水澇脅迫下歐李丙二醛和氧自由基的變化

張海平+程小愛(ài)

摘 ? ?要：對(duì)水澇脅迫下歐李丙二醛和氧自由基含量變化進(jìn)行初步研究，以期獲得歐李植物在成都地區(qū)的生長(zhǎng)情況，為探討歐李植物的抗逆性提供理論基礎(chǔ)。以雙組份分光度法測(cè)定丙二醛的含量，提取液與TBA在沸水浴中反應(yīng)后，分別測(cè)定450，532和600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值;利用O-2.與羥胺反應(yīng)生成NO2-，NO2-在對(duì)氨基苯磺酸和a-萘胺作用下，生成粉紅色的偶氮染料，檢測(cè)植物葉片中O-2.含量。結(jié)果顯示，水澇脅迫下歐李生長(zhǎng)期中，丙二醛含量呈上升趨勢(shì);水澇脅迫下歐李氧自由基含量也增加。研究認(rèn)為隨水澇脅迫程度的增加，歐李內(nèi)氧自由基含量增加，氧化脂膜，導(dǎo)致丙二醛含量增加。

關(guān)鍵詞：歐李;丙二醛;膜脂過(guò)氧化;氧自由基;水澇

中圖分類號(hào)：S793.9 ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.12.004

Changes of Malondialdehyde and Oxygen Free Radicals in Prunus humilis Bunge Leaves under Waterlogging Stess

ZHANG Hai-ping1， CHENG Xiao-ai2

（1. Dingxiang County State Forest， Shanxi Province， Dingxiang， Shanxi 035400， China; 2. Taigu County Agricultural Commission， Shanxi Province， Taigu， Shanxi 030800， China）

Abstract： MDA and oxygen free radicals were determined to obtain the growing state of Prunus humilis Bunge under waterlogging stress and provide theoretical basis for stress tolerance of Prunus humilis Bunge in Chengdu. The content of MDA was detected by two-component spectrophotometry method. The absorbance at 450， 532 and 600 nm were determined after the extract and TBA reacted in the boiling water bath; the content of O2-. was detected through pink azo dyestuffs which were obtained by the reaction of O2-. and hydroxylamine to gain NO2-， NO2- then reacted with sulfanilic acid and a-naphthalene amine. The results showed that the content of MDA and O2-. were all increased during the waterloggin. The contents of oxygen free radicals increased and caused bilayer lipid membrane oxidation; the contents of MDA also increased during the waterlogging because MDA was the product of bilayer lipid membrane oxidation.

Key words： Prunus humilis Bunge; malondialdehyde; membrane lipid peroxidation; oxygen free radicals; waterlogging

歐李[1]（又稱鈣果）Prunus humilis Bunge為薔薇科櫻桃屬矮生櫻桃亞屬的一種野生灌木果樹(shù)，主要分布在中西部的山西、河北、陜西、內(nèi)蒙等干旱地區(qū)。植株高0.3～1.5 m，抗寒，耐旱，適應(yīng)性強(qiáng)。經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，用途非常廣泛?？墒秤?，仁可入藥，莖可作飼料。果實(shí)呈紅色，呈扁圓形、棗圓形、尖樁形不等，酸甜適中，味道可口，富含維生素A、維生素B2、維生素B12、維生素C、維生素E，微量元素氮、鉀、鈣、鐵、錳、鎂、鋅、硒等，而且含有多種氨基酸，果實(shí)含糖量可達(dá)13%～19%。在環(huán)境設(shè)計(jì)、水土流失防治等方面作用較好，被列為生態(tài)林優(yōu)良樹(shù)種。

隨著植物葉片的衰老[2]，植物中各項(xiàng)生理指標(biāo)會(huì)有變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量減少[3]、光合作用降低、葉綠素降解以及激素平衡失調(diào)等。這些指標(biāo)可以反映植物衰老過(guò)程的變化。

自由基從產(chǎn)生到衰亡的過(guò)程就是電子轉(zhuǎn)移的過(guò)程[4]。在生命體系中，電子的轉(zhuǎn)移是一種基本的運(yùn)動(dòng)，生物體內(nèi)的氧最容易得到電子形成活性自由基。

