Luciferase）活性，RL表示海腎熒光素酶（Rinilla）活性。

1.7 細(xì)胞生長曲線繪制 p53-Tet H1299細(xì)胞傳代于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1×104細(xì)胞/孔，培養(yǎng)12 h后，加1 μg/mL Dox處理，ddH2O做對照。分別于加藥后0、12、24、36、48、60、72 h消化細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)，每個時間點做3個重復(fù)，以培養(yǎng)時間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，繪細(xì)胞生長曲線。

1.8 熒光定量PCR 細(xì)胞用Trizol裂解后，提取細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 RNA提取和RT-qPCR反應(yīng)具體步驟參照TaKaRa公司的總RNA提取試劑盒（RNAiso Reagent）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和SYBR熒光定量試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTM）說明書。GAPDH作為內(nèi)參基因，采取2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)差異倍數(shù)。

1.9 VSV滴度測定（tissue culture infective dose，TCID50） 將BHK-21細(xì)胞接種96孔板（1×105細(xì)胞/孔），培養(yǎng)24 h后，每孔加入用空白DMEM逐級10倍稀釋的種毒液，100 μL/孔，感染2 h后，棄去培養(yǎng)基并用PBS洗滌1次后，加含2% FBS的培養(yǎng)基，37℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d后，計數(shù)病變孔，用Reed-Munch法計算病毒TCID50。

2 結(jié)果

2.1 p53誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒pTRE-p53的構(gòu)建 以p3x Flag-p53為模板，p53-Tet-F和p53-Tet-R為引物，用Pfu DNA聚合酶擴增p53基因，擴增出長約1200 bp的片段（圖1A），與目的基因大小一致。Bgl II和Bam H I酶切回收的片段和pTRE3G載體后，回收酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)與質(zhì)粒提取。Bgl II和BamH I雙酶切質(zhì)粒后電泳結(jié)果顯示，陽性質(zhì)粒出現(xiàn)長約1200 bp的p53基因和3430 bp的載體片段，與預(yù)期相符（圖1B）。陽性質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序，選取與人野生型p53序列完全一致的重組質(zhì)粒用于后續(xù)細(xì)胞系的建立。

2.2 Tet-on 3G穩(wěn)定表達(dá)H1299細(xì)胞系的建立 質(zhì)粒pCMV-Tet3G轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞并用300 μg/ml G418篩選，抗性克隆用克隆環(huán)消化傳代于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。為評估反式激活因子Tet-on 3G的轉(zhuǎn)錄活性，每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pTRE3G-Luc和pTK-RL，6 h后加1 μg/ mL Dox繼續(xù)處理24 h，誘導(dǎo)Luciferase的表達(dá)，用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒檢測相對熒光素酶活性。結(jié)果顯示在24株G418抗性的細(xì)胞克隆中，Dox誘導(dǎo)Luciferase表達(dá)水平差異很大，5#克隆相對熒光素酶活性最低，僅為0.79，而誘導(dǎo)活性最高的4#克隆為91.8（圖2）。選取Dox誘導(dǎo)后的相對熒光素酶活性最高的4#克隆繼續(xù)擴大培養(yǎng)，命名為Tet-on 3G H1299，用作建立下一步細(xì)胞系的細(xì)胞株。

圖1 p53基因PCR擴增和pTRE-p53質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 PCR amplifi cation of p53 gene and identifi cation of recombination plasmid pTRE-p53 by restriction enzymes digestion

圖2 熒光素酶報告試驗篩選Tet-on 3G穩(wěn)定表達(dá)H1299細(xì)胞克隆Fig.2 Screening of Tet-3G H1299 clones by luciferase reporter assay

2.3 p53穩(wěn)定誘導(dǎo)表達(dá)H1299細(xì)胞系的建立 pTRE-p53質(zhì)粒不含抗性篩選標(biāo)記，將100 ng Linear Puromycin Marker與2 μg pTRE-p53質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染Tet-on 3G H1299細(xì)胞，用1 μg/mL 嘌呤霉素篩選抗性克隆。挑取單細(xì)胞克隆傳代于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別用1 μg/ mL Dox或等量ddH2O處理，24 h后用Western blot檢測不同細(xì)胞克隆的p53表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在挑取的不同嘌呤霉素抗性克隆中，8#克隆p53表達(dá)受Dox調(diào)控，但表達(dá)水平比較低，而其他克隆Dox誘導(dǎo)后未發(fā)現(xiàn)p53蛋白表達(dá)，只有1#克隆p53蛋白高效表達(dá)且受Dox的誘導(dǎo)調(diào)控（圖3），將1#克隆命名為p53-Tet H1299細(xì)胞，并擴大培養(yǎng)。

