何 懿 欒 杰

利用PDMS微孔陣列微型反應(yīng)器設(shè)計(jì)hADSCs空間堆疊模型

何 懿 欒 杰

目的利用微尺度技術(shù)（Micro-scale technologies）建立人脂肪干細(xì)胞（hADSCs）體外三維培養(yǎng)平臺(tái)，觀察空間堆疊狀態(tài)對(duì)種植后的hADSCs增殖和凋亡的影響。方法利用光刻技術(shù)在硅晶元表面生成直徑60 μm、80 μm、100 μm和150 μm的微柱狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒模、固化生成同規(guī)格的微孔陣列（Micro-well arrays），加裝PDMS環(huán)形外壁后組成微型反應(yīng)器，測(cè)量、分析此實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的加工誤差率；第3代hADSCs配制成1×105cells/mL、6×104cells/mL、3×104cells/mL三種濃度單細(xì)胞懸液，并各取200 μL分別接種于純平PDMS微型反應(yīng)器及直徑60 μm、80 μm、100 μm和150 μm微孔微型反應(yīng)器內(nèi)，選擇種植后24 h、72 h、120 h和168 h為采樣點(diǎn)，對(duì)各觀察組細(xì)胞分布狀況進(jìn)行形態(tài)學(xué)描述、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活/死細(xì)胞檢測(cè)。結(jié)果各孔徑PDMS微孔陣列的微孔口徑精度誤差率均不超過(guò)0.2%；檔hADSCs以6×104cells/mL濃度接種時(shí)，細(xì)胞基本可以實(shí)現(xiàn)在150 μm微孔內(nèi)呈單層平鋪、100 μm微孔內(nèi)呈2層堆疊、80 μm微孔內(nèi)呈3層堆疊；各微孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)在7 d內(nèi)均無(wú)明顯的數(shù)量變化，60 μm組微孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)最少且微孔外平面殘留細(xì)胞最多（P＜0.05）；60 μm組微孔內(nèi)凋亡細(xì)胞比例高于其他組（P＜0.05）。結(jié)論微加工倒模制作的PDMS微孔陣列培養(yǎng)平臺(tái)誤差率低，可滿足高精度設(shè)計(jì)需要；hADSCs短時(shí)間（7 d）接種于微孔內(nèi)處于增殖靜止?fàn)顟B(tài)，能夠保持三維堆疊狀態(tài)穩(wěn)定，便于進(jìn)行堆疊狀態(tài)下的細(xì)胞學(xué)早期研究；hADSCs在不同口徑微孔內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)不同的堆疊層數(shù)，其凋亡比率與堆疊層數(shù)有關(guān)，堆疊層數(shù)少的細(xì)胞凋亡比例低于堆疊層數(shù)多者。

微孔陣列微尺度技術(shù)聚二甲基硅氧烷人脂肪干細(xì)胞

將種子細(xì)胞種植于多孔支架,是組織工程體外構(gòu)建的主要方法。近年來(lái)，物理因素（包括表面結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)、硬度剛性及表面剪切力等）對(duì)干細(xì)胞的行為、轉(zhuǎn)歸及分化的影響受到眾多關(guān)注[1-3]。而細(xì)胞培養(yǎng)方法的研究也不斷深入：①平面培養(yǎng)不僅與在體及種植培養(yǎng)差異甚大，并且為細(xì)胞增殖提供了近乎無(wú)限的空間，有增加成瘤、變異的風(fēng)險(xiǎn)；②種子細(xì)胞接種支架后，對(duì)細(xì)胞的直接觀察只能停留在支架表面，而內(nèi)部觀察則需借助組織切片，無(wú)法即刻、直觀的觀察；③人工合成支架內(nèi)部孔隙率均一度不斷提高，需在種植前對(duì)細(xì)胞接種密度、搭配孔隙進(jìn)行更為細(xì)致的衡量。因此，迫切需要一種既能提供精密三維空間立體結(jié)構(gòu)，并可進(jìn)行直觀、實(shí)時(shí)分析的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

微晶片加工技術(shù)的發(fā)展使加工精度日益提高。進(jìn)入本世紀(jì)后，光刻技術(shù)可達(dá)到的精度更是進(jìn)入納米水平[4]。微加工技術(shù)制作的芯片，利用簡(jiǎn)單的印模方法，將精密結(jié)構(gòu)翻印至軟性材料表面，通過(guò)該技術(shù)可對(duì)細(xì)胞外環(huán)境進(jìn)行高精度設(shè)計(jì)，包括空間、流體、液相交互等[5]，制作精細(xì)的細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)[6]，可以不受影響地觀察干細(xì)胞的生物學(xué)特征[7-8]。

