一種解聚金屬-Aβ聚集體的硫磺素T類熒光螯合劑

張勇 張哲 董雄偉 尹文星 章丹 劉長(zhǎng)林＊,

(1華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，武漢430079)

(2湖北理工學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，黃石435003)

一種解聚金屬-Aβ聚集體的硫磺素T類熒光螯合劑

張勇1,2張哲1董雄偉1尹文星1章丹1劉長(zhǎng)林＊,1

(1華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，武漢430079)

(2湖北理工學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，黃石435003)

以硫磺素T為母體，合成和表征了一種解聚金屬-Aβ聚集體的熒光螯合劑5-氨基-2-(苯并[d]噻唑-2-基)苯酚(FC-9)，研究了它與金屬-Aβ聚集體的相互作用以及由此導(dǎo)致的Aβ聚集體的構(gòu)象、形貌和毒性變化。結(jié)果表明，F(xiàn)C-9不僅能識(shí)別各種Aβ40/Aβ42聚集體，而且還能使金屬-Aβ40/42聚集體解聚。FC-9與金屬-Aβ聚集體相互作用后，聚集體的形貌由纖維狀轉(zhuǎn)化為無(wú)定形狀，其β-折疊構(gòu)象也減少了。FC-9還能夠跨過(guò)細(xì)胞膜，符合嚴(yán)格的Lipinski類藥標(biāo)準(zhǔn)，在一定程度上可抑制由Cu-Aβ40聚集體產(chǎn)生的毒性，這使得FC-9在螯合治療老年癡呆癥方面可能具有潛在的應(yīng)用前景。

Aβ聚集體；硫磺素T；熒光螯合劑；解聚

老年癡呆癥(Alzheimer′s disease，AD)是發(fā)生在老年人身上的一種神經(jīng)退行性疾病，目前還未找出AD的確切病因和研究出有特效治療或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展的藥物和預(yù)防方法，因此它被列入了21世紀(jì)的疑難雜癥。β-淀粉樣蛋白(amyloid β protein，Aβ)是AD發(fā)病機(jī)制的分子標(biāo)志物之一，它容易聚集形成不溶的高分子量的淀粉樣纖維。Aβ聚集被公認(rèn)為是AD的主要病理學(xué)特征之一，而且其聚集與Cu2+、Zn2+等金屬離子相關(guān)[1-3]。這些金屬離子與Aβ的結(jié)合能調(diào)節(jié)Aβ聚集的行為、毒性和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[4-5]。在實(shí)驗(yàn)中已觀察到金屬離子包括Cu2+和Zn2+誘導(dǎo)的Aβ聚集是可逆的，Aβ聚集體的產(chǎn)生和解聚能被金屬螯合劑所調(diào)控；對(duì)Aβ聚集體中的金屬離子有較高親和力的螯合劑，可奪取Aβ聚集體中的金屬離子而形成配合物，并使其解聚，可期達(dá)到減緩或者治療AD的目的[6-7]。因此，應(yīng)用螯合劑使AD病人大腦內(nèi)的金屬離子達(dá)到穩(wěn)態(tài)平衡而不擾亂體內(nèi)其它有益性質(zhì)的螯合治療方法是治療AD的合理選擇之一[8-9]。

目前，報(bào)道了很多諸如喹啉和大環(huán)多胺等能螯合金屬-Aβ聚集體中金屬離子的螯合劑[10-17]。除了一種類似氯碘羥喹(clioquinol，CQ)的8-羥基喹啉類螯合劑PBT2正處于AD的二期臨床研究之外，至今還沒有用于治療AD的螯合藥物上市，這主要是因?yàn)檫@類螯合劑有很多的限制性因素，如適中的螯合Cu2+和Zn2+的能力，對(duì)人體無(wú)毒副作用等等[18-20]。因此，此類螯合劑需要進(jìn)行合理化的設(shè)計(jì)，對(duì)于應(yīng)用于治療AD的多功能螯合劑的開發(fā)與研究也成了許多科學(xué)家感興趣的課題。硫磺素T(Thioflavin T，ThT)是臨床尸檢用的熒光染料，它能夠嵌合到Aβ的β片層折疊之中，是一種識(shí)別Aβ聚集體的熒光探針[21]。通過(guò)設(shè)計(jì)集螯合金屬離子和與Aβ聚集體特異結(jié)合于一體的這樣一類螯合劑，可以作為識(shí)別Aβ聚集體的熒光探針，能實(shí)時(shí)通過(guò)熒光變化等方法來(lái)監(jiān)測(cè)Aβ聚集體及其解聚的過(guò)程?；诖耍疚囊粤蚧撬豑為母體，將其與氯碘羥喹類似的螯合基團(tuán)組合在一起，設(shè)計(jì)合成了一種熒光螯合劑5-氨基-2-(苯并[d]噻唑-2-基)苯酚(FC-9)，并用紫外吸收光譜、熒光光譜和圓二色光譜等研究了它對(duì)金屬-Aβ40/42聚集體的解聚程度、構(gòu)象、形貌和毒性等(圖1)。