代謝的氧大多數(shù)與氫結(jié)合生成水，4%～5%形成超氧陰離子，后者又可形成過(guò)氧化氫，它們都屬于自由基[5]。自由基有多種，如氧自由基，是指那些最外層電子軌道[6]原子、離子或分子。自由基具有高度的氧化活性，它們很不穩(wěn)定，活性很高，它攻擊細(xì)胞膜等膜類，與膜中的不飽和脂肪酸[7]反應(yīng)，造成脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物又可分解為更多的自由基，引起自由基的連鎖反應(yīng)。這樣，膜結(jié)構(gòu)的完整性就遭到了破壞。目前發(fā)現(xiàn)的氧自由基基本上對(duì)植物是起負(fù)作用的。

通過(guò)呼吸作用進(jìn)入生物體內(nèi)的氧分子，參與酶促或非酶促反應(yīng)[8]時(shí)，只接受一個(gè)電子后轉(zhuǎn)變?yōu)槌蹶庪x子自由基（O-2.），O-2.既能與體內(nèi)的蛋白質(zhì)和核苷酸等活性物質(zhì)直接作用，又能衍生為H2O2，羥自由基（.OH），單線態(tài)氧（1O2）等。.OH可以引發(fā)不飽和脂肪酸脂質(zhì)（RH）過(guò)氧化反應(yīng)。產(chǎn)生一系列自由基，例如：脂質(zhì)自由基（.R）、脂氧自由基（O-2.）、脂過(guò)氧自由基（ROO.）等?；鶊F(tuán)旁邊的小圓點(diǎn)為不成對(duì)價(jià)電子，這種基團(tuán)稱為自由基，帶有—O—O—的是過(guò)氧化物，1O2d的電子處于激發(fā)狀態(tài)。這些含有氧而比O2活潑得多的化合物，稱為活性氧，部分人將它們統(tǒng)統(tǒng)歸納為氧自由基類。一切需氧生物均能產(chǎn)生活性氧，在其體內(nèi)有一套完整的活性氧清除系統(tǒng)（抗氧化酶和抗氧化劑[9-10]），能將活性氧轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚暂^低的物質(zhì)，基體因此受到保護(hù)。利用羥胺氧化[11]的方法可以檢測(cè)出生物系統(tǒng)中O-2.含量。

自由基清除能力則隨年齡的增加而減少，有時(shí)甚至不能消除O-2.。O-2.反應(yīng)能力很強(qiáng)，可使細(xì)胞中的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，活性氧大量積累會(huì)引發(fā)或加劇細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用產(chǎn)生MDA[12]。MDA產(chǎn)生則進(jìn)一步加劇細(xì)胞膜的損傷，并造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損害。所以，丙二醛產(chǎn)生數(shù)量從一定程度上代表細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度，也可以間接反映植物組織的抗氧化能力的強(qiáng)弱。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)材料為2008年從山西引種到成都的歐李。3月份移栽至花盆中，正常管理。設(shè)計(jì)為8株長(zhǎng)勢(shì)相同的歐李，分為2組：處理組和對(duì)照組，處理組用水澇脅迫處理，對(duì)照組為正常條件下進(jìn)行連續(xù)168 h的觀測(cè)。

1.1.2 藥品與試劑 試驗(yàn)藥品：三氯乙酸、硫代巴比妥酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、石英砂;試劑：亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、a-萘胺、鹽酸羥胺及緩沖液，所用試劑都是分析純。

0.05 mol·L-1 pH 值7.8磷酸鈉緩沖液：先各配制0.05 mol·L-1的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，將兩者體積按照91.5∶8.5混合，得到目標(biāo)溶液。

5%三氯乙酸溶液：稱5 g三氯乙酸固體，先溶解再定容至100 mL。

0.5%硫代巴比妥酸溶液：稱取0.5 g硫代巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶解，定容至100 mL，得到目標(biāo)溶液。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 CT15RT型高速冷凍離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司;7200 型可見(jiàn)光分光光度儀，尤尼柯（上海）儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司;FA2004B型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司;冰箱， 海爾;電熱鼓風(fēng)干燥箱（DB-210SCB/3kW），成都天宇實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;研缽;剪刀; 5 mL刻度離心管;刻度試管（10 mL）;鑷子; 移液管（5，2，1 mL）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 丙二醛含量的測(cè)量 （1） 丙二醛的提取。分別取歐李當(dāng)年生枝條葉片，洗凈擦干，剪碎，分別稱取0.2 g左右于預(yù)冷過(guò)的研缽中，同時(shí)加入少量石英砂，2 mL預(yù)冷的0.05 mol·L-1 pH值7.8的磷酸緩沖液，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到5 mL刻度離心試管，用3 mL緩沖液分3次洗凈研缽，清洗液合并到離心管中，于8 000轉(zhuǎn)·min-1，4 ℃下離心15 min，取上清液即為丙二醛緩沖溶液。