前期實(shí)驗(yàn)中我們參照文獻(xiàn)經(jīng)驗(yàn)[9]，在生物惰性材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面制作大量排列整齊的等深微米級(jí)微孔，證實(shí)此微孔陣列對(duì)于細(xì)胞體外培養(yǎng)是安全的，并發(fā)現(xiàn)大鼠脂肪干細(xì)胞（rADSCs）接種于這一平臺(tái)上后，細(xì)胞數(shù)量在短時(shí)間內(nèi)（4 d）處于增殖靜止?fàn)顟B(tài)[10]。在此基礎(chǔ)上，我們根據(jù)人脂肪干細(xì)胞（hADSCs）胞體直徑[11]制作符合其種植條件的多組不同直徑的微孔陣列微型反應(yīng)器，配合一定的接種密度，以期實(shí)現(xiàn)hADSCs模擬接種早期支架孔隙內(nèi)干細(xì)胞的不同空間排列狀態(tài)（平鋪、堆疊）。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

hADSCs（Cyagen，美國(guó)；HUXMD-01001）。

聚二甲基硅氧烷（PDMS）（Dow Corning，美國(guó)），脫模劑原液（奇威化工），hADSCs完全培養(yǎng)基（Cyagen，美國(guó)；HUXMD-90011）。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 光刻掩膜加工及光刻

設(shè)計(jì)硅晶圓，相鄰微孔中心點(diǎn)橫、縱向間距為200 μm，呈垂直排列，單位面積（1 cm×1 cm）內(nèi)共有48×48個(gè)微孔，合計(jì)2 304個(gè)微柱，刻蝕深度為50 μm?？瞻追娇?yàn)闊o(wú)結(jié)構(gòu)純平面，為對(duì)照組，面積1 cm×1 cm（圖1）。

1.2.2 PDMS微孔陣列微型反應(yīng)器的加工

①硅晶圓表面處理：將經(jīng)過(guò)清洗的硅晶圓浸于1∶100脫模劑稀釋液中，取出后圖形面向上置于80℃鼓風(fēng)烘箱內(nèi)烘干，使硅晶圓表面黏附一薄層脫模劑。

②混膠及初脫泡：取硅膠預(yù)聚物的前驅(qū)物A劑（基本組分）倒入玻璃器皿中，并按10∶1質(zhì)量比加入B劑（固化劑），用玻璃棒緩慢、充分?jǐn)嚢?，使A、B劑充分混勻。將PDMS放入負(fù)壓罐中（0.8 Kg/cm2）30 min，去除氣泡。

③底板澆筑及再脫泡：將PDMS（約15 g）傾倒于硅晶圓表面，水平放入負(fù)壓罐中（0.8 Kg/cm2）30 min，去除膠體與硅晶圓模板微柱間殘留的氣泡。

④外壁澆筑：將經(jīng)初脫泡的PDMS澆筑于清潔純平培養(yǎng)皿內(nèi)，厚度約2 mm。

⑤固化：將硅晶圓及培養(yǎng)皿水平置入100℃烤箱加溫1 h。

⑥起膜及切割：從邊緣處輕柔、緩慢掀起固化的PDMS膜，得到具有精細(xì)圖形的彈性PDMS膜。在超凈臺(tái)上用手術(shù)刀沿PDMS板微孔區(qū)域間的分割線切割，獲微型反應(yīng)器底板組件，大小約1.2 cm×1.2 cm（圖2 A）。再將純平培養(yǎng)皿內(nèi)固化的厚PDMS膜切割成大小約1.2 cm×1.2 cm的正方形，在其內(nèi)切割大小約1 cm×1 cm正方形空槽，為微型反應(yīng)器外壁組件（圖2 B）。

⑦清洗：將底板及外壁組件依次放入95%乙醇、75%乙醇、脫離子水進(jìn)行超聲清洗各3次，每次10 min。

⑧組裝：待組件徹底陰干后，在超凈臺(tái)上將底板組件微孔結(jié)構(gòu)面向上與外壁組件套合，以外壁組件的內(nèi)側(cè)壁剛好不覆蓋微孔結(jié)構(gòu)為度。將組裝好的微型反應(yīng)器置入100℃烤箱加溫1 h，使兩組件徹底黏結(jié)（圖2 C）。

