田啟會，祁光宇，楊織瑞

（1. 甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，武威 733006；2. 中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，蘭州 730046）

·研究論文·

山羊痘病毒 P32 基因的克隆及畢赤酵母中的表達(dá)

田啟會1，祁光宇2，楊織瑞2

（1. 甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，武威 733006；2. 中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，蘭州 730046）

將人工優(yōu)化合成的山羊痘病毒 P32基因和表達(dá)載體pPIC9K同時(shí)雙酶切后相連，構(gòu)建pPIC9K-IL-2 重組表達(dá)載體。將線性化的載體pPIC9K-P32電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，對重組酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng) MD 平板篩選和 PCR 分析鑒定后，經(jīng) G418 抗性梯度篩選，獲得多拷貝重組菌株，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot。SDS-PAGE 電泳顯示出相對分子質(zhì)量約為30 kDa 目的蛋白表達(dá)條帶，Western blot分析表明表達(dá)的蛋白具有反應(yīng)原性。本研究成功構(gòu)建載體pPIC9K-P32，并且P32基因已整合到酵母基因組中，為亞單位疫苗和鑒別診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。

羊痘病毒；P32 基因；畢赤酵母；分泌型表達(dá)載體；誘導(dǎo)表達(dá)；SDS-PAGE；Western blot

山羊痘（goat pox）是由山羊痘病毒（goat Poxvirus，GPV）感染山羊引起的一種高度接觸性的地方流行性傳染病，是所有動物痘病中最為嚴(yán)重的一種，OIE規(guī)定其必須上報(bào)，我國將其列為一類傳染病。山羊痘發(fā)病率高，對養(yǎng)羊生產(chǎn)危害性較大［1］。亞洲、非洲、歐洲以及中國的青海省、甘肅省、江西省、福建省、四川省、云南省等地均有山羊痘的發(fā)生［2］。歐洲和加拿大等國家的家羊和山羊群中 GPV 抗體陽性率高達(dá)95%，GPV 對易感羊群的致死率達(dá)75%～100%［3，4］。研究表明 GPV 基因組大小為143～147 kb，GPV P32位于GPV 基因組的64～65 kb處，GPV P32 具有抗原特異性，含有一個(gè)抗原決定簇、是由319～324 個(gè)氨基酸組成的囊膜蛋白，羧基端有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，對細(xì)胞有毒害作用［5-8］。GPV P32蛋白位于羊痘病毒膜表面，是目前世界各地分離鑒定的所有羊痘病毒毒株共有的且特異性很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白，具有羊痘病毒主要的抗原決定位點(diǎn)，免疫動物后能使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體［9，10］。P32蛋白既能用于預(yù)防羊痘的新型疫苗的研究，也可以用于羊痘診斷試劑盒的研制。巴斯德畢赤酵母是具有很多優(yōu)點(diǎn)的高效異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，能夠?qū)Φ鞍走M(jìn)行正確的折疊和加工，具有較高的生物活性，同時(shí)易于培養(yǎng)、成本低廉、表達(dá)量高，非常適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)［11］。本研究使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)經(jīng)過優(yōu)化后GPV P32 基因，為進(jìn)一步羊痘病毒亞單位疫苗及診斷試劑盒研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株 pMD19-T Simple Vector購自TaKaRa公司；Trans109 Chemically Competent Cell購于北京全式金生物公司；畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115和酵母分泌型表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9K 菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pUC57-Simple-P32合成質(zhì)粒（P32基因由南京金斯瑞合成，合成基因參考GeneBank中登錄號：AY159333）。

1.2 酶和相關(guān)試劑 限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ均為TaKaRa公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、DNA Marker（DL2000）；低分子量蛋白質(zhì)Marker、Agarose Gel DNA Extraction Kit 均購自O(shè)MEGA公司；D-生物素、T4 DNA連接酶、G418、D-山梨醇均購自 Promega公司；YNB（無氨基酸酵母氮源）購自北京經(jīng)科公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參考基因序列（NC_004003）優(yōu)化后合成pUC57-Simple-P32質(zhì)粒，利用 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)并合成了用于鑒定P32 基因的特異性引物 P32-F/P32-R。同時(shí)合成用于載體構(gòu)建鑒定和重組酵母菌鑒定用載體引物P-5'AOX1/P-3'AOX1，序列由南京金斯瑞合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primer

1.4 表達(dá)載體的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶 EcoR I 與Not Ⅰ分別對pUC57-Simple-P32質(zhì)粒和pPIC9K表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，膠回收后將載體片段和目的基因片段，在16℃ T4 DNA 連接酶的作用下連接過夜，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Trans109，提取質(zhì)粒分別進(jìn)行 PCR 和酶切鑒定，將 PCR 和雙酶切鑒定均為陽性的重組質(zhì)粒送大連寶生物有限公司進(jìn)行測序，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名 pPIC9K-P32。