圖1 以ThT為母體的熒光螯合劑FC-9的設(shè)計(jì)Fig.1 Design of fluorescent chelator FC-9 based on thioflavin T

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為市售分析純。Aβ40/42購(gòu)自吉爾生化(上海)有限公司，胎牛血清和DMEM (Dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。所用儀器為Perkin-Elmer 2400元素分析儀，PHS-3C型pH計(jì)，XT4A型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(未校正)，Analytik jena Specord 210紫外光譜儀，Varian Mercury 400 MHz核磁共振儀，Applied Biosystems API 2000 LC/MS/MS電噴霧質(zhì)譜儀，Bruker Smart-2000 CCD單晶衍射儀，VARIANCARY熒光光譜儀，Leica DMI 3000B倒置熒光顯微鏡，SpectraMax Plus384型酶標(biāo)儀，ChirascanTM圓二色光譜儀，TECNAI G220透射電鏡。

1.2 5-氨基-2-(苯并[d]噻唑-2-基)苯酚(FC-9)的合成

以多聚磷酸為溶劑，將鄰氨基苯硫酚(1.25 g，10 mmol)和對(duì)氨基水楊酸(1.53 g，10 mmol)一起加入到100 mL圓底燒瓶中，在氬氣的保護(hù)下于220℃反應(yīng)4 h。當(dāng)反應(yīng)液冷卻至室溫后，再將其倒入10% K2CO3水溶液中，過(guò)濾，將殘?jiān)苡诙燃淄橹?，然后加入無(wú)水硫酸鎂干燥，再過(guò)濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，可得淺黃色的固體。將粗產(chǎn)品用二氯甲烷重結(jié)晶可得淺黃色晶狀粉末。產(chǎn)率85%。熔點(diǎn)：213～215℃。1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：5.95(s，2H)，6.16(d，J= 7.6 Hz，1H)，6.24(d，J=8.6 Hz，1H)，7.34～7.46(m，2H)，7.62～7.88(m，2H)，8.02(d，J=8.0 Hz，1H)，11.73(s，1H)。ESI-MS：m/z 242(M+)。元素分析：實(shí)驗(yàn)值(計(jì)算值，%)：C 64.02(64.44)，H 4.15(4.16)，N 11.98(11.56)。

1.3 晶體的測(cè)定

選取大小為0.3 mm×0.2 mm×0.10 mm的淺黃色方形晶體FC-9置于單晶衍射儀上，采用石墨單色化的Mo Kα射線(λ＝0.071 073 nm)，于298(2)K，以ω/2θ方式掃描，在2.55°〈θ〈28.25°范圍內(nèi)共收集到衍射點(diǎn)7 662個(gè)，其中獨(dú)立衍射點(diǎn)2 791(Rint= 0.068 8)，I〉2σ(I)的可觀測(cè)的衍射點(diǎn)2 642個(gè)，-7≤h≤7，-11≤k≤10，-30≤l≤22。全部衍射數(shù)據(jù)經(jīng)Lp因子和經(jīng)驗(yàn)吸收校正。晶體結(jié)構(gòu)由直接法解出，非氫原子坐標(biāo)是在以后的數(shù)輪差值Fourier合成中陸續(xù)確定的。對(duì)全部氫原子的坐標(biāo)及各向異性參數(shù)用SHELXS-97程序，以最小二乘法對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行精修[22-23]。表1給出標(biāo)題配合物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)，鍵長(zhǎng)和鍵角數(shù)據(jù)見表2，氫鍵數(shù)據(jù)見表3。