圖3 Western blot篩選p53-Tet H1299細(xì)胞克隆Fig.3 Screening of p53-Tet H1299 clones by Western blot

2.4 p53誘導(dǎo)表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性的驗證 為了選取p53誘導(dǎo)表達(dá)所使用Dox的適合濃度，p53-Tet H1299細(xì)胞傳代于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2×105細(xì)胞/孔，培養(yǎng)12 h后，分別加0、0.01、0.1、0.5、1、2 μg/mL Dox誘導(dǎo)24 h，收集細(xì)胞檢測p53表達(dá)變化。Western blot結(jié)果顯示10 ng/mL Dox處理即可誘導(dǎo)p53表達(dá)，隨著Dox用量提高，p53蛋白表達(dá)有一定的上升趨勢；1 μg/mL Dox誘導(dǎo)時，p53表達(dá)量已達(dá)到最高水平（圖4A），選擇1 μg/mL Dox作為誘導(dǎo)p53高效表達(dá)的使用濃度。

作為轉(zhuǎn)錄因子，p53蛋白生物學(xué)功能的發(fā)揮依賴于細(xì)胞核聚集并轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游靶基因的能力。為了進(jìn)一步驗證Dox誘導(dǎo)表達(dá)的p53蛋白的生物學(xué)活性，分別檢測了p53核定位和轉(zhuǎn)錄下游靶基因的能力。IFA結(jié)果顯示，在1 μg/mL Dox誘導(dǎo)24 h后，p53大量表達(dá)，胞漿與胞核中均有分布，但主要分布于胞核中，與DAPI能很好的重疊在一起，表現(xiàn)出很好的核定位能力；未加Dox處理的細(xì)胞中，未檢測到p53的表達(dá)（圖4B）。TLR3、RIG-I和IRF9是干擾素信號通路中p53直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶基因，p21與Bax分別是p53參與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡過程的重要調(diào)控基因。為評估p53的轉(zhuǎn)錄活性，1 μg/ mL Dox處理p53-Tet H1299細(xì)胞24 h后，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行性對定量分析。qPCR結(jié)果顯示與對照組（-Dox）相比，Dox處理后TLR3、RIG-I、IRF9、p21和Bax基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)（圖4C），說明了誘導(dǎo)表達(dá)的p53具有很好的轉(zhuǎn)錄活性。

圖 4 p53的誘導(dǎo)表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性分析Fig.4 Transcriptional activity of induced p53 in p53-Tet H1299 cell

2.5 p53-Tet H1299細(xì)胞在p53抗病毒研究中的應(yīng)用p53-Tet H1299細(xì)胞系在Dox存在的條件下，能高效誘導(dǎo)p53表達(dá)，并轉(zhuǎn)錄調(diào)控其下游靶基因表達(dá)，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。p53可以調(diào)控p21等基因表達(dá)，參與細(xì)胞周期調(diào)控，誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯。含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，加1 μg/mL Dox處理Tet-on 3G H1299和p53-Tet H1299細(xì)胞的不同時間點測定細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞生長曲線發(fā)現(xiàn)Dox誘導(dǎo)后的0～12 h，兩種細(xì)胞的增殖動態(tài)基本一致。但12～72 h，p53-Tet H1299細(xì)胞增殖速率明顯減緩，72 h細(xì)胞數(shù)目僅為12 h的1.5倍，而Tet-on 3G H1299細(xì)胞仍然快速增殖，72 h細(xì)胞數(shù)是p53-Tet H1299的3倍多（圖5A）。說明Dox誘導(dǎo)p53表達(dá)抑制了細(xì)胞的增殖，從而限制了在研究抗病毒中的應(yīng)用。為此，在Dox誘導(dǎo)12 h后，培養(yǎng)基更換為含1μg/ml Dox和2% FBS的DMEM，細(xì)胞生長曲線表明，兩種細(xì)胞的細(xì)胞增殖速率均變慢，不同時間的細(xì)胞數(shù)基本相同（圖5B），從而排除了細(xì)胞增殖速率不同對評估p53抗病毒作用中的限制。

