杜 宏，吳南海，欒 佐

·基礎(chǔ)研究·

Notch信號(hào)通路抑制劑對(duì)原代耐藥白血病干細(xì)胞生長(zhǎng)分化的影響

杜 宏，吳南海，欒 佐

目的 探討Notch信號(hào)通路抑制劑對(duì)白血病干細(xì)胞自我更新及分化的影響。方法 分離再誘導(dǎo)化療前初次就診復(fù)發(fā)患者骨髓中單個(gè)核細(xì)胞與Notch信號(hào)通路阻滯劑γ-分泌酶抑制劑DAPT共培養(yǎng)。細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞存活率，干細(xì)胞集落培養(yǎng)測(cè)定集落形成能力及細(xì)胞自我更新能力。觀察細(xì)胞形態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD34、CD38、CD123、CD14的表達(dá)水平。結(jié)果 DAPT抑制細(xì)胞增殖及自我更新，破壞細(xì)胞增多，并可顯著減少S期(分裂期)細(xì)胞比例，使細(xì)胞分裂停滯于G1/G0期。結(jié)論 DAPT對(duì)細(xì)胞增殖和自我更新有抑制作用，并促進(jìn)其向成熟階段分化。

白血病干細(xì)胞；Notch信號(hào)通路；γ-分泌酶抑制劑

Notch基因最初是由突變果蠅翅上凹陷的表型所命名。隨著研究的深入，Notch信號(hào)通路作為一個(gè)高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在胚胎發(fā)育、組織再生及腫瘤產(chǎn)生等多方面功能逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。Notch信號(hào)通路的調(diào)節(jié)異常成為一系列血液系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵事件。在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)一類因干細(xì)胞功能異常而產(chǎn)生的一群具有自我更新能力的干細(xì)胞樣細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞，在白血病中稱白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells，LSCs)。LSCs的存在成為白血病復(fù)發(fā)、耐藥及難治的一重要因素。本研究選取難治復(fù)發(fā)白血病樣本中的單個(gè)核細(xì)胞為研究對(duì)象，難治及復(fù)發(fā)的臨床特征表明其單個(gè)核細(xì)胞群中存在LSCs。本研究通過Notch信號(hào)通路抑制劑對(duì)難治復(fù)發(fā)白血病中單個(gè)核細(xì)胞群中的白血病干細(xì)胞的自我更新及分化的影響作一初步研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 γ-分泌酶抑制劑DAPT(美國(guó)，Sigma公司)，溶于二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)中(美國(guó)，Xiasi Bio公司)，以1 mmol/L濃度分裝儲(chǔ)存于－20℃避光保存。淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)醫(yī)科院血研所科技公司)。1640培養(yǎng)液(美國(guó)，Gibco公司)。10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，中國(guó)醫(yī)科院血研所科技公司)。四甲基偶氮唑鹽(methylthio tetrazole，MTT，美國(guó)，Sigma公司)。H4434培養(yǎng)基(加拿大，Stem Cell公司)。CD34、CD38、CD123、CD14、及陰性對(duì)照鼠免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G(美國(guó)，BD公司)。

1.2 樣本采集 樣本選自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所韓明哲教授惠贈(zèng)初治復(fù)發(fā)白血病骨髓樣本9例，患者臨床特征見表1。取骨髓5 mL，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，骨髓不用肝素抗凝。采集后1 h內(nèi)經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)。

表1 患者臨床特征

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 分離出的MNCs接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液為加入10%FBS的1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2全濕條件下培養(yǎng)。加藥處理組DAPT以1 μmol/L濃度處理細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離的MNCs以1×104/mL接種于96孔板，每孔100 μL。DAPT以1 μmol/L濃度處理[1]，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)未加藥孔作為對(duì)照組，藥物作用5 d后加5% MTT溶液，每孔20 μL，置CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，離心棄上清終止培養(yǎng)，加入DMSO每孔150 μL，于Bio-Rad 450型酶標(biāo)儀570 nm讀取各孔吸光度(A570)值，按細(xì)胞存活率(%)＝A570用藥組/A570未用藥組× 100%計(jì)算。

1.5 干細(xì)胞集落培養(yǎng) 常規(guī)半固體培養(yǎng)法進(jìn)行造血祖細(xì)胞培養(yǎng)7 d計(jì)數(shù)集落數(shù)。