（2）丙二醛含量的測(cè)定。收集上清液用磷酸緩沖液定容到7 mL，從中取1 mL，加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，搖勻。將試管放入沸水浴中煮沸10 min（自試管內(nèi)溶液中出現(xiàn)小氣泡開(kāi)始計(jì)時(shí)）。10 min后立即將試管取出并放入冷水浴中，冷卻后，再次在4 ℃、8 000 g離心15 min（試管中若沒(méi)有沉淀，可不離心）。離心后，以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白分別測(cè)定532，600 和450 nm處的吸光值。

（3）丙二醛的數(shù)據(jù)處理方法。本試驗(yàn)采取的是雙組分光光度法，丙二醛的濃度的計(jì)算方法為

MDA濃度（μmol·L-1）=6.45（D532-D600） -0.56D450

式中，D450、D532、D600分別代表450，532和600 nm波長(zhǎng)下的光密度值。

MDA含量（μmol·g-1，F(xiàn)W）=MDA濃度（μmol·L-1） ×提取液體積（mL）/植物組織鮮質(zhì)量（g）

1.2.2 氧自由基的測(cè)量 （1）亞硝酸根準(zhǔn)曲線的制作。最先配置出濃度50 μmol·L-1的NaNO2，再稀釋得到梯度濃度5，10，20，25，30，35，40，50 μmol·L-1。然后取1 mL NaNO2溶液，分別加入1 mL 17 mmol·L-1對(duì)氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol·L-1 a-萘胺，1 mL H2O，于250 ℃中保溫20 min，然后測(cè)定OD530，結(jié)果如表1。以[NO2-]和OD530值互為函數(shù)，按照試驗(yàn)條件用計(jì)算機(jī)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)，如圖1。

（2）植物提取液的制備。取歐李植物本年生葉，洗凈擦干剪碎，加入2 mL的50 mmol·L-1 pH 值7.8磷酸緩沖液[含0.1 mmol·L-1 EDTA;0.3%（W/V）Triton X-100;4%（W/V）聚乙烯局吡咯烷酮（pvpp，polyvinylpolyrrolidone）]進(jìn)行研磨，研磨后加1mL 50 mmol·L-1 pH值7.8磷酸緩沖液洗研缽2次，以10 500×g離心20 min，得上清液并用緩沖液定容到8 mL，即為粗酶液。

（3）測(cè)定氧自由基含量。從粗酶液取1 mL，加0.5 mL 50 mmol·L-1 pH值7.8磷酸緩沖液，1 mL 1 mmol·L-1鹽酸羥胺，搖勻，于250 ℃中保溫1 h，然后再加入1 mL 17 mmol·L-1對(duì)氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol·L-1 a-萘胺（冰醋酸∶水=3∶1），搖勻，于250 ℃中保存20 min，取出測(cè)定波長(zhǎng)OD530。

根據(jù)測(cè)得的OD530，查亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，將OD530換成亞硝酸根，然后依照羥胺與O-2.的反應(yīng)式：NH2OH+2 O-2.+H+→NO2-+H2O2+H2O將[NO2-]乘以2，得到[O-2.]含量。

（4）計(jì)算亞硝酸根含量和氧自由基含量。由圖1（亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線）可知，在選定工作范圍內(nèi)，亞硝酸根線性關(guān)系良好。亞硝酸根含量計(jì)算公式：

亞硝酸根含量=由標(biāo)準(zhǔn)曲線算得亞硝酸根濃度（μmol）×8（mL）提取液總量/ ?（樣品質(zhì)量（g）×1.0測(cè)定時(shí)提取液總量 （mL）） ?（1）