p53能抑制VSV等多種病毒復(fù)制，Tet-on 3G H1299和p53-Tet H1299細(xì)胞用1 μg/mL Dox處理12 h后，接種0.01 MOI VSV，感染1 h后，更換含1 μg/mL Dox和2% FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集細(xì)胞上清檢測病毒滴度（圖5C）。與Tet-on 3G H1299相比，p53-Tet H1299細(xì)胞上清的VSV滴度均顯著降低，僅為對照組的1/6（圖5D），說明p53抑制VSV的復(fù)制，p53-Tet H1299可作為研究p53抗病毒作用的細(xì)胞模型。

圖 5 p53-Tet H1299在研究p53抗病毒作用中的應(yīng)用Fig.5 Application of p53-Tet H1299 in studying antiviral role of p53

3 討論

當(dāng)細(xì)胞DNA產(chǎn)生損傷時，腫瘤抑制因子p53可以抑制細(xì)胞分裂，修復(fù)損傷的DNA或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，防止細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化與腫瘤形成，因而p53被稱為“基因組衛(wèi)士”［14］。從1979年發(fā)現(xiàn)p53開始，p53的多種功能逐步被揭示，涉及細(xì)胞周期、凋亡、衰老和免疫等多方面［15］，為進(jìn)一步研究p53在抗病毒先天性免疫和其他生物學(xué)過程中的作用，利用Teton系統(tǒng)和p53蛋白表達(dá)缺失的H1299細(xì)胞，建立了Dox處理下的實現(xiàn)p53功能獲得與缺失的p53誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞系。Dox誘導(dǎo)表達(dá)的p53蛋白能很好的定位于細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)，同時還能發(fā)揮其抑制VSV和流行性乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）復(fù)制的能力，為后續(xù)研究提供了很好的細(xì)胞模型。

基因誘導(dǎo)表達(dá)是調(diào)控基因表達(dá)與否或表達(dá)量高低的重要手段，Tet-on系統(tǒng)具有嚴(yán)謹(jǐn)性、特異性、本底低等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于基因功能研究［12，13］。H1299細(xì)胞p53基因發(fā)生部分缺失突變，蛋白表達(dá)缺失，結(jié)合四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，實現(xiàn)p53在H1299細(xì)胞內(nèi)的可控表達(dá)。p53-Tet H1299基于Tet-on系統(tǒng)并依賴于Dox誘導(dǎo)，四環(huán)素（Tet）并不能誘導(dǎo)p53表達(dá)，主要是因為Tet-on 3G轉(zhuǎn)錄激活蛋白并不結(jié)合四環(huán)素，不能引起其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用的構(gòu)象改變。p53-Tet H1299對Dox具有很高的敏感性，低至10 ng/ mL的Dox處理，即可引起p53的大量表達(dá)，1 μg/mL Dox處理已使p53表達(dá)達(dá)到最大的誘導(dǎo)水平。

當(dāng)評估p53-Tet H1299細(xì)胞在研究p53抗病毒中的可用性時，為排除Dox和轉(zhuǎn)錄因子Tet-on 3G對病毒復(fù)制的干擾，用Tet-on 3G H1299作為對照細(xì)胞。腫瘤抑制因子p53能誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制癌癥發(fā)生的作用，p53的誘導(dǎo)表達(dá)12 h后，p53-Tet H1299的增殖明顯受到抑制。Dox誘導(dǎo)72 h后，p53-Tet H1299細(xì)胞數(shù)量僅為Tet-on 3G H1299的1/3，使病毒有效感染和復(fù)制的細(xì)胞數(shù)量減少，從而難以評估p53抗病毒作用。細(xì)胞生長曲線顯示Dox誘導(dǎo)12 h并未改變細(xì)胞增殖速率，而此時p53已大量誘導(dǎo)表達(dá)，可以在此時感染病毒，然后再更換為含2% FBS的維持培養(yǎng)基，減緩細(xì)胞增殖，兩種細(xì)胞的增殖速率基本一致。病毒感染24 h后的細(xì)胞上清滴度測定結(jié)果顯示JEV和VSV在p53-Tet H1299細(xì)胞中的復(fù)制水平顯著降低，說明p53的誘導(dǎo)表達(dá)抑制了病毒的復(fù)制，進(jìn)一步驗證了p53的抗病毒活性及p53-Tet H1299在抗病毒研究中的可用性。