1.5 重組酵母菌的構(gòu)建與重組酵母菌株的篩選 將10 μg經(jīng)測序鑒定為陽性的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SalⅠ進(jìn)行酶切，切膠回收后，將線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)酵母菌GS115中進(jìn)行重組。將MD培養(yǎng)基平皿中長出的轉(zhuǎn)化子，采用影印法依次接種到含G418濃度梯度 0.5、2.0、4.0 mg/mL的 YPD 培養(yǎng)基中，逐級篩選 G418 抗性菌株即目的基因高拷貝重組菌株，篩選得到的重組多拷貝菌株經(jīng)PCR法確認(rèn)。

1.6 重組酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá) 將轉(zhuǎn)化的單克隆重組酵母菌 GS115/pPIC9K-P32 分別接種于10 mL BMGY 培養(yǎng)基中，28℃、260～280 r/min振蕩培養(yǎng)16～18h，至菌體 OD600值大于2時(shí)，室溫離心5 min 收獲菌體。菌體沉淀用 20 mL BMMY培養(yǎng)基懸浮，28℃、260～280 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，每 24 h向培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲醇至終濃度為 1.5%，以保證持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)結(jié)束后，培養(yǎng)液 5000×g室溫離心10 min，收集上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE和 Western blot 分析 取50 μL 丙酮沉淀法濃縮的表達(dá)菌液上清，加等量1×SDS 樣品緩沖液100℃ 煮沸 5 min ，取30 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE 檢測。取等量空載體表達(dá)菌液做相同處理，作為陰性對照。將凝膠中的蛋白帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，3%BSA 室溫封閉過夜；然后以山羊痘高免血清（1∶300）為一抗，HRP 標(biāo)記兔抗山IgG（1∶500）為二抗進(jìn)行 Western blot；最后在 DAB +H2O2溶液中顯色觀察。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定 以重組質(zhì)粒pPIC9K-P32為模板，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶 EcoR I 與 Not I對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，可見1條約9300 bp片段和1條與目的基因片段大小相符的780 bp片段（圖1）。

圖1 重組pPIC9K-P32質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identifi cation of recombinant plasmid by enzyme digestion

2.1.2 重組質(zhì)粒的 PCR 鑒定 以重組質(zhì)粒pPIC9K-P32為模板，分別使用特異性引物P32-F/P32-R 和通用引物 5'-AOX1/3'-AOX1 進(jìn)行 PCR 鑒定，分別擴(kuò)增出大小約780 bp和1280 bp的條帶，與理論推斷大小一致（圖2），初步證明了目的基因成功克隆入載體中。

圖2 重組pPIC9K-P32質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Identifi cation of recombinant plasmid by PCR

2.2 重組酵母菌的構(gòu)建與重組酵母菌株的篩選 將初步經(jīng)過MD培養(yǎng)基中長出的轉(zhuǎn)化子，影印法依次接種到含G418的YPD 培養(yǎng)基中，逐級篩選 G418 抗性菌株，對菌株進(jìn)行PCR法鑒定，擴(kuò)增出目的基因約780 bp的菌株為重組多拷貝菌株（圖3、圖4）。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE和 Western blot 分析 將GS115/pPIC9K-P32 畢赤酵母重組菌株培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測，空載體菌體上清液中未檢測到目的蛋白。隨著甲醇的誘導(dǎo)從培養(yǎng)24 h的菌體沉淀中開始檢測到目的蛋白，相對分子質(zhì)量約30 kDa，與預(yù)期的大小一致。而空載體重組菌株 GS115/pPIC9K-P32 中未檢測到目的蛋白（圖5）。Western blot 檢測結(jié)果顯示，表達(dá)蛋白能與山羊痘陽性血清發(fā)生特異性的反應(yīng)（圖6），說明畢赤酵母菌系統(tǒng)成功表達(dá)的 GPV P32蛋白具有免疫學(xué)活性。

3 討論

P32基因全長969 bp，是羊痘病毒最特異的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有主要的抗原表位，在病毒感染早期產(chǎn)生抗體。針對該蛋白的單一血清可以中和羊痘病毒，這表明P32蛋白具有中和表位，可強(qiáng)烈誘導(dǎo)細(xì)胞免疫［12］。外源基因密碼子中存在過多的宿主低利用密碼子，尤其位于起始密碼子附近的低利用密碼子對基因的表達(dá)影響很大，解決這一問題的方法一般有兩個(gè)：一是通過點(diǎn)突變的方法用同義高利用率密碼子替代低利用密碼子，而不改變其氨基酸序列；另一個(gè)方法是截去基因中影響其表達(dá)但不影響生物活性的部分［13］。根據(jù)釀酒酵母高表達(dá)密碼子的偏愛性，對P32 基因進(jìn)行人工合成，在不改變其氨基酸序列的前提下，將幾個(gè)低利用率密碼子同義突變?yōu)楦呃寐拭艽a子，有利于蛋白表達(dá)量增加。P32完整蛋白對細(xì)胞有毒害作用［14］，剔除3'端的跨膜區(qū)，只截取P32 基因非跨膜區(qū)進(jìn)行人工合成。本實(shí)驗(yàn)室對P32 基因非跨膜區(qū)進(jìn)行過酵母的表達(dá)，但表達(dá)量低，經(jīng)過人工改造，位于10～12 bp堿基（AAA）、19～21 bp堿基（AAT）、22-24 bp堿基（GAT）、766～768 bp堿基（CAT）、778～780 bp堿基（TCA）分別同義突變?yōu)楫叧嘟湍父呃寐实拿艽a子：為AAG 賴氨酸（Lys）、AAC 天冬酰胺（Asn）、GAC 天冬氨酸（Asp）、CAC 組氨酸（His）、TCC絲氨酸（Ser），研究證明經(jīng)過人工改造合成的P32基因表達(dá)量明顯增加。