⑨消毒及分裝：微型反應(yīng)器放入玻璃培養(yǎng)皿中高溫高壓滅菌（121℃～125℃，0.1～0.15 MPa，30 min）。依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，在生物安全柜內(nèi)將滅菌后的微型反應(yīng)器分裝于直徑10 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)有60 μm板、80 μm板、100 μm板和150 μm板各4個(gè)，空白板2個(gè)，每皿共18個(gè)微型反應(yīng)器。

⑩PDMS表面預(yù)處理：PDMS具有較強(qiáng)蛋白吸附能力，為滿足細(xì)胞種植需要，需使用含蛋白培養(yǎng)基進(jìn)行表面預(yù)處理。取含10%FBS的hADSCs完全培養(yǎng)基200 μL，注入PDMS微型反應(yīng)器培養(yǎng)區(qū)內(nèi)，放入負(fù)壓罐內(nèi)保持0.8 Kg/cm2負(fù)壓抽吸約10 min，使微孔內(nèi)的氣體完全被培養(yǎng)基替代，加蓋密封后置入37℃孵箱不少于72 h。

1.2.3 細(xì)胞種植

①細(xì)胞準(zhǔn)備：將hADSCs復(fù)蘇后進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。

②細(xì)胞種植：第3代hADSCs制成1×105cells/mL、6×104cells/mL、3×104cells/mL三種濃度的單細(xì)胞懸液，為高、中、低密度種植組。各取200 μL單細(xì)胞懸液（約含細(xì)胞5×103、1.2×104和2×104個(gè)）滴注于微型反應(yīng)器培養(yǎng)區(qū)內(nèi)。將培養(yǎng)皿置于恒溫水平搖床內(nèi)，在37℃下以30 r/mim晃動(dòng)30 min，使細(xì)胞自然沉降分布均勻，隨后置入37℃的CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.4 樣本采集

設(shè)置接種后24 h、72 h、120 h和168 h為采樣時(shí)間點(diǎn)，從培養(yǎng)皿內(nèi)取微孔陣列微型反應(yīng)器，每種直徑各2個(gè)、無(wú)結(jié)構(gòu)微型反應(yīng)器1個(gè)，分4次完成。

1.2.5 掃描電鏡觀察

取未經(jīng)表面處理及細(xì)胞種植的微孔板噴金后進(jìn)行掃描電鏡觀察，在高倍（1 600×）視野下垂直于微孔板拍照，并對(duì)60 μm、80 μm、100 μm和150 μm微孔板表面微孔直徑進(jìn)行測(cè)量，每種孔徑測(cè)量50個(gè)微孔，計(jì)算誤差率。

1.2.6 熒光染色及激光掃描共聚焦纖維鏡觀察

①細(xì)胞分布、堆疊狀態(tài)及微孔內(nèi)/外細(xì)胞計(jì)數(shù)：在每個(gè)采樣點(diǎn)對(duì)無(wú)結(jié)構(gòu)組及60 μm、80 μm、100 μm和150 μm微孔組進(jìn)行FITC-Phalloidin+DAPI熒光染色，掃描平面為微孔外表面細(xì)胞層及微孔內(nèi)細(xì)胞密集層，在低倍鏡（10×）下對(duì)20個(gè)獨(dú)立視野（共320個(gè)微孔）進(jìn)行拍照、觀察。結(jié)合細(xì)胞胞漿分布（FITC）和細(xì)胞計(jì)數(shù)（DAPI）確定微孔內(nèi)細(xì)胞分布、數(shù)量及微孔外細(xì)胞數(shù)量，并繪制柱狀圖。

②細(xì)胞凋亡比率：在每個(gè)采樣點(diǎn)對(duì)60 μm、80 μm、100 μm和150 μm微孔組進(jìn)行AnnexinⅤ-FITC+ PI熒光染色，設(shè)置掃描平面為微孔內(nèi)細(xì)胞最密集層次，在低倍鏡（10×）下對(duì)20個(gè)獨(dú)立視野（共320個(gè)微孔）進(jìn)行拍照、觀察。確定凋亡早期細(xì)胞（綠色）及死亡細(xì)胞（綠色及紅色）數(shù)量，根據(jù)該組微孔內(nèi)細(xì)胞平均數(shù)計(jì)算細(xì)胞凋亡比率，并繪制柱狀圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