總之，本研究利用p53蛋白表達(dá)缺失的H1299細(xì)胞和Tet-on 3G系統(tǒng)建立了Dox誘導(dǎo)調(diào)控下p53表達(dá)細(xì)胞系p53-Tet H1299，誘導(dǎo)表達(dá)的p53具有很好核定位能力、轉(zhuǎn)錄活性和抑制VSV復(fù)制的能力，為進(jìn)一步研究p53抗病毒分子機制、靶基因篩查和其他生物學(xué)功能提供了有利的工具。

［1］ Mercer W E， Amin M， Sauve G J， et al. Wild type human p53 is antiproliferative in SV40-transformed hamster cells［J］. Oncogene， 1990， 5（7）∶ 973-980.

［2］ Mercer W E， Shields M T， Amin M， et al. Negative growth regulation in a glioblastoma tumor cell line that conditionally expresses human wild-type p53［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1990， 87（16）∶ 6166-6170.

［3］ Michalovitz D， Halevy O， Oren M. Conditional inhibition of transformation and of cell proliferation by a temperature-sensitive mutant of p53［J］. Cell， 1990， 62（4）∶671-680.

［4］ Yonish-Rouach E， Resnitzky D， Lotem J， et al. Wildtype p53 induces apoptosis of myeloid leukaemic cells that is inhibited by interleukin-6［J］. Nature， 1991，352（6333）∶ 345-347.

［5］ Serrano M， Lin A W， McCurrach M E， et al. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a［J］. Cell， 1997， 88（5）∶593-602.

［6］ Jones M， Davidson A， Hibbert L， et al. Dengue virus inhibits alpha interferon signaling by reducing STAT2 expression［J］. J Virol， 2005， 79（9）∶ 5414-5420.

［7］ Hsu T H， Chu C C， Jiang S Y， et al. Expression of the class II tumor suppressor gene RIG1 is directly regulated by p53 tumor suppressor in cancer cell lines［J］. FEBS Letters， 2012， 586（9）∶ 1287-1293.

［8］ Taura M， Eguma A， Suico M A， et al. p53 regulates Toll-like receptor 3 expression and function in human epithelial cell lines［J］. Mol Cell Biol， 2008， 28（21）∶6557-6567.

［9］ Mori T， Anazawa Y， Iiizumi M， et al. Identification of the interferon regulatory factor 5 gene （IRF-5） as a direct target for p53［J］. Oncogene， 2002， 21（18）∶ 2914-2918.

［10］ Munoz-Fontela C， Macip S， Martinez-Sobrido L， et al. Transcriptional role of p53 in interferon-mediatedantiviral immunity［J］. J Exp Med， 2008， 205（8）∶ 1929-1938.

［11］ Takaoka A， Hayakawa S， Yanai H， et al. Integration of interferon-alpha/beta signalling to p53 responses in tumour suppression and antiviral defence［J］. Nature，2003， 424（6948）∶ 516-523.

［12］ Gossen M， Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1992， 89（12）∶ 5547-5551.

［13］ Kistner A， Gossen M， Zimmermann F， et al. Doxycyclinemediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1996， 93（20）∶ 10933-10938.

［14］ Lane DP∶ Cancer. p53， guardian of the genome［J］. Nature，1992， 358（6381）∶ 15-16.

［15］ Levine A J， Oren M. The first 30 years of p53∶ growing ever more complex［J］. Nat Rev Cancer， 2009， 9（10）∶ 749-758.

