Ghrelin對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制探討

陳任，方姝晨，寧宇，范里，陳家祿

Ghrelin對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制探討

陳任1，方姝晨2，寧宇2，范里1，陳家祿1

目的：探討Ghrelin對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制。方法：野生型（WT）組和CGRP基因敲除（CGRP-/-）組小鼠各10只，且各分為對(duì)照亞組和實(shí)驗(yàn)亞組各5只，均腹腔注射100μL含0.1μg/LGherlin的PBS試液（實(shí)驗(yàn)亞組）或空白PBS試液（對(duì)照亞組），進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及記憶探索實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定其海馬趾組織中CGRP、IGF-1及IGF-1mRNA含量。結(jié)果：WT組中，實(shí)驗(yàn)亞組與對(duì)照亞組比較，逃避潛伏期時(shí)間縮短，目標(biāo)區(qū)域停留時(shí)間百分比增加，CGRP、IGF-1及IGF-1mRNA的含量較高（P＜0.05）；CGRP-/-組中，實(shí)驗(yàn)亞組與對(duì)照亞組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與CGRP-/-組實(shí)驗(yàn)亞組比較，WT組實(shí)驗(yàn)亞組注射第4、5天的逃避潛伏期較低，目標(biāo)區(qū)域停留時(shí)間百分比較高，CGRP、IGF-1及IGF-1mRNA含量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：Gherlin可能通過促進(jìn)海馬體釋放CGRP，使得海馬的IGF-1產(chǎn)量增加，由此提高小鼠的認(rèn)知能力。

Ghrelin；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；認(rèn)知功能

Ghrelin是一種28個(gè)氨基酸組成的?；模渥钤鐝拇笫笪附M織中分離純化出來，并被認(rèn)為是生長(zhǎng)素促分泌物受體-1a（growth hormone secretagogue receptor-1a，GHSR-1a）的內(nèi)源性配體[1]。Ghrelin能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生存[2]，并有增加攝食量、增強(qiáng)胃腸道活動(dòng)、促進(jìn)胃酸分泌、引發(fā)肥胖和增重等作用[3]。除這些生物活性外，Ghrelin可通過作用于海馬趾的神經(jīng)元從而提高空間學(xué)習(xí)能力，并且可誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)中新的突觸結(jié)構(gòu)形成[4]。已有實(shí)驗(yàn)證明，刺激小鼠感覺室周器官（circumventricular organs，CVOs）后，CVOs中神經(jīng)元通過釋放降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）可促進(jìn)海馬趾產(chǎn)生胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）。CGRP是一種由降鈣素基因選擇性剪切轉(zhuǎn)錄形成37個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)肽[5]，廣泛分布于中央及周圍神經(jīng)系統(tǒng)[6]。

為了驗(yàn)證Ghrelin是否可以刺激感覺神經(jīng)元，從而促進(jìn)海馬中CGRP的釋放，進(jìn)而增加IGF-1的含量，最終提高小鼠的認(rèn)知功能，本文將CGRP基因敲除型（CGRP-knockout，CGRP-/-）小鼠（其CVOs中神經(jīng)元無法正常合成CGRP）與野生型（wild-type，WT）小鼠進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6品系WT小鼠（WT組）和該品系CGRP基因敲除小鼠[7]（CGRP-/-組）各10只，鼠齡10～12周，體質(zhì)量21～24 g，均在23℃～25℃溫控、12 h白天-黑夜循環(huán)控制及自由、充足攝食條件下飼養(yǎng)。每組小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)亞組和對(duì)照亞組各5只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 C18反向色譜柱（購(gòu)于英國(guó)Amersham公司）；酶免疫測(cè)定試劑盒（購(gòu)于法國(guó)SPI-BIO公司）；polytron型勻漿機(jī)（購(gòu)于瑞士Kinematica公司）；酶免疫測(cè)定試劑盒（購(gòu)于美國(guó)Diagnostic Systems Laboratories公司）；Trizol試劑（購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司）；7700型測(cè)序儀（購(gòu)于日本Perkin Elmer Applied Biosystems公司）；Taqman PCR試劑盒（購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems公司）；