1.6 細(xì)胞自我更新能力檢測(cè) 1×105細(xì)胞于1 mL含10%FBS的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，取其中1×104細(xì)胞植于H4434培養(yǎng)基中，于7 d后計(jì)數(shù)集落數(shù)。

1.7 細(xì)胞形態(tài)檢測(cè) 藥物處理5 d后細(xì)胞PBS洗3遍，甩片后甲醇固定10 min，行瑞特-姬姆薩染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型 于藥物處理48 h后收集培養(yǎng)細(xì)胞，采用直接免疫熒光染色法，加入藻紅蛋白或異硫氰酸熒光素或藻紅蛋白偶聯(lián)物標(biāo)志的鼠抗人CD34、CD38、CD123、CD14及陰性對(duì)照鼠IgG孵育30min，F(xiàn)BS洗滌2次后加入1%多聚甲醛0.5mL上機(jī)，采用FACScabilur型流式細(xì)胞術(shù)CELLQuest軟件檢測(cè)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAPT對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT測(cè)定結(jié)果表明，1 μmol/L濃度DAPT對(duì)白血病細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，DAPT處理組較對(duì)照組可抑制細(xì)胞存活率的(82.4±15.2)%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.02)。

2.2 DAPT對(duì)細(xì)胞形態(tài)的作用 瑞特-姬姆薩染色顯示，DAPT作用后細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞膜出現(xiàn)芽狀或棘刺狀突起，且破壞細(xì)胞增多(油鏡放大100倍，圖1)。

圖1 經(jīng)DAPT處理后細(xì)胞形態(tài)變化(瑞特-姬姆薩染色，×100)

2.3 DAPT對(duì)干細(xì)胞集落形成能力的抑制作用對(duì)照組集落形成數(shù)較加入DAPT處理組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.01，圖2～4)。

圖2 低倍鏡下對(duì)照組克隆形成情況(未染色，×10)

圖3 高倍鏡下對(duì)照組克隆形成情況(未染色，×40)

圖4 加入DAPT處理7 d后細(xì)胞克隆形成情況(未染色，×40)

2.4 DAPT對(duì)細(xì)胞自我更新能力的作用 白血病細(xì)胞經(jīng)DAPT處理7 d后再植細(xì)胞集落形成能力明顯受抑，DAPT處理組較對(duì)照組再植細(xì)胞形成的集落數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.026)。

2.5 DAPT對(duì)細(xì)胞分化的影響 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表型的檢測(cè)，DAPT處理48 h后，CD34、CD34＋CD38－、CD123表達(dá)水平降低(P＜0.05)，CD14表達(dá)水平增高(P＜0.05)。對(duì)DAPT處理后細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期顯示，DAPT可顯著減少S期(分裂期)細(xì)胞的比例，使細(xì)胞停滯于G1/G0期(圖5、6)。

圖5 對(duì)照組流式細(xì)胞周期

圖6 處理組流式細(xì)胞周期

3 討論

干細(xì)胞是體內(nèi)最原始的一類細(xì)胞群，其具備自我更新及分化2個(gè)方面基本特征。同樣LSCs同造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)一樣也具備干細(xì)胞的特征，正是由于LSCs的自我更新特征使其成為白血病難治及復(fù)發(fā)的根本原因。因此，本研究中選取難治復(fù)發(fā)白血病樣本中的單個(gè)核細(xì)胞為研究對(duì)象，其難治及復(fù)發(fā)的臨床特征表明其單個(gè)核細(xì)胞群中存在LSCs。

Notch信號(hào)通路在調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新及分化的平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。Lee等[3]在最新的一系列有關(guān)HSCs研究中發(fā)現(xiàn)，白血病/淋巴瘤相關(guān)因子作為胚胎發(fā)育過程中特異性抑制干細(xì)胞自我更新特征的抑制物是通過抑制Notch信號(hào)通路Detta樣配體4的表達(dá)而發(fā)揮作用。由此可認(rèn)為，Notch信號(hào)通路的抑制有助于抑制干細(xì)胞的自我更新，也同樣可能抑制LSCs的自我更新而減少因此導(dǎo)致的白血病復(fù)發(fā)和難治。在關(guān)于HSCs研究中也發(fā)現(xiàn)，在HSCs中Notch信號(hào)通路的表達(dá)是增強(qiáng)的，而在HSCs的分化過程中則表達(dá)減弱[4]。由此提示，Notch信號(hào)通路可能在抑制干細(xì)胞分化、促進(jìn)其自我更新的過程中起作用。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用DAPT可促進(jìn)白血病細(xì)胞CD14的表達(dá)，而降低CD34的表達(dá)水平。提示Notch信號(hào)通路的阻滯可抑制干細(xì)胞水平的細(xì)胞自我更新而促進(jìn)細(xì)胞的分化，尤其是向單核細(xì)胞的分化。Neves等[5]利用表達(dá)Notch配體Delta1和Jagged1的基質(zhì)細(xì)胞與CD34＋CD38＋細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)顯示，Jagged1可減少粒系-巨系造血祖細(xì)胞集落和已分化的單核細(xì)胞數(shù)量，與本實(shí)驗(yàn)中Notch信號(hào)通路的阻滯促進(jìn)細(xì)胞的分化，尤其是向單核細(xì)胞的分化的結(jié)果相一致。