微孔直徑測(cè)量值以x±s的形式記錄，并計(jì)算誤差率。對(duì)微孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)、活/死細(xì)胞比率進(jìn)行組間及整體均數(shù)比較，采用單因素方差分析（q檢驗(yàn)，Newman-Keuls法）。使用SPSS 11.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察結(jié)果

根據(jù)4種孔徑微孔各50個(gè)微孔測(cè)量結(jié)果分析，各孔徑微孔誤差率均低于0.2%（圖3）。

2.2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果

2.2.1 微孔內(nèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)

①高密度種植組：微孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著性變動(dòng)；60 μm微孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)最少（P＜0.05）；150 μm孔徑內(nèi)細(xì)胞數(shù)為最多，并以種植后72 h最明顯（P＜0.05）（圖4A及圖6A）。

②中密度種植組：微孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化；60 μm微孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)顯著少于其他組（P＜0.05）；80 μm、100 μm與150 μm微孔細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖4B及圖7A）。

③低密度種植組：細(xì)胞數(shù)量基本穩(wěn)定，存在空置微孔；60 μm微孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)最少（P＜0.05）；80 μm組細(xì)胞數(shù)在種植后72 h與100 μm、150 μm組存在顯著性差異（P＜0.05），其他采樣點(diǎn)三種孔徑間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖4C及圖8A）。

2.2.2 微孔外表面細(xì)胞計(jì)數(shù)

①高密度種植組：微孔外表面細(xì)胞數(shù)60 μm組最多，150 μm組最少（P＜0.05）；微孔外細(xì)胞數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)不斷增多，以60μm組增速最快（P＜0.05）（圖5A及圖6A）。

②中密度種植組：微孔外表面細(xì)胞數(shù)60 μm組最多，150 μm組最少（P＜0.05）；微孔外細(xì)胞數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)不斷增多；除60 μm組外其他各組在全部采樣點(diǎn)細(xì)胞數(shù)均未超過(guò)1（圖5B及圖7A）。

③低密度種植組：微孔外表面細(xì)胞數(shù)60 μm組最多，150 μm組最少（P＜0.05）；微孔外細(xì)胞數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)不斷增多；除60 μm組外其他各組在全部采樣點(diǎn)細(xì)胞數(shù)均未超過(guò)0.5（圖5C及圖8A）。

2.2.3 微孔內(nèi)細(xì)胞堆疊狀態(tài)

①高密度種植組：60 μm組以1～2個(gè)細(xì)胞單層平鋪為主；80 μm組呈堆疊排布，多為3～4層（3層占33.6%，4層占34.9%）；100 μm組呈堆疊排布，多為2～3層（2層占36.5%，3層占23.6%）；150 μm組呈堆疊排布，多為1～2層（1層占65.3%，2層占34.7 %）（圖6）。

②中密度種植組：60 μm組幾乎均為單個(gè)細(xì)胞單層平鋪（88.3%）；80 μm組：呈堆疊排布，多為3層（72.5%）；100 μm組呈堆疊排布，多為2層（65.3%）；150 μm組中絕大多數(shù)呈單層平鋪填滿微孔底面（95.6%）（圖7）。

③低密度種植組：60 μm組的微孔內(nèi)僅有單個(gè)細(xì)胞，有較多空置微孔；80 μm組中多數(shù)細(xì)胞平鋪分布（92.1%），有空置微孔；100 μm組呈單層平鋪狀，胞體不能填滿微孔底面，有空置微孔；150 μm組呈單層平鋪狀，胞體不能填滿微孔底面，有空置微孔（圖8）。

圖1 硅晶圓設(shè)計(jì)模板Fig.1Design template of silicon master

圖2 微型反應(yīng)器Fig.2Micro-reactor

圖3 微孔測(cè)量結(jié)果（掃描電鏡，1 600×）及誤差率Fig.3Measuring results(scanning electron microscope,1 600×)and error rate of microwells

圖4 高（A）、中（B）、低（C）密度組微孔內(nèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.4The average counting number of hADSCs within microwells under higher(A),medium(B)and lower(C)density of single cell suspension mixture