1.2 方法

所有小鼠均腹腔注射 100μL含0.1μg/LGherlin的PBS試液（實(shí)驗(yàn)亞組）或空白PBS試液（對(duì)照亞組）。從制模當(dāng)天起連續(xù)5 d每天9點(diǎn)與15點(diǎn)各注射一次，每天進(jìn)行一次Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，最后一次實(shí)驗(yàn)后2 h進(jìn)行空間記憶探索實(shí)驗(yàn)，記錄結(jié)果。在最后一次實(shí)驗(yàn)后30～60m in內(nèi)將動(dòng)物處死，快速取腦，進(jìn)行海馬中CGRP、IGF-1、IGF-1mRNA的測(cè)定。

1.2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及記憶探索實(shí)驗(yàn)[8]水迷宮由一個(gè)直徑150 cm的圓形池及一個(gè)小鼠站臺(tái)組成，池中控制水恒溫30℃，池中放置一個(gè)易辨別的圓形塑料小鼠平臺(tái)，直徑12 cm。將小鼠站臺(tái)放置于池的東南角，沒入水面下1 cm。每只放入水迷宮的小鼠有90 s的時(shí)間去尋找并爬上站臺(tái)。若小鼠爬上站臺(tái)后，使其在站臺(tái)上停留10 s。記錄小鼠找到平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期。若小鼠未在90 s內(nèi)找到站臺(tái)，實(shí)驗(yàn)者將小鼠引向站臺(tái)，同樣停留10 s，潛伏期記錄為90 s。每只小鼠每天進(jìn)行一次Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行5 d。最后一次實(shí)驗(yàn)后2 h進(jìn)行空間記憶探索實(shí)驗(yàn)。將水池中的站臺(tái)移除后，將小鼠放入水池中90 s，將原站臺(tái)中點(diǎn)為中心半徑30 cm的水域劃分為目標(biāo)區(qū)域。記錄每只小鼠在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)所停留的時(shí)間，計(jì)算其占總時(shí)間的百分比。

1.2.2 海馬中CGRP、IGF-1、mRNA的測(cè)定方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，快速取腦，細(xì)心分離出海馬，冷凍后等待處理。①海馬CGRP含量的測(cè)定：海馬組織稱重后，在0.5m L的2mol/L醋酸中混合均勻，將混合物置于90℃水浴中20m in，然后4 500 g離心10m in（4℃）。用C18反向色譜柱將CGRP從上清液中萃取（柱的制備：先用5m L甲醇自上而下沖洗柱體，然后20m L 0.1%三氟乙酸沖洗，最后在氮?dú)猸h(huán)境中使沖洗溶劑揮發(fā)）。使用專用的酶免疫測(cè)定試劑盒測(cè)定，CGRP的測(cè)定敏感度為10 pg/m L。②海馬IGF-1含量的測(cè)定：將組織加入1m L 1mol/L醋酸中，使用Polytron型勻漿機(jī)將海馬組織切碎（2次，每次15 s），并使其混勻，然后4 500g離心分離10 min，取上清液于－80℃冷藏器中保存，使用專用的酶免疫測(cè)定試劑盒測(cè)定IGF-1濃度。③mRNA定量分析：組織稱重后浸入液氮中，所有的mRNA均按照制造商的說明用Trizol試劑從海馬組織中萃取。在每50～100mg組織加入1m L Trizol，于4℃12 000 rpm離心10m in，取上樣品會(huì)分成三層：黃色的有機(jī)相、中間層和無色的水相，mRNA主要在水相中，把水相（通?？晌?50μL）轉(zhuǎn)移到新管中。由于cDNA是以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄而來，故通過樣品cDNA的測(cè)定來計(jì)算mRNA含量。樣品cDNA放大所需條件：7700型測(cè)序儀、引物、雙標(biāo)記基因探針、Taqman PCR試劑盒。溫度控制95℃、10min使其失活，隨后95℃、15 s使其變性，60℃、1m in退火并解鏈，循環(huán)40次。標(biāo)本的IGF-1與β肌動(dòng)蛋白的比值作為作為衡量mRNA含量的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力比較

