楊 洋，宋翠萍，盧鳳英，丁 鏟，彭大新

（1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

I型鴨肝炎病毒3C蛋白的原核表達(dá)和免疫學(xué)檢測

楊 洋1，宋翠萍2，盧鳳英2，丁 鏟2，彭大新1

（1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

本研究采用原核表達(dá)載體pET-32a在大腸桿菌中表達(dá)血清I型鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis virus serotype I，DHV-I）SH株的3C蛋白，經(jīng)超聲波裂解結(jié)果顯示，pET-3C融合蛋白呈現(xiàn)可溶性表達(dá)。利用 His-bind Resin試劑盒純化該產(chǎn)物，作為免疫原免疫小鼠，制備特異性抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測。結(jié)果表明，該抗體與原核表達(dá)產(chǎn)物、DHV感染的SPF尿囊液總蛋白呈現(xiàn)特異性反應(yīng)。由此可見，3C基因在大腸桿菌中可獲得成功表達(dá)，制備的多抗血清可用于3C 蛋白的檢測。

I型鴨甲型肝炎病毒；3C 蛋白；原核表達(dá)

鴨病毒性肝炎（duck viral hepatitis，DVH）是引起雛鴨的一種急性、高度致死性的傳染病，其病原為鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV），臨床癥狀主要為運(yùn)動失調(diào)，角弓反張，主要病變?yōu)楦闻K腫大出血。病原包括小RNA病毒科禽肝病毒屬的鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）、星狀病毒科禽星狀病毒屬的鴨星狀病毒（Duck astrovirus，DAstV）。DHV曾分為3個血清型，為I型（DHV-I）、Ⅱ型（DHV-Ⅱ）和Ⅲ型（DHV-Ⅲ），分別對應(yīng)以往所稱的鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）血清1型（DHV-1）以及2007年報道的臺灣DHV新型和韓國DHV新型DAst V則指歷史上所稱的DHV血清2型病毒（DHV-2），在國際病毒分類委員會第八次分類報告中，DHV-2被更名為鴨星狀病毒1型（Duck astrovirus LDAstV-1），DHV-3似可更名為DAstV-2，其中 DHV-I 型呈世界性分布，DHAV-2僅見于中國臺灣，DHAV-3流行于韓國和中國大陸［1-4］。

DHV編碼含一個2249個氨基酸的多聚蛋白，經(jīng)過蛋白裂解，產(chǎn)生3種結(jié)構(gòu)蛋白（VP0、VP3、VP1）和8個非結(jié)構(gòu)蛋白（2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。3C 蛋白是具有水解多聚蛋白活性的蛋白水解酶，在多聚蛋白水解、病毒復(fù)制和形成過程中發(fā)揮重要的作用［5］。本研究利用大腸桿菌BL21轉(zhuǎn)化系統(tǒng)表達(dá)DHV-1 SH 株的3C基因，制備其多抗血清，為 3C蛋白的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株和載體 DHV-1 SH毒株為本實驗室保存；pET-32a載體購自大連寶生生物公司；大腸桿菌 BL21（DE3）和 DH5α均為上海生工生物有限公司。

1.2 酶和相關(guān)試劑 Trizol試劑購于Invitrogen 公司；10 mmol/L dNTP、RNA 酶抑制劑（Rnasin）、Eco R I、Hind III均購自 TaKaRa 公司；Accquire Taq HF酶購自 Invitrogen公司；凝膠回收試劑盒、DNA片段快速回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自北京天根公司；DS 5000 Marker購自東盛科技有限公司；His標(biāo)簽單抗購自Erthox公司；His-band Resin親和層析試劑盒購自Millipore公司；預(yù)染蛋白質(zhì)Marker 購自NEB公司；Supersignal west pico Chemiluminescent Substrates ECL發(fā)光試劑盒購自Pierce公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù) DHV-I SH株全基因組序列（HQ265433.1），利用 Primer premier 5.0 設(shè)計3C基因序列的2對引物，引物序列（表1），引物均由上海生工生物公司合成。