CCDC：960540。

1.4 FC-9與金屬-Aβ40/42聚集體的相互作用

在20 μmol·L-1Tris-HCl/150 μmol·L-1NaCl緩沖體系中(Tris=tris(hydroxymethyl)aminomethane，pH 7.4)，加入濃度為100 μmol·L-1的新鮮Aβ40/42，再加入(或不加入)濃度為100 μmol·L-1Cu2+(或Zn2+)溶液，置于37℃恒溫水浴鍋中共培養(yǎng)2 d，并間歇攪拌，使其形成Aβ40/42聚集體、Cu2+-Aβ40/42和Zn2+-Aβ40/42聚集體。然后在不同的金屬-Aβ40/42聚集體的樣品中加入FC-9于37℃恒溫水浴槽中分別共培養(yǎng)2 d，使得最終測(cè)試的Aβ40/42樣品的濃度為5 μmol·L-1(cAβ40/42∶cCu2+/Zn2+∶cFC-9=1∶1∶2)，所有的測(cè)試都平行測(cè)定3次，數(shù)據(jù)處理以平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示。

表1 FC-9的晶體學(xué)數(shù)據(jù)和精修參數(shù)Table1 Crystal data and structure refinements of FC-9

表2 FC-9的部分鍵長(zhǎng)和鍵角Table2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of FC-9

表3 FC-9的氫鍵鍵長(zhǎng)和鍵角Table3 Bond lengths(nm)and bond angles(°)for the hydrogen bond of FC-9

1.5 BCA(bicinchoninic acid)蛋白分析法

參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行BCA蛋白分析[11-13]。加入FC-9到金屬-Aβ40/42聚集體中于37℃共培養(yǎng)2 d后，每個(gè)樣品再加入20 μmol·L-1Tris-HCl/150 μmol·L-1NaCl緩沖溶液(pH 7.4)15 μL，用離心機(jī)以14 000 r·min-1的速度離心20 min后，取樣品的上清液25 μL，再加入BCA溶液200 μL，混合混勻后，放在37℃水浴鍋再溫育30 min。當(dāng)溶液的顏色由淺綠色變?yōu)樽仙?，再在紫?可見光譜儀上測(cè)562 nm處的吸光度，新鮮制備的Aβ40/42樣品作為對(duì)照，通過(guò)BSA標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，來(lái)計(jì)算可溶的Aβ40/ 42含量。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，數(shù)據(jù)處理以平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示。

1.6 圓二色實(shí)驗(yàn)

在10 μmol·L-1PBS的緩沖體系中(pH=7.4)，向50 μmol·L-1Aβ42溶液中加入(或不加入)50 μmol· L-1CuSO4(或Zn(OAc)2)，于37℃下共培養(yǎng)2 d，然后向其中加入FC-9(100 μmol·L-1)，于37℃共培養(yǎng)2 d并間歇攪拌，測(cè)試時(shí)以相同濃度新鮮的Aβ42作對(duì)照。使用圓二色光譜儀測(cè)試每個(gè)樣品在190～260 nm范圍內(nèi)的光譜，樣品池的寬度為1 mm，測(cè)試溫度為25℃，每次測(cè)試的樣品的基線校正都減去了緩沖液或金屬離子的吸收，并且取5次校正后的平均值。

1.7 濁度測(cè)試

各種聚集體制備同BCA蛋白分析法，并用20 μmol·L-1Tris-HCl/150 μmol·L-1NaCl緩沖溶液(pH 7.4)稀釋，最終測(cè)試時(shí)Aβ40/42樣品的濃度為10每個(gè)樣品用紫外-可見光譜儀測(cè)其在405 nm處的吸收。測(cè)試時(shí)配制相同濃度的新鮮Aβ40/42做對(duì)照，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，數(shù)據(jù)處理以平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示。

1.8 透射電鏡實(shí)驗(yàn)

1.9 細(xì)胞跨膜實(shí)驗(yàn)

HeLa細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入10%胚胎牛血清，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天細(xì)胞換液，每隔兩天傳代一次。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸濁液濃度，以合適的密度接種細(xì)胞分別至24孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到有大約80%融合時(shí)，再換入無(wú)血清培養(yǎng)基(每孔400 μL)培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行分組培養(yǎng)。在進(jìn)行細(xì)胞成像的前一天，事先將HeLa細(xì)胞植入24孔板，第二天將FC-9加入到細(xì)胞體系中(細(xì)胞單層鋪滿孔底50%)，使得最終測(cè)試濃度為10 μmol·L-1，并在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)3 h。測(cè)試時(shí)，吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，HeLa細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，然后將其放在倒置熒光顯微鏡下，用綠光激發(fā)來(lái)觀察細(xì)胞的熒光成像，放大倍數(shù)為400倍。相對(duì)于細(xì)胞內(nèi)FC-9的熒光強(qiáng)度，對(duì)細(xì)胞的明亮視野也進(jìn)行了成像。