2.2.4 微孔內(nèi)凋亡細(xì)胞比率

①高密度種植組：60 μm孔徑內(nèi)凋亡細(xì)胞比例最高（P＜0.05）且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加；150 μm孔徑內(nèi)凋亡細(xì)胞比例最低，但與80 μm、100 μm及150 μm組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖9A）。

②中密度種植組：除24 h以外，其他取樣點(diǎn)中60 μm孔徑內(nèi)凋亡細(xì)胞比例均高于其他組（P＜0.05），并隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加；150 μm孔徑內(nèi)細(xì)胞凋亡比率在種植后168 h顯著低于80 μm、100 μm組（P＜0.05），其余采樣點(diǎn)80 μm、100 μm及150 μm組凋亡細(xì)胞比例無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖9B）。

③低密度種植組：60 μm孔徑內(nèi)凋亡細(xì)胞比例最高（P＜0.05），且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加；150 μm孔徑內(nèi)凋亡細(xì)胞比率最低，但與80 μm、100 μm無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖9C）。

圖5 高（A）、中（B）、低（C）密度組微孔外細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.5The average counting number of hADSCs out of microwells under higher(A),medium(B)and lower(C)density of single cell suspension mixture

圖6 高密度組微孔內(nèi)外細(xì)胞熒光染色（A）及微孔內(nèi)細(xì)胞堆疊層數(shù)統(tǒng)計(jì)（B）Fig.6The fluorescent staining of hADSCs within and out-of microwells (A)and the counting of stacking layer within microwells(B)under higher density of single cell suspension mixture

圖7 中密度組微孔內(nèi)外細(xì)胞熒光染色（A）及微孔內(nèi)細(xì)胞堆疊層數(shù)統(tǒng)計(jì)（B）Fig.7The fluorescent staining of hADSCs within and out-of microwells(A)and the counting of stacking layer within microwells(B)under medium density of single cell suspension mixture

圖8 低密度組微孔內(nèi)外細(xì)胞熒光染色（A）及微孔內(nèi)細(xì)胞堆疊層數(shù)統(tǒng)計(jì)（B）Fig.8The fluorescent staining of hADSCs within and out-of microwells(A)and the counting of stacking layer within microwells(B)under lower density of single cell suspension mixture

圖9 高（A）、中（B）、低（C）密度組微孔內(nèi)細(xì)胞凋亡比例Fig.9The ratio of apoptosis hADSCs within microwells under higher (A),medium(B) and lower(C)density of single cell suspension mixture

3 討論

3.1 PDMS微型反應(yīng)器構(gòu)建的必要性

傳統(tǒng)的PDMS微孔陣列大多選擇將PDMS膜固定于培養(yǎng)皿底部[12]，細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基也大多在此處與細(xì)胞產(chǎn)生接觸，并通過(guò)彌散方式使?fàn)I養(yǎng)成分、代謝產(chǎn)物獲得更替。雖然簡(jiǎn)便易行，但種植于其表面的細(xì)胞代謝產(chǎn)物會(huì)因?yàn)橄鄬?duì)偏多的培養(yǎng)液用量而稀釋，必然使細(xì)胞外液中的成分檢測(cè)陷入困境。

我們所設(shè)計(jì)的微型反應(yīng)器是在微孔陣列的基礎(chǔ)上，利用澆筑的厚PDMS膜將微孔反應(yīng)區(qū)圍筑起來(lái)。不僅保證了不同結(jié)構(gòu)微孔陣列反應(yīng)區(qū)的分隔，還可以使細(xì)胞種植范圍更加固定，不僅降低了細(xì)胞所接觸的培養(yǎng)液量，使細(xì)胞培養(yǎng)所需的成本降低，更重要的是盡可能地將培養(yǎng)液消耗、細(xì)胞代謝產(chǎn)物集中，降低因培養(yǎng)空間過(guò)大而稀釋的外分泌標(biāo)記物濃度。

3.2 hADSCs細(xì)胞選擇

微孔陣列實(shí)驗(yàn)平臺(tái)中的種子細(xì)胞用量，遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)體外細(xì)胞培養(yǎng)[13]，對(duì)細(xì)胞的純度要求較高。傳統(tǒng)ADSC的抽提如想獲得純度高的細(xì)胞群，大多需要較高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)輔助進(jìn)行篩選，要求較高。