（上接封二）

細(xì)菌

湖南省豬源糞腸球菌耐藥性分析 ...........................................................................王送林，等（2-41）

血清15型鵝源鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及交叉免疫保護(hù)研究 ........................姜安安，等（3-17）

應(yīng)用抑制性差減雜交篩選鴨疫里默氏桿菌強弱菌株基因組的差異片段 .................俞 慧，等（3-24）

上海副豬嗜血桿菌分離鑒定及其耐藥性分析 ...........................................................張 悅，等（4-25）

上海市動物源性食品中單增李斯特菌的流行病學(xué)及生物被膜形成能力研究..........................................................................................................................王少輝，等（4-31）

豬源假結(jié)核耶爾森氏菌的分離與鑒定 ...................................................................石於友，等（5-36）

鴨疫里默氏桿菌pfs基因的克隆表達(dá)及單克隆抗體制備 ......................................范國博，等（5-41）

鏈球菌蛋白G的結(jié)構(gòu)域重構(gòu)、表達(dá)及鑒定 ..............................................................許 瑞，等（5-46）

副豬嗜血桿菌外膜蛋白PlpD基因的原核表達(dá)及免疫保護(hù)性分析 .......................劉秋菊，等（5-53）

豬清道夫受體SRA/CD204多克隆抗體的制備以及該受體介導(dǎo)的細(xì)菌吞噬功能分析..........................................................................................................................黎倩倩，等（6-42）

致病性副溶血弧菌三重PCR檢測方法的建立和評價 ...........................................何再平，等（6-48）

副溶血弧菌TDH蛋白高效表達(dá)、免疫原性分析及初步應(yīng)用 ...............................李欣彤，等（6-56）

天津市奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗 ............................................馬騰宇，等（6-63）

寄生蟲

犬吉氏巴貝斯蟲截短型抗原BgTRAP的重組表達(dá)及其在診斷上的初步應(yīng)用..........................................................................................................................楊其清，等（1-21）

動物園野生動物消化道寄生蟲感染調(diào)查 ..................................................................羅 琴，等（1-27）

日本血吸蟲PDIA3的原核表達(dá)和多抗血清制備 ......................................................劉 群，等（1-33）

日本血吸蟲SjCHGC06822蛋白誘導(dǎo)BALB/c小鼠免疫保護(hù)效果觀察 ................段明明，等（1-39）

柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體的制備及其在蛋白定位中的應(yīng)用 .............李 莎，等（2-47）

柔嫩艾美耳球蟲沉默信息調(diào)節(jié)因子2 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在細(xì)胞中的表達(dá)..........................................................................................................................楊斯涵，等（2-53）

環(huán)形泰勒蟲表面抗原重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1生物信息學(xué)分析與原核表達(dá).............................................................................................................................任 方，等（2-60）

日本血吸蟲混合與單性感染雌蟲的形態(tài)觀察及凋亡檢測 ........................................韓 愉，等（3-30）

基于微小隱孢子蟲重組CP15/60蛋白的間接ELISA檢測方法的建立及上海市豬隱孢子蟲感染情況調(diào)查 ...................................................................................................劉宇軒，等（4-37）

喜鵲和山斑鳩體內(nèi)棘口科吸蟲的種類鑒定............................................................梁思婷，等（4-44）

兔感染日本血吸蟲后血漿中宿主源循環(huán)microRNAs變化研究 ............................王宇清，等（5-58）

毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫的構(gòu)建 ................................................蔡秀清，等（5-65）

華南虎獅弓蛔蟲三種線粒體基因的遺傳進(jìn)化分析 ................................................宋美冉，等（6-68）

其他

牛源ISG15 蛋白的原核表達(dá)及抗血清的制備 ..........................................................陶 潔，等（2-68）

磺胺氯吡嗪鈉單克隆抗體的制備及鑒定 ..................................................................張 夢，等（3-36）

鴨Toll樣受體3實時熒光定量PCR檢測方法的建立 ..........................................宋凱杰，等（3-42）

鴨TLR3基因胞外區(qū)的原核表達(dá)及抗體制備 ........................................................宋凱杰，等（5-70）

Tet-On系統(tǒng)調(diào)控p53穩(wěn)定表達(dá)的H1299細(xì)胞系的建立與應(yīng)用..........................................................................................................................武專昌，等（6-76）

·簡報·

一株雛鵝呼腸孤病毒的分離與鑒定 .......................................................................陳紅梅，等（1-47）

人工感染貓芮氏等孢球蟲卵囊排出規(guī)律的觀察 ....................................................張祖航，等（1-51）

四川省山羊多頭蚴線粒體cox2基因序列測定及種系發(fā)育分析............................郝桂英，等（1-54）

轉(zhuǎn)基因羊?qū)w表吸血蜱的生物學(xué)特性影響............................................................周勇志，等（1-60）