WT組中，實(shí)驗(yàn)亞組與對(duì)照亞組比較，逃避潛伏期時(shí)間縮短，目標(biāo)區(qū)域停留時(shí)間百分比增加（P＜0.05）；CGRP-/-組中，實(shí)驗(yàn)亞組與對(duì)照亞組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與CGRP-/-組實(shí)驗(yàn)亞組比較，WT組實(shí)驗(yàn)亞組注射第4、5天的逃避潛伏期較低，目標(biāo)區(qū)域停留時(shí)間百分比較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較（±s）

表1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較（±s）

注：與第1天比較，①P＜0.05；與同組對(duì)照亞組比較，②P＜0.05；與CGRP-/-組實(shí)驗(yàn)亞組比較，③P＜0.05

組別 只數(shù) 逃避潛伏期/s 目標(biāo)區(qū)域停留時(shí)間百分比/% 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天WT組對(duì)照亞組 5 87.24±8.05 76.21±17.36 65.50±18.75① 56.05±19.15① 48.18±15.80① 21.60±2.14③實(shí)驗(yàn)亞組 5 82.21±17.16 59.69±15.00 49.21±31.17 21.06±13.12①②③ 17.06±7.09①②③ 31.40±2.46②③CGRP-/-組對(duì)照亞組 5 83.49±9.03 67.60±9.47 74.92±7.06 72.86±6.13 70.54±11.67 11.83±1.49實(shí)驗(yàn)亞組 5 78.28±20.12 73.00±12.06 77.03±11.13 68.58±4.90 73.54±3.10 12.60±2.28

2.2 海馬中CGRP、IGF-1、mRNA含量比較

CGRP-/-組中CGRP、IGF-1及IGF-1 mRNA含量低于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；WT組中，實(shí)驗(yàn)亞組的CGRP、IGF-1及IGF-1mRNA的含量高于對(duì)照亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CGRP-/-組中，2亞組的 CGRP、IGF-1及IGF-1mRNA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2，說明Ghrelin可通過促進(jìn)小鼠神經(jīng)元釋放CGRP從而提高海馬的IGF-1產(chǎn)量。

表2 各組小鼠海馬趾中CGRP、IGF-1、IGF-1mRNA的含量比較（±s）

表2 各組小鼠海馬趾中CGRP、IGF-1、IGF-1mRNA的含量比較（±s）

注：與同組對(duì)照亞組比較，①P＜0.05；與WT組對(duì)應(yīng)亞組比較，②P＜0.05

組別 只數(shù) CGRP（ng/mL） IGF-1(ng/m L) IGF-1mRNA WT組對(duì)照亞組 5 125.36±8.47 125.57±9.47 1.02±0.18實(shí)驗(yàn)亞組 5 197.55±15.23① 192.44±12.40① 1.86±0.23①CGRP-/-組對(duì)照亞組 5 6.40±2.10② 101.07±9.57 0.70±0.08②實(shí)驗(yàn)亞組 5 7.44±2.20② 100.46±14.03② 0.72±0.08②

3 討論

IGF-1是一種由70個(gè)氨基酸組成的堿性肽，廣泛分布于各組織與細(xì)胞中。IGF-1可調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素的促生長(zhǎng)作用，影響后天的生長(zhǎng)和發(fā)育[9]。IGF-1被證實(shí)可提高海馬CA1區(qū)中突觸傳遞的興奮性，并通過海馬中神經(jīng)形成的增加來提高空間認(rèn)知能力[10]。相反地，當(dāng)無外源性IGF-1注入小鼠時(shí)，血漿中的IGF-1含量偏低，小鼠的空間認(rèn)知能力相對(duì)變差[11]。有研究證實(shí)，給予IGF-1抗體后小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降[12]。這提示，在成熟個(gè)體中血漿IGF-1含量與認(rèn)知功能存在緊密的聯(lián)系[13]。本文也證實(shí)IGF-1可以拮抗認(rèn)知功能的下降。