圖3 含G418的 YPD 培養(yǎng)基重組多拷貝菌株Fig.3 Restructuring muti-copy strain in YPD medium containing G418

圖4 高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.4 PCR identifi cation for the yeast transformants containing multicopy geneinsertion

圖5 表達(dá)產(chǎn)物pPIC9K-P32的SDS-PAGE電泳分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the expression of pPIC9K-P32

圖6 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of the expression of pPIC9K-P32

畢赤酵母（Pichia parstoris）可高效表達(dá)異源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá)重組蛋白具有糖基化修飾，但畢赤酵母比釀酒酵母連接到蛋白上的寡糖鏈更短更精確［15］。畢赤酵母能對所表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行加工、折疊、翻譯后修飾，并將其分泌到培養(yǎng)基中，這樣使得目的蛋白分離純化操作變得更簡便，因而是一種十分理想的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)。研究人員越來越多的利用畢赤酵母表達(dá)外源基因來生產(chǎn)相關(guān)蛋白，并已成功表達(dá)多種相關(guān)目的蛋白［16-18］。

所有畢赤酵母表達(dá)菌株都來源于野生型菌株NRRL-Y 11430，大多數(shù)菌株（包括KM71、GS115和SMD1168在內(nèi)）是組氨酸脫氫酶基因（his4）缺陷型菌株，可通過不含組氨酸培養(yǎng)基來篩選重組表達(dá)菌株。酵母菌 GS115 是營養(yǎng)缺陷型突變菌株［19］，自身不能合成組氨酸，只有當(dāng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母后利用載體上所攜帶的編碼HIS4基因才能合成組氨酸，因此，使用缺乏組氨酸的選擇性 MD 平板就可以篩選到重組的酵母菌株。pPIC9K載體上含有卡那霉素抗性基因，可抵抗與真核抗生素 G418 相關(guān)的藥物［20］，因此可以簡單地認(rèn)為對G418抗性的高低與載體的拷貝數(shù)相關(guān)。在使用G418篩選時(shí)，低濃度的G418可以獲得數(shù)量較多的單個(gè)菌落，而拷貝數(shù)較少；使用高濃度的G418獲得的單個(gè)菌落較少，而拷貝數(shù)較多，更加利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Carn等［21］用截短 P32 蛋白對動物進(jìn)行免疫，并可以檢測到 P32 抗體的產(chǎn)生，產(chǎn)生的抗體雖然不能阻止病毒在攻毒部位的復(fù)制，但有助于防止病毒的擴(kuò)散，說明截短 P32 蛋白仍具有良好的免疫原性。本研究采用密碼子優(yōu)化和截短表達(dá)，在酵母菌中成功表達(dá)了GPV P32 蛋白，免疫印跡試驗(yàn)也證實(shí)表達(dá)重組蛋白具有免疫反應(yīng)性，為亞單位疫苗和鑒別診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。

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CLONING AND EXPRESSION OF THE CAPRIPOXVIRUS P32 IN PICHIA PASTORIS

TIAN Qi-hui1， QI Guang-yu2， YANG Zhi-rui2
（1. Gasu Polytechnic College of Animal Husbandry & Engineering， Wuwei 733006， China； 2. Agricultural Veterinary Biological Science & Technology Co.，Ltd， Gansu 730046， China）

The recombinant Pichia pastoris GS115 was constructed for further research and development of the subunit vaccine and diagnosis reagent. The artifi cial synthetic P32 gene was subcloned into the Pichia pastoris expression vector pPIC9K， resulting in recombinant plasmid pPIC9K-P32.The plasmid was then transformed into Pichia pastoris GS115 by electroporation. The expressed product had a molecular weight of 30 kDa band in SDS-PAGE and reacted with the positive antiserum of CPV. The multi-copy recombinant P. pastoris strains were selected out with G418 and induced with methanol. The expressed product was analyzed in SDSPAGE and Western blot. The result showed that P32 gene was integrated with chromosome of Pichia pastoris as identifi ed in PCR.

Capripoxvirus； P32 gene； Pichia pastoris； secreted expression vector； induced expression； SDS-PAGE； Western blot

S852.659.3

A

1674-6422（2015）06-0031-06

2015-07-15

甘肅省科技計(jì)劃資助（1104NKCA167）

田啟會，碩士，主要從事臨床研究教學(xué)工作

楊織瑞，E-mail：westdotianqihui@163.com