1.10 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

向新鮮的Aβ40中加入(或不加入)Cu2+，并于37℃培養(yǎng)2 d，然后加入FC-9反應(yīng)2 d(Aβ40的濃度為100 μmol·L-1，cAβ40∶cCu2+∶cFC-9=1∶1∶2)。細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)采用MTT法進(jìn)行測(cè)定。將HeLa細(xì)胞種植于96孔板中，保證細(xì)胞密度約為1×105cells·mL-1。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，使得加入到HeLa細(xì)胞中各種Aβ40樣品的濃度為5 μmol·L-1，單獨(dú)的Aβ40、Cu2+和FC-9也分別作為對(duì)照組。然后每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min。最后通過(guò)酶標(biāo)儀在OD 490 nm處測(cè)量各孔的吸光值，評(píng)價(jià)探針的細(xì)胞毒性。

圖2 熒光螯合劑FC-9的合成路線Fig.2 Synthetic route of fluorescent chelator FC-9

圖3 熒光螯合劑FC-9的晶體結(jié)構(gòu)Fig.3 Crystal structure of fluorescent chelator FC-9

圖4 FC-9的晶胞堆積圖Fig.4 Packing of FC-9 in unit cell

2結(jié)果與討論

2.1 FC-9的晶體結(jié)構(gòu)

雙功能熒光螯合劑FC-9通過(guò)對(duì)氨基水楊酸與鄰氨基苯硫酚經(jīng)環(huán)合反應(yīng)制備得到(圖2)，將其在乙醇中溶解，室溫下靜置5 d后可得到適合X-射線單晶測(cè)試的淺黃色晶體。在FC-9的晶體結(jié)構(gòu)中(圖3)，苯并噻唑環(huán)和與之相連的苯環(huán)構(gòu)成了它的熒光部分，但二者并不完全共平面，它們之間的二面角為6.86°，這和FC-9結(jié)構(gòu)類似的螯合劑2-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-碘苯酚(HBXI)一樣，且它的二面角比FC-9要小1.76°[10]。FC-9的苯并噻唑環(huán)的兩個(gè)C-N鍵長(zhǎng)并不相等[C(6)-N(1)0.137 9(2)nm；C(7)-N(1) 0.131 0(2)nm]，而與苯環(huán)相連的氨基氮的C-N鍵長(zhǎng)[C(11)-N(2)0.136 5(3)nm]處于它們之間，它比與酚羥基相連的C-O鍵長(zhǎng)[C(9)-O(1)0.1351(2)nm]稍長(zhǎng)(表2)。此外，和HBXI相比，F(xiàn)C-9除了含有分子內(nèi)的O-H…N氫鍵之外，還存在苯環(huán)上氨基與羥基形成的分子間N-H…O氫鍵，這兩種氫鍵使得整個(gè)螯合劑分子形成了二維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖4和表3)。

2.2 熒光性質(zhì)

在20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖體系中(pH=7.4)，F(xiàn)C-9(10 μmol·L-1)在室溫和自然透光的條件下，5 d內(nèi)其熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化(圖5A)。這表明FC-9的熒光是很穩(wěn)定的，基本不受時(shí)間和光照的影響，這方面它要優(yōu)于ThT(ThT對(duì)光敏感)[24]。在室溫和pH值在3.0～8.0的范圍內(nèi)，F(xiàn)C-9的熒光強(qiáng)度也幾乎保持不變，這使得在近生理的條件下它能夠適應(yīng)生命體中某種生理刺激所引起的pH值的變化(圖5A插圖)。不同的溶劑對(duì)FC-9的熒光強(qiáng)度影響很大(圖 5B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)C-9在DMSO中熒光強(qiáng)度最大，在DMF、CH3OH、CH3COOCH2CH3中都有不同程度的熒光猝滅，而在CH2Cl2中基本完全猝滅。為盡可能減少有機(jī)溶劑對(duì)生物體系的影響并保證FC-9的溶解，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將FC-9配制成含10%DMSO的水溶液。FC-9在10%DMSO的水溶液中的最大吸收波長(zhǎng)為350 nm,最大激發(fā)波長(zhǎng)(λex)和最大發(fā)射波長(zhǎng)(λem)分別為350 nm和414 nm。FC-9對(duì)各種常見的金屬離子幾乎都沒有什么熒光響應(yīng)。如圖6所示，等物質(zhì)的量的FC-9(10 μmol·L-1)與各種常見的金屬離子(K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+)作用后，其熒光強(qiáng)度基本沒有太大的變化。