Steen等[14]發(fā)現(xiàn)阿爾茲海默病（A lzheimer’s disease，AD）患者早期的IGF-1基因表達(dá)降低，IGF-1產(chǎn)生過少，最終導(dǎo)致AD。Okereke等[15]發(fā)表的一項(xiàng)長(zhǎng)期隨訪報(bào)道則顯示整體認(rèn)知功能和詞匯記憶均與血漿IGF-1水平呈正相關(guān)，表明受試者血漿IGF-1水平越高，認(rèn)知功能越好，對(duì)晚發(fā)型AD有預(yù)測(cè)作用。

本文觀察到對(duì)WT組小鼠腹膜內(nèi)注射Ghrelin可提高其海馬趾中CGRP、IGF-1及 IGF-1 mRNA的組織含量。CGRP-/-組小鼠海馬趾內(nèi)初始的CGRP、IGF-1及IGF-1mRNA含量明顯低于WT組小鼠，且注射Ghrelin后，其CGRP、IGF-1以及IGF-1mRNA含量并未提高，證明在WT組小鼠中，Ghrelin可通過促進(jìn)海馬趾內(nèi)CGRP的釋放從而提高IGF-1的水平。Aberg等[10]提出假說認(rèn)為，Ghrelin可明顯提高WT組小鼠的空間學(xué)習(xí)能力，而對(duì)CGRP-/-組小鼠無明顯影響。也有報(bào)道稱Ghrelin能直接作用于海馬從而提高空間學(xué)習(xí)能力，但William 等[16]證實(shí)Ghrelin無法直接通過血腦屏障，而是通過某種介質(zhì)發(fā)揮作用，筆者認(rèn)為CGRP在這過程中起關(guān)鍵作用。

綜上所述，本文證實(shí)Ghrelin可刺激神經(jīng)元，從而促進(jìn)海馬中CGRP的釋放，CGRP進(jìn)而增加IGF-1的含量，可能最終提高小鼠的認(rèn)知功能。

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（本文編輯：王晶）

Effect and Mechanism of Ghrelin on Cognitive Function in Mice

CHEN Ren,FANG Shu-chen,NING Yu,FAN Li,CHEN Jia-lu.Department of Spinal surgery,Renm in Hospital ofWuhan University Hubei General Hospital,Wuhan 430000,China

Objective:To explore the effect and mechanism of Ghrelin on the cognitive function in mice. Methods: Ten wild-type mice (WT group) and 10 CGRP-gene knockout mice （CGRP-/- group）were equally divided as the control subgroup (n=5) and the examination subgroup (n=5). Mice were treated by intraperitoneal injection of 100 μL of 0.1 μg/L Ghrelin solution dissolved in PBS (examination subgroup) or with PBS alone (control subgroup). The Morris maze task and probe test were examined in both groups, and then the tissue levels of CGRP, IGF-1 and IGF-1 mRNA in the hippocampus were determined. Results: In the WT group, the escape latency of the examination subgroup was shortened, the time spent in the target area of the examination subgroup was significantly enhanced, the tissue levels of CGRP, IGF-1 and IGF-1 mRNA were significantly up-regulated (P＜0.05) compared to those in the control subgroup. There was no statistically significance between the two subgroups in CGRP-/- group (P＞0.05). Compared with the examination subgroup of CGRP-/- group, the escape latency of the examination subgroup of WT group was shorter on days 4 and 5, and the time spent in the target area was longer, and the tissue levels of CGRP, IGF-1 and IGF-1 mRNA were significantly higher (P＜0.05). Conclusion: Ghrelin may increase the hippocampal expression of IGF-1 via increase of CGRP release from the hippocampus, thus cognitive function was improved.

Ghrelin;insulin-likegrowth factor-1;cognitive function

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2015.06.001

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院脊柱外科 武漢430000 2.蘇州市吳江區(qū)中醫(yī)醫(yī)院骨科 蘇州215200 3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院 武漢430065

2015-04-13

陳任 darkdance-cr@qq.com