氧自由基含量=公式1算得的亞硝酸根含量×2 …4（2）

2 結(jié)果與分析

2.1 確定試驗(yàn)方法

2.1.1 丙二醛測(cè)定方法的優(yōu)化 方法一：取0.2 g左右樣品，洗凈擦干，剪成小段放入研缽，加2 mL預(yù)冷的0.05 mol·L-1磷酸緩沖液，加入石英砂，冰浴條件下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到試管，用3 mL緩沖液分3次洗凈研缽，清洗液并入試管中。

向試管中加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，搖勻。放入沸水浴中煮沸10 min（內(nèi)液出現(xiàn)氣泡開(kāi)始計(jì)時(shí)）。10 min后，立即將試管取出并放入冷水浴中，冷卻，4 ℃、8 000×g離心15 min。離心后，以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白測(cè)450， 532和600 nm處的吸光值。通過(guò)此方法得到如表2的數(shù)據(jù)。

一般吸光度在0.2～0.8之間，可以減少系統(tǒng)誤差。此方法測(cè)出的吸光度太大，不宜作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)。說(shuō)明濃度太高，需要稀釋提取液。

方法二：同上，只是先把研磨得到的提取液定容到20 mL，取5 mL與0.5%硫代巴比妥酸（TBA）來(lái)反應(yīng)。通過(guò)此方法得到如表3的數(shù)據(jù)。

可以看出此方法測(cè)出的吸光度偏大，不可作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)。說(shuō)明需要離心。

通過(guò)以上的2個(gè)試驗(yàn)分析，出現(xiàn)這種問(wèn)題的可能原因在于合并提取液的時(shí)候，應(yīng)該先離心，再反應(yīng)。

方法三：同方法一，只是定容的時(shí)候定到7 mL，從中取1 mL與0.5%硫代巴比妥酸（TBA）來(lái)反應(yīng)，通過(guò)此方法得到如表4的數(shù)據(jù)。

從表4中的吸光度可以確定此方法適宜測(cè)定歐李葉片中的丙二醛含量，具體如下。分別取植物當(dāng)年生枝條葉片0.2 g左右，洗凈擦干，于預(yù)冷的研缽剪成小段，加2 mL預(yù)冷的0.05 mol·L-1 pH 值7.8的磷酸緩沖液，同時(shí)加石英砂，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到5 mL刻度離心試管，將研缽用3 mL緩沖液分3次洗凈，清洗液并入離心管中，在8 000轉(zhuǎn)·min-1，4 ℃下離心15 min，上清液即為丙二醛提取液。將上清液用磷酸緩沖液定容到7 mL，取1 mL提取液，加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，搖勻，在沸水浴中煮沸10 min（試管內(nèi)出現(xiàn)小氣泡開(kāi)始計(jì)時(shí)）。10 min后立即將試管取出并放入冷水浴中冷卻，試管中若有沉淀，按上述條件離心15 min。以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白分別測(cè)定532 nm、600 nm和450 nm處的吸光值。

2.1.2 氧自由基測(cè)定影響因素的排除 （1）葉綠素影響。如果葉片中含有大量葉綠素將干擾測(cè)定，可在樣品測(cè)定時(shí)先去掉葉綠素，再進(jìn)行測(cè)定試驗(yàn)。去除葉綠素的過(guò)程可在研磨后進(jìn)行，也可以在樣品與羥胺溫浴后萃取。在此過(guò)程中，提取液總量為2 mL，其他測(cè)定條件不變，結(jié)果如表5。

通過(guò)分析可以知道，不做處理的試驗(yàn)組，結(jié)果較一致，而除去了葉綠素的試驗(yàn)組，得到的氧自由基含量相差很大，因?yàn)樵谟靡颐演腿∪~綠素的時(shí)候，體積影響很大，造成試驗(yàn)結(jié)果誤差大。不做處理的樣品得到的氧自由基相對(duì)穩(wěn)定，因此試驗(yàn)中不考慮葉綠影響。

（2）體積影響。由于要經(jīng)過(guò)研缽研磨，研磨后在研缽上都會(huì)留下一定的樣品，使得樣品提取液不為2 mL，這對(duì)試驗(yàn)測(cè)定可能造成較大誤差，因此對(duì)體積影響做了試驗(yàn)。一個(gè)是研磨時(shí)加2 mL 50 mmol·L-1 pH值 7.8磷酸緩沖液后直接離心，其余條件不變。另一個(gè)是在加入2 mL 50 mmol·L-1 pH值 7.8磷酸緩沖液后用1 mL 50 mmol·L-1 pH 值7.8磷酸緩沖液清洗2次，離心后定容到4 mL，結(jié)果如表6。