對(duì)于玉米產(chǎn)量來(lái)講，一個(gè)重要的影響因素就是病害，其主要涉及到生物脅迫和非生物脅迫。利用遺傳改良的手段來(lái)有效地改善玉米的抗逆性是一種較為經(jīng)濟(jì)有效的方法，特別是在如今，增強(qiáng)玉米抗逆性已經(jīng)成為了玉米育種領(lǐng)域之中一個(gè)相當(dāng)重要的課題。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)主要玉米產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的天氣災(zāi)害，給玉米生產(chǎn)帶來(lái)了較為嚴(yán)重的影響?？鼓嫘杂N非常重要，但目前還嚴(yán)重的不足，如抗旱品種、抗蟲害品種的選育等都還未取得明顯成果，直接影響到了玉米生產(chǎn)[1]。

圖5 時(shí)間、pH值(A)和不同溶劑(B)對(duì)FC-9(10 μmol·L-1)的熒光光譜的影響Fig.5 Effect of time,pH values(A)and different solvents(B)on the fluorescence of FC-9(10 μmol·L-1)

圖6 在20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液中(pH=7.4, VH2O/VDMSO=9),FC-9(10 μmol·L-1)對(duì)不同的金屬離子(10 μmol·L-1)的熒光響應(yīng)Fig.6 Fluorescent response of FC-9(10 μmol·L-1)to different metal ions(10 μmol·L-1)in 20 mmol·L-1Tris-HCl buffer(pH=7.4，VH2O/VDMSO=9)

2.3 FC-9與金屬-Aβ聚集體的相互作用

Aβ是AD患者腦中老年斑的核心蛋白，其中Aβ40和Aβ42是主要的組分。我們發(fā)現(xiàn)FC-9與 Aβ40或Aβ42聚集體相互作用隨時(shí)間的變化是不同的。FC-9與Aβ40聚集體相互作用在0.5 h時(shí)后熒光增強(qiáng)最多(圖7A)，而其與Aβ42聚集體在10 min時(shí)熒光增強(qiáng)最多(圖7B)，這主要是由于FC-9具有與ThT類似的苯并噻唑環(huán)狀平面結(jié)構(gòu)，因此它能識(shí)別Aβ40/Aβ42聚集體，這也印證了我們對(duì)FC-9分子的設(shè)計(jì)思想。因?yàn)锳β42比Aβ40更容易聚集，所以FC-9與兩種不同的Aβ聚集體作用后熒光增強(qiáng)到最大值的時(shí)間是不同的。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度都會(huì)下降到低于其配體的熒光，這可能是FC-9對(duì)Aβ40/Aβ42聚集體有抑制作用所導(dǎo)致的。在加入Cu2+或Zn2+到Aβ40/ Aβ42中反應(yīng)2 d后，再將FC-9加入上述體系中反應(yīng)2 d，我們發(fā)現(xiàn)金屬-Aβ40/42聚集體的反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度比Aβ40/42聚集體的反應(yīng)體系明顯降低(圖8)。作為一種螯合劑，F(xiàn)C-9此時(shí)發(fā)揮了螯合的功能。在較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間中，F(xiàn)C-9能螯合金屬-Aβ40/ 42中的Cu2+或Zn2+，使得金屬-Aβ40/42聚集體解聚，識(shí)別金屬-Aβ40/42聚集體的FC-9的減少導(dǎo)致了反應(yīng)體系的熒光減小。我們嘗試用電位滴定法測(cè)試FC-9與Cu2+、Zn2+的結(jié)合常數(shù)，由于FC-9的溶解性不好，采用了含有10%DMSO的水溶液體系。但是，向FC-9中加入Cu2+或Zn2+進(jìn)行滴定，即使是微摩爾數(shù)量級(jí)，反應(yīng)過(guò)程中就逐漸產(chǎn)生了沉淀物，從而導(dǎo)致測(cè)不出FC-9與Cu2+、Zn2+的結(jié)合常數(shù)。參照文獻(xiàn)，和FC-9結(jié)構(gòu)類似的螯合劑2-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-碘苯酚(HBXI)與Cu2+、Zn2+的穩(wěn)定常數(shù)β分別為1020.29、1019.68，因此相對(duì)于金屬-Aβ40/42而言(lgKCu-Aβ40/42=5～10，lgKZn-Aβ40/42=3～9)，F(xiàn)C-9容易螯合金屬-Aβ40/42中的金屬離子[10,25-27]。