表1 擴(kuò)增引物Table 1 Primers for amplifi cation

1.4 病毒 RNA 提取及3C 基因的擴(kuò)增 參照說明書按Trizol法抽提尿囊液總RNA。以提取的病毒RNA為模板，應(yīng)用隨機(jī)引物在 MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄獲得病毒基因組cDNA，隨后利用 Accquire Taq HF酶 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃變性2 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)后，72℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取8μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.5 重組質(zhì)粒載體 pET-3C 的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收純化，分別經(jīng)Eco R I、Hind III酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET-32a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，分別在含100 μg /mL氨芐青霉素（Amp）的LB瓊脂平板上37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，提取質(zhì)粒電泳篩選，進(jìn)行酶切鑒定，并送上海生工生物技術(shù)有限公司測序，正確的克隆命名為pET-3C。

1.6 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測 將重組質(zhì)粒 pET-3C轉(zhuǎn)化至 BL21（DE3），挑取單菌落分別接種于5 mL含Amp抗性的 LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，然后按1%接種量分別轉(zhuǎn)接至含Amp的5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)0.6～0.7 時，加入0.2～1.0 mmol / L IPTG，37℃誘導(dǎo)3～5 h及16℃ 2～10 h。離心收集菌體，溶于適量 PBS 中，超聲波裂解菌體，離心后分別收集上清及沉淀，-20℃保存?zhèn)溆?。相同條件下誘導(dǎo)空載體pET-32a，將誘導(dǎo)樣品和非誘導(dǎo)樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，然后轉(zhuǎn)印至NC膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，以鼠抗His單抗作為一抗，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠為二抗，Western blot 檢測表達(dá)產(chǎn)物。

1.7 重組蛋白純化及多抗血清制備 利用His-band Resin親和層析試劑盒收集并純化重組蛋白。將純化的蛋白包裹弗氏佐劑，免疫6周齡Balb/c小鼠，100 μg/只，每隔10 d免疫1次，4免后72 h時采血，分離血清作為鼠抗3C抗原血清 。

1.8 Western blot檢測 將病毒尿囊液、重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)物和空載體，利用12% SDS-PAGE分離，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)印NC膜，5%脫脂乳4℃封閉過夜；利用0.01 mol/L TBST溶液按1∶1000稀釋制備的3C陽性血清，37℃作用2 h后，0.01mol/L TBST洗滌10 min；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，稀釋度為1∶10 000，充分洗滌后，利用ECL顯色。

2 結(jié)果

2.1 3C 基因的克隆 以提取的尿囊液總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增出約550 bp 的目的條帶（圖1）。目的片段和載體連接后經(jīng)Eco R I、Hind III酶切獲得2 個條帶（圖2）。經(jīng)進(jìn)一步測序，克隆的3C基因序列及閱讀框完全正確。

圖1 鴨肝炎病毒3C基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR-amplifi ed 3C gene from DHV-I

圖2 重組質(zhì)粒pET-3C雙酶切鑒定Fig.2 Identifi cation of recombinant plasmid pET-3C by double enzyme digestion

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測 IPTG 濃度為0.2 mmol /L，16℃誘導(dǎo)2～8 h，重組蛋白可得到較高水平表達(dá)，pET-3C在上清、包涵體都有表達(dá)（圖3）。重組蛋白相對分子量約為38 kDa，見圖4，以抗His標(biāo)簽單抗對重組蛋白進(jìn)行鑒定，在目的位置出現(xiàn)1條特異條帶。將pET-3C的誘導(dǎo)菌液用His-band Resin親和層析試劑盒純化，結(jié)果見圖5。

圖3 pET-3C蛋白的可溶性分析Fig.3 Solublility analysis of the recombinant 3C protein by SDS-PAGE

圖4 純化蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the purifi ed recombinant protein