本實(shí)驗(yàn)所選用的hADSCs由Cyagen公司經(jīng)專業(yè)化體外分離、培養(yǎng)后，獲得高純度符合hADSCs表型特征的細(xì)胞群。其細(xì)胞群?jiǎn)我恍猿^(guò)95%，避免了在微量細(xì)胞使用時(shí)，細(xì)胞混雜因素影響主群細(xì)胞行為，基本保證了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程的可比性。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)之初，我們也計(jì)劃在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，但受制于過(guò)多的分組，如果要收集滿足流式細(xì)胞檢測(cè)的細(xì)胞量，必然需要預(yù)先準(zhǔn)備大量的細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。對(duì)于這一檢測(cè)，我們會(huì)在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行完善。

3.3 微孔種植對(duì)hADSCs的影響

3.3.1 數(shù)量

根據(jù)實(shí)驗(yàn)可知，進(jìn)入微孔內(nèi)的細(xì)胞并未隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)數(shù)量的增減，這種停滯狀態(tài)可能與局部代謝減低有關(guān)[14]。這種數(shù)量的穩(wěn)定可使我們獲得穩(wěn)定的細(xì)胞三維空間堆疊狀態(tài)[13]，在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，微孔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量在種植后14 d開始減少，提示此停滯狀態(tài)僅限種植后早期，故這一平臺(tái)更適合于在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞非增殖類型實(shí)驗(yàn)。

3.3.2 堆疊

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，種子細(xì)胞會(huì)依據(jù)所給予的空間結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)立體排列。以相同的細(xì)胞種植量，在較小的空間內(nèi)會(huì)實(shí)現(xiàn)較多層的堆疊，在較大的空間內(nèi)會(huì)實(shí)現(xiàn)較少層的堆疊，甚至是平鋪生長(zhǎng)。影響微孔內(nèi)干細(xì)胞生發(fā)的因素包括：臨近的干細(xì)胞或成熟細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞骨架等[15]，干細(xì)胞會(huì)根據(jù)空間結(jié)構(gòu)調(diào)整自身細(xì)胞骨架，以滿足形態(tài)上的低耗能[16]，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞行為上的差異。

3.3.3 凋亡

根據(jù)實(shí)驗(yàn)可知，除60 μm組外其余直徑微孔內(nèi)細(xì)胞凋亡比率與平面培養(yǎng)物差異顯著。60 μm組微孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量最少，但單位細(xì)胞量的凋亡比例卻是最高的；150 μm微孔內(nèi)的細(xì)胞凋亡比例略低于80 μm和100 μm組。提示較大微孔開口帶來(lái)了更大的營(yíng)養(yǎng)、代謝物交換口徑，與細(xì)胞存活能力有關(guān)[17]。當(dāng)然不能排除由于多細(xì)胞層疊造成底層細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏、代謝物堆積。如果未來(lái)可以對(duì)微孔支架通透能力進(jìn)行改善，細(xì)胞的代謝狀態(tài)可能會(huì)有顯著改觀。

3.4 細(xì)胞種植密度及微孔選擇

每塊微孔板上共有2 304個(gè)微孔，懸浮hADSCs的直徑約為7~12 μm[11]，如要細(xì)胞在不同直徑微孔內(nèi)實(shí)現(xiàn)平鋪、堆疊狀態(tài)，以使用200 μL懸液為容量極值，細(xì)胞懸液濃度應(yīng)在（5~7）×104cells/mL的范圍。為保證種植濃度的客觀性，將理論濃度的0.5～2倍設(shè)計(jì)于實(shí)驗(yàn)中，即3×104cells/mL、6×104cells/mL、1×105cells/mL三種濃度配制單細(xì)胞懸液，每200 μL懸液中約含細(xì)胞5×103、1.2×104和2×104個(gè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，高密度種植組雖可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在微孔內(nèi)的堆疊狀態(tài)，但會(huì)造成微孔外剩余細(xì)胞數(shù)量過(guò)多，影響反應(yīng)平臺(tái)均一性；而低密度種植組會(huì)造成空置微孔增多，無(wú)法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞堆疊狀態(tài)；中密度種植組可在保證微孔外表面細(xì)胞殘留盡量少的前提下，滿足不同直徑微孔內(nèi)hADSCs實(shí)現(xiàn)不同空間排列狀態(tài)，即在150 μm微孔內(nèi)呈單層平鋪、100 μm微孔內(nèi)呈1~2層堆疊、80 μm微孔內(nèi)呈2~3層堆疊。