LSCs作為白血病復(fù)發(fā)根源，存在于難治復(fù)發(fā)的腫瘤細(xì)胞中，有關(guān)其是否有獨(dú)特的細(xì)胞表型也進(jìn)行了相關(guān)研究。研究發(fā)現(xiàn)，白介素-3受體(interleukin-3 receptor，IL-3R)即CD123在急性髓細(xì)胞性白血病(acute myelocytic leukemia，AML)中被頻繁發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為與白血病細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)及不良預(yù)后密切相關(guān)[6]。IL-3R的過表達(dá)涉及高度惡性白血病表型的病理發(fā)生機(jī)制。對(duì)AML各亞細(xì)胞群的CD123表達(dá)水平進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)在富含LSCs的細(xì)胞群即表型為CD34＋CD38－的細(xì)胞群中CD123表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照樣本中的CD34＋CD38－細(xì)胞群[7]。由此認(rèn)為，CD123可以作為L(zhǎng)SCs的標(biāo)志。體內(nèi)試驗(yàn)顯示，純化的CD34＋CD123＋細(xì)胞可植入非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠中競(jìng)爭(zhēng)性生成白血病細(xì)胞并維持白血病狀態(tài)，進(jìn)一步從功能上證實(shí)了CD34＋CD123＋細(xì)胞為L(zhǎng)SCs。針對(duì)Notch信號(hào)通路與LSCs的關(guān)系，Chiang等[8]在Notch誘導(dǎo)的T系急性淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)的鼠模型中進(jìn)行了相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在HSCs中Notch信號(hào)通路的活化導(dǎo)致最初的造血系統(tǒng)以及T系祖細(xì)胞的活化、增殖并同時(shí)打破干細(xì)胞的靜默狀態(tài)。在HSCs中超生理水平的Notch信號(hào)通路活化可促進(jìn)T系祖細(xì)胞中的LSCs的增殖，并同時(shí)伴隨長(zhǎng)期造血干細(xì)胞的消失。在本研究中，應(yīng)用Notch信號(hào)通路阻滯劑DAPT與白血病細(xì)胞共培養(yǎng)后，使CD123的表達(dá)水平下降，同時(shí)CD34＋CD38－表達(dá)水平也下降。提示Notch信號(hào)通路阻滯劑可以減少LSCs的數(shù)量，進(jìn)一步解釋DAPT可抑制樣本中白血病細(xì)胞的自我更新能力并促進(jìn)其分化的結(jié)果相一致。