采用泊洛沙姆為佐劑的O型口蹄疫多肽疫苗對大鼠脾細(xì)胞的增值作用 .............王霄旸，等（2-74）

鴨甲肝病毒與新型呼腸孤病毒復(fù)合RT-PCR檢測方法的建立 ............................孫曉軍，等（3-50）

2011～2014年上海市屠宰場上市肉豬主要病毒感染情況調(diào)查 ..............................鞠厚斌，等（3-55）

川藏黑豬與長白豬仔豬豬瘟母源抗體消長規(guī)律比較研究 .....................................于吉鋒，等（3-61）

新疆喀什部分地區(qū)驢梨形蟲病檢測初報 ............................................卡麗比努爾·爾肯，等（3-65）

新疆阿勒泰富蘊縣馬自然感染消化道線蟲情況初報 .............................圖爾蓀·薩迪爾，等（3-69）

豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白在桿狀系統(tǒng)中的表達(dá)與純化 ...........................................張 曉，等（4-53）

洱源縣馬街自然村奶牛血吸蟲病綜合治理防控效果觀察 .....................................楊志平，等（4-57）

羊源長角血蜱吸血后中腸優(yōu)勢菌群分析 ...............................................................廖芷卉，等（4-61）

2010～2014年上海規(guī)模豬場母豬群偽狂犬病毒感染抗體血清學(xué)調(diào)查 ..................夏爐明，等（5-75）

·綜述·

藍(lán)氏賈第蟲致病機制的研究進(jìn)展 .............................................................................武 省，等（1-64）

巴貝斯蟲感染對宿主紅細(xì)胞及免疫系統(tǒng)的影響 ....................................................魏金龍，等（1-71）

中國蛙類吸蟲種類與地理分布 ..............................................................................門啟斐，等（1-78）

四種鈣信號蛋白及其在寄生蟲學(xué)上的初步研究 ....................................................王自文，等（2-78）

寄生蟲潛在藥物靶標(biāo)—乳酸脫氫酶 ..........................................................................李 莎，等（3-73）

傳染性法氏囊病病毒蛋白功能的研究進(jìn)展............................................................孫曉媛，等（3-81）

應(yīng)激顆粒和抗病毒先天性免疫 ..............................................................................董路娜，等（4-65）

副豬嗜血桿菌毒力因子的研究進(jìn)展 .......................................................................賈愛卿，等（4-72）

寄生蟲烯醇化酶的研究進(jìn)展 .....................................................................................陳 寧，等（4-81）

蜱半胱氨酸蛋白酶分子研究進(jìn)展 ...........................................................................于新茂，等（5-79）

ESTABLISHMENT AND APPLICATION OF P53 INDUCED EXPRESSION H1299 CELL LINE

WU Zhuan-chang1， WANG Xin2， WEI Jian-chao1， YANG Yi-fan3， ZHAO Qiu-hua4， SHAO Dong-Hua1，LI Yu-ming1，QI Peng-fei1， LIU Ke1， LI Pei-pei1， QIU Ya-feng1， MA Zhi-yong1
（1. Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China； 2. College of Life Science， Linyi University， Linyi 276005，China； 3. School of Life Sciences and Biotechnology， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200240， China； 4. Minhang Center of Animal Disease Prevention and Control in Shanghai， Shanghai 201109， China）

To explore new biological functions of p53， the inducable expression cell line p53-Tet H1299 was established using Tet-on technique in p53-defi cient H1299 cells. The p53 expression was regulated under doxycycline （Dox） in a dose-dependent manner. The Doxinduced p53 exhibited abilities to localize in the nuclei and to transactivate its target genes， such as p21， TLR3 and Bax. The replication of Vesicular stomatitis virus （VSV） was signifi cantly inhibited in p53-Tet H1299 with Dox treatment. The established p53-Tet H1299 cell line would be used as a cell model for exploring the new functions of p53， such as the antiviral mechanisms and the transcription of novel target genes.

p53； Tet-on； H1299； Dox； antiviral role

S852.723

A

1674-6422（2015）06-0076-07

2015-09-01

國家自然科學(xué)基金面上項目（81371814、81171547、81201266）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303045）

武專昌，男，博士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

馬志永，E-mail：zhiyongma@shvri.ac.cn