圖5 pET-3C蛋白 Western blot 鑒定Fig. 5 Western blot of pET-3C recombinant protein

2.3 多抗血清的 Western blot 鑒定 結(jié)果表明，獲得的pET-3C蛋白多抗血清不僅能與pET-3C蛋白重組蛋白發(fā)生反應(yīng)，而且能與 DHV-ⅠSH 毒株雞胚尿囊液反應(yīng)，形成大小約為38 kDa的條帶，如圖6。

圖6 3C多抗血清的Western blot鑒定Fig.6 Western blot of 3C antiserum

3 討論

鴨甲型肝炎病毒歸屬于小RNA病毒科、禽肝炎病毒屬、鴨甲型肝炎病毒種，3C 蛋白是一些小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一，它雖然不直接參與病毒RNA的復(fù)制，但是對多種前體蛋白的正確水解有力的保證了衣殼的形成和病毒的復(fù)制。3C 蛋白酶不僅裂解自身蛋白，也可以裂解宿主的細(xì)胞內(nèi)的蛋白，包括一些轉(zhuǎn)錄因子、翻譯因子、固有免疫信號分子及細(xì)胞的骨架蛋白，能夠抑制宿主蛋白的合成或功能的發(fā)揮，保證病毒的復(fù)制，還能使病毒逃避宿主的固有免疫，細(xì)胞骨架蛋白的重組有利于病毒的擴(kuò)散其他小核糖核酸病毒一樣，病毒基因組只編碼1個大的開放閱讀框，翻譯形成一多聚蛋白，需進(jìn)一步剪切加工形成結(jié)構(gòu)蛋白及病毒復(fù)制必須的功能蛋白［6-8］。

pET系統(tǒng)是有史以來在E.coli中克隆表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)。目的基因被克隆至pET質(zhì)粒載體上，受噬菌體 T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯（可選擇）信號控制，表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7 RNA聚合酶誘導(dǎo)。T7 RNA 聚合酶機(jī)制十分有效并具選擇性：充分誘導(dǎo)時，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個小時，目的蛋白通?？梢哉嫉郊?xì)胞總蛋白的50%以上。本研究用 pET-32a 表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了DHV-1 3C 蛋白，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出完整的3C基因，經(jīng)分析該基因長為 543 bp，與DHV-1SH 株序列同源性達(dá)100%，SDS-PAGE 電泳證明表達(dá)的pET-3C能在上清中表達(dá)，分子量約為38 kDa。

盡管 pET 原核系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白缺少翻譯加工功能，但表達(dá)產(chǎn)物依舊保持了良好的免疫原性。本研究利用表達(dá)的融合蛋白免疫小鼠制備了針對重組蛋白的多抗血清，Western blot 分析說明制備的多抗血清可與 DHV- 1 尿囊液中的 3C蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，制備的多抗血清具有很好的特異性，可作為檢測用抗體進(jìn)一步應(yīng)用于 DHV-1 3C 抗原的檢測及功能研究。

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PROKARYOTIC EXPRESSION AND DETECTION OF 3C OF DUCK HEPATITIS VIRUS TYPE 1

YANG Yang1， SONG Cui-ping2， LU Feng-ying2， DING Chan2， PENG Da-xin1
（1. College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China； 2. Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS，Shanghai 200241， China）

In this study， the prokaryotic expression vector pET-32a was used to express 3C protein of serum type I Duck hepatitis virus（DHV-I） SH strain in competent E.coli. The recombinant bacteria were sonicated and lysed followed by SDS-PAGE. The soluble fusion protein pET-3C was purifi ed using a His-bind Resin kit and used to immunize mice to prepare antiserum for use in Western blot. The results showed that 3C protein was expressed in E.coli， and polyclonal antibodies prepared were reactive in Western blot.

Duck hepatitis virus type 1； 3C protein 1； prokaryotic expression

S852.659.6

A

1674-6422（2015）06-0037-05

2015-11-06

863項目（2011AA10A209）；國家自然科學(xué)基金青年基金（31302099）

楊洋，男，碩士，主要從事動物分子病毒學(xué)研究

丁鏟，E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn；彭大新，E-mail：daxinpeng@yahoo.com