經(jīng)Notch1結(jié)構(gòu)性活化激活的Notch信號(hào)通路是T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門-ALL的最重要的致癌性信號(hào)通路[9-10]。Tohda等[11]對(duì)8個(gè)白血病細(xì)胞系和15例AML樣本中Notch1和Jagged1蛋白水平進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路在AML中廣泛存在且存在異常，推斷與LSCs的自我更新增多及分化阻滯有關(guān)。Tohda等[12]又進(jìn)一步運(yùn)用 Delta重組蛋白與TMD7、OCI/AML-6細(xì)胞系體外共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Delta蛋白促進(jìn)TMD7細(xì)胞的短期生長(zhǎng)，而抑制自我更新及長(zhǎng)期生存。同樣在急性淋巴細(xì)胞白血病中，Notch信號(hào)通路也有異?；罨遗c腫瘤的耐藥及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。Yuan等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在T-ALL細(xì)胞系Jurkat中，Notch配體Jagged1和Notch受體Notch1均存在高表達(dá)，提示Notch信號(hào)通路自我活化的可能。應(yīng)用中和抗體阻斷Jagged1的表達(dá)可修復(fù)白血病細(xì)胞耐藥，提高其對(duì)藥物的敏感性。相反加入Jagged1重組體可對(duì)Jurkat細(xì)胞起到保護(hù)作用。而在應(yīng)用Notch信號(hào)通路阻滯劑DAPT的本研究中，腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞集落形成能力和自我更新能力均較對(duì)照組顯著受抑。本研究選取的樣本均為復(fù)發(fā)患者的腫瘤細(xì)胞，其在二次再植集落形成實(shí)驗(yàn)中，可二次再植形成集落的腫瘤細(xì)胞中不乏白血病干細(xì)胞的成分，也正是這部分細(xì)胞組分的存在才使得細(xì)胞原代具備較強(qiáng)的自我更新能力。Notch信號(hào)通路阻滯劑DAPT可極大地抑制這群細(xì)胞的自我更新能力的研究結(jié)果，也與Notch信號(hào)通路的過度活化導(dǎo)致的白血病的復(fù)發(fā)相一致。Grieselhuber等[14]的研究團(tuán)隊(duì)則在急性早幼粒細(xì)胞白血病中也進(jìn)行了相似的研究，在人急性早幼粒細(xì)胞白血病及前早幼粒細(xì)胞白血病的鼠模型(Ctsg-PML-RARα鼠)中應(yīng)用基因?qū)W或藥理學(xué)的Notch信號(hào)通路抑制劑均可去除前早幼粒細(xì)胞白血病的鼠模型中造血干/祖細(xì)胞已增強(qiáng)的自我更新能力，且在體內(nèi)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路的基因移植物可有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

Li等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與Notch配體共培養(yǎng)的白血病細(xì)胞出現(xiàn)了形態(tài)的改變，部分細(xì)胞黏附于底部，呈現(xiàn)外形變長(zhǎng)變窄，部分則呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞樣的形態(tài)。本研究中，應(yīng)用Notch信號(hào)通路阻滯劑后，也出現(xiàn)形態(tài)的改變，細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞膜出現(xiàn)芽狀或棘刺狀突起，且破壞細(xì)胞增多?？紤]與Notch信號(hào)通路受抑后，促進(jìn)細(xì)胞分化并改變細(xì)胞分化方向有關(guān)。

基于Notch信號(hào)通路在細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤生成過程中的關(guān)鍵性作用，Notch信號(hào)通路抑制劑抑制Notch信號(hào)通路并得以抑制腫瘤細(xì)胞生成及增殖的研究也廣泛開展[16]。本研究中，Notch信號(hào)通路阻滯劑DAPT對(duì)白血病干細(xì)胞自我更新及分化方面的作用雖然作了初步的探討，但對(duì)DAPT下一步用于抑制白血病干細(xì)胞自我更新以及促進(jìn)分化，并進(jìn)一步應(yīng)用于難治及復(fù)發(fā)白血病的治療指明了方向。

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Effects of Notch inhibitor γ-secretase inhibitor on the growth differentiation of primary drug-resistant leukemia stem cells

DU Hong，WU Nanhai，LUAN Zuo
(Department of Pediatrics，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

Objective We do some research about effects of Notch inhibitor γ-secretase inhibitor(DAPT)on the growth differentiation of leukemia stem cells(LSCs).Methods Mononuclear cells(MNCs)separated from bone marrow from 9 pro-induction chemotherapy relapsed patients were cultrure in wells with DAPT.We evaluated the cells survival rate by cell proliferation inhibition experiment，tested colony forming ability and the self-renewal capacity by stem cell colon cultivation，and observed cells morphology.We evaluated the expression levels of CD34，CD38，CD123，CD14 by flow cytometric analysis.Results The result showed that DAPT inhibited the cells proliferation and self-renewal capacity of LSCs and increased the express of differentiation marker such as CD14. There were more destroied cells by cultured with DAPT and less S phase cell by cultured with DAPT，more cells were division arrested in G1/G0 phase.Conclusion DAPT have inhibitory action to LSCs proliferation and self-renewal capacity.DAPT can promote the LSCs different to more maturation stage.

Leukemia stem cells(LSCs)；Notch pathway；γ-secretase inhibitor

R733.7

A

2095-3097(2015)01-0032-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.01.010

2014-01-02 本文編輯:徐海琴)

100048北京，海軍總醫(yī)院兒科(杜 宏，吳南海，欒 佐)

欒 佐，E-mail:luanzuo＠aliyun.com.cn