同時(shí)，60 μm組在3種濃度下都有最少的微孔內(nèi)細(xì)胞量及最高的微孔外細(xì)胞殘留，這與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相去甚遠(yuǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是由平鋪生長(zhǎng)與微孔立體生長(zhǎng)兩種狀態(tài)構(gòu)成，必然造成較大的誤差。

綜上所述，高密度和低密度種植組由于微孔外細(xì)胞殘留、微孔內(nèi)細(xì)胞堆疊、空置微孔等原因，并不適合描述微孔空間對(duì)細(xì)胞簇生發(fā)的影響。60 μm微孔由于不能滿足實(shí)現(xiàn)細(xì)胞空間堆疊需要，不適合用作hADSCs三維空間實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

4 結(jié)論

微加工倒模制作的PDMS微孔陣列培養(yǎng)平臺(tái)誤差率低，滿足高精度設(shè)計(jì)需要。hADSCs短時(shí)間（7 d）接種于微孔內(nèi)處于增殖靜止?fàn)顟B(tài)，能夠保持三維堆疊狀態(tài)穩(wěn)定，便于進(jìn)行堆疊狀態(tài)下的細(xì)胞學(xué)早期研究；hADSCs在不同口徑微孔內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)不同的堆疊層數(shù)，其凋亡比率與堆疊層數(shù)有關(guān)，堆疊層數(shù)少的細(xì)胞凋亡比例低于堆疊層數(shù)多者。

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The Designing of hADSCs Stacking Model by Utilizing PDMS Microwell Micro-reactor

HE Yi,LUAN Jie.

Department of Plastic and Reconstructive Surgery of the Breast,Plastic Surgery Hospital of CAMS,Beijing 100144,China. Corresponding author:LUAN Jie(E-mail:doctorluan@hotmail.com).

ObjectiveTo establish a three-dimensional cultivation platform for human adipose derived stem cells (hADSCs)by utilizing micro-scale technology,and to explore the influence of three-dimensional stacking condition to cell proliferation and apoptosis.MethodsMicro-columnar structure were generated by micro-scale technology on silicon master with diameter of 60 μm,80 μm,100 μm and 150 μm respectively.The same specification micro-well arrays were acquired by reversing mould aperture using polydimethylsiloxane(PDMS),which equipped with PDMS ring on the outer wall to constitute micro-reactor.The error rate of this platform was analyzed.Then the third generation of human adipose-derived stem cells(hADSCs)were selected and mixed into single cell suspension mixture with three kinds of concentration,including 3×104cells/mL,6×104cells/mL and 1×105cells/mL.And 200 μL cell suspension was injected into micro-reactor to establish three-dimensional culture models with different stacked layers.Then 24 hours,72 hours,120 hours and 168 hours were choosed as sample collection time point.The morphology description of cell distribution in each group was analyzed with scanning electron microscopy,the arrangement inside the microwells and the cell distribution outside the microwells were described,and the live/dead cells were counted and tested in each aperture and micro hole by using laser scanning confocal microscope.ResultsThe error rate of diameter and pore diameter were no more than 0.2%.When hADSCs were planted by the density of 6×104cells/mL,the stacking layer condition can be acquired.The number of cell within microwells was at static condition no more than 7 days.The 60 μm group had the highest number of out-of-well cell(P＜0.05)and lowestnumber of inside-of-well(P＜0.05).The highest apoptosis ratio was also observed in the 60 μm group(P＜0.05).Conclusion The application of microscale technique can acquire extremely low error rate,which can satisfy the requirements of high precision design.The static proliferation condition of planted hADSCs can be maintained within microwells,which can stabilize the condition of cells and be designed as a perfect three dimention model for cell research at early stage of plant. The stackable condition of hADSCs can be acquired by planting into microwells with different diameters,which can significant affect the rate of apoptosis under this three dimentional cultivate condition.Thinner layer of stack may reduce the rate of apoptosis.

Micro-well arrays;Micro-scale technology;Polydimethylsiloxane;Human adipose tissue derived stem cells

Q813.1+1

A

1673－0364（2015）04－0239－07

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.005

2015年4月9日；

2015年6月18日）

100144北京市中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院乳房整形及再造中心。

欒杰（E-mail：doctorluan@hotmail.com）。