通過(guò)分析得到，從同一條件下取得的葉子，不考慮體積影響測(cè)定的氧自由基含量值較小，消除體積影響后測(cè)出來(lái)的氧自由基含量值較大。這表明體積對(duì)氧自由基含量測(cè)定有影響。所以確定此試驗(yàn)在操作方法中采用消除體積影響的條件。

通過(guò)試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)分析，決定在試驗(yàn)中不考慮葉綠素的影響，要考慮體積的影響。

2.2 短期水澇脅迫下丙二醛的含量變化

通過(guò)測(cè)歐李丙二醛生長(zhǎng)期變化（11左右點(diǎn)取樣，每次做3個(gè)平行），測(cè)得丙二醛數(shù)據(jù)。由圖2可知，經(jīng)過(guò)水澇處理的歐李丙二醛含量在短期內(nèi)都比正常生長(zhǎng)的歐李丙二醛含量高，說(shuō)明水澇脅迫確實(shí)可以促使歐李產(chǎn)生丙二醛。在水澇脅迫下，短期內(nèi)丙二醛含量總體呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明短期內(nèi)水澇脅迫程度與歐李丙二醛含量呈正相關(guān)關(guān)系。

2.3 短期水澇脅迫下氧自由基的含量變化

由表7、圖3可以看出，脅迫處理組每天的氧自由基含量都要比對(duì)照組的要高，說(shuō)明水澇脅迫可以促使歐李產(chǎn)生氧自由基。隨著時(shí)間增加，水澇脅迫程度加劇，氧自由基含量呈上升趨勢(shì)，但是上升過(guò)程有波動(dòng)，這是因?yàn)橹参矬w內(nèi)有自己的一套清除系統(tǒng)（抗氧化酶和抗氧化劑）[13]。當(dāng)植物受到脅迫，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生POD，POD的主要作用就是分解氧自由基[14]，而在脅迫下，氧自由基增加，相應(yīng)的POD也會(huì)增加，但是氧自由基的產(chǎn)生能力在短時(shí)間脅迫下比POD分解能力要強(qiáng)，故在短時(shí)間內(nèi)，歐李氧自由基含量呈波動(dòng)上升的趨勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

3.1 短期水澇脅迫下歐李丙二醛含量變化趨勢(shì)

短期內(nèi)，水澇脅迫下歐李丙二醛的含量比正常生長(zhǎng)的要高。這是因?yàn)橹参锸艿剿疂趁{迫會(huì)產(chǎn)生氧自由基，而氧自由基作用就是氧化細(xì)胞脂膜，其產(chǎn)物就含有丙二醛。同時(shí)從本試驗(yàn)還可以看出，在本試驗(yàn)條件下，丙二醛的含量呈上升趨勢(shì)。在短期內(nèi)，隨著水澇脅迫時(shí)間的增加，對(duì)植物的脅迫程度也增加，植物氧自由基量增加，導(dǎo)致脂膜氧化一直進(jìn)行，丙二醛含量呈上升趨勢(shì)。

3.2 短期水澇脅迫下歐李氧自由基含量變化趨勢(shì)

短期內(nèi)，水澇脅迫下歐李氧自由基的含量比正常生長(zhǎng)的要高，說(shuō)明水澇脅迫有利于歐李產(chǎn)生氧自由基。水澇脅迫程度加劇，氧自由基含量將呈上升趨勢(shì)，但是上升過(guò)程有波動(dòng)，這是因?yàn)橹参矬w內(nèi)有自己的一套清除系統(tǒng)（抗氧化酶和抗氧化劑）。當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生POD，POD的主要作用就是分解氧自由基，而在脅迫下，氧自由基增加，相應(yīng)的POD也會(huì)增加，但是氧自由基的產(chǎn)生能力在短時(shí)間脅迫下比POD分解能力要強(qiáng)，故在短時(shí)間內(nèi)，歐李氧自由基含量呈波動(dòng)上升的趨勢(shì)。

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