圖7 FC-9與Aβ40(A)或Aβ42(B)聚集體相互作用隨時(shí)間的變化Fig.7 Interaction of FC-9 and Aβ40(A)or Aβ42(B)aggregates as a function of time

圖8 FC-9與金屬-Aβ40(A)和金屬-Aβ42(B)聚集體反應(yīng)2 d后的熒光變化Fig.8 Fluorescence change of FC-9 and Aβ40(A)(or Aβ42(B))aggregates reacted for 2 days

為了證實(shí)FC-9使金屬-Aβ40/42聚集體解聚，我們又通過(guò)可溶性蛋白含量測(cè)定和濁度實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。BCA蛋白分析法表明，Cu2+-Aβ40/42和Zn2+-Aβ40/42聚集體中可溶性的Aβ40/42含量比Aβ40/42聚集體少，說(shuō)明Cu2+、Zn2+促進(jìn)了Aβ40/42的聚集(圖9)。加入FC-9到金屬-Aβ40/42聚集體中后，Cu2+-Aβ40/42聚集體和Zn2+-Aβ40/42聚集體中可溶性的Aβ40/42含量都增加了，但可溶的Aβ40/ 42增加的程度都有限，說(shuō)明FC-9的加入可能使得金屬-Aβ40/42聚集體解聚了。濁度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，相對(duì)于新鮮的Aβ40/42，反應(yīng)2 d后的Aβ40/42溶液的吸光度值變大，說(shuō)明2 d后Aβ40/ 42形成了聚集體。加入Cu2+或Zn2+到新鮮的Aβ40/ 42中反應(yīng)2 d后，溶液的吸光度值又明顯增強(qiáng)，表明加入金屬離子又使Aβ40/42的聚集程度增大。加入FC-9到金屬-Aβ40/42中后，溶液的吸光度值有所下降，但沒有下降到低于培養(yǎng)2 d的Aβ40/42聚集體，也說(shuō)明FC-9能夠螯合金屬-Aβ40/42中的Cu2+或Zn2+，使得金屬-Aβ40/42聚集體解聚。

圖9 FC-9與金屬-Aβ40(A)和金屬-Aβ42(B)聚集體反應(yīng)2 d后,用BCA蛋白分析法測(cè)定可溶性Aβ含量Fig.9 BCA protein analysis of soluble Aβ after FC-9 and metal-Aβ40(A)(or metal-Aβ42(B))aggregates reacted for 2 days

圖10 FC-9與金屬-Aβ40(A)和金屬-Aβ42(B)聚集體反應(yīng)2 d后的濁度實(shí)驗(yàn)Fig.1 0Turbidity test after FC-9 and metal-Aβ40(A)(or metal-Aβ42(B))aggregates reacted for 2 days

2.4 聚集體形態(tài)和構(gòu)象

透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)能用來(lái)直接觀測(cè)Aβ聚集體納米級(jí)尺寸的聚集形態(tài)，可為分析它的各種形貌諸如無(wú)定形和纖維狀等提供最為直觀的證據(jù)。如圖11所示，新鮮制備的Aβ40在Cu2+和Zn2+存在或不存在的情況下于37℃反應(yīng)2 d后，均能觀測(cè)到有規(guī)則的線狀纖維形貌(圖11A，B，C)。與Cu2+誘導(dǎo)的Aβ40聚集體相比，Zn2+誘導(dǎo)的Aβ40聚集體還發(fā)現(xiàn)有成團(tuán)結(jié)塊的形貌，這主要是因?yàn)镃u2+和Zn2+雖然都能誘導(dǎo)并加快Aβ40的聚集，但Zn2+誘導(dǎo)Aβ40的聚集的能力要比Cu2+大得多[28]。在加入FC-9到金屬-Aβ40聚集體中反應(yīng)2 d后，這些金屬-Aβ40聚集體變小了，而且是一種無(wú)定形的狀態(tài)(圖11D，E)，這應(yīng)該是FC-9與金屬-Aβ40聚集體作用后，前者奪取了后者的金屬離子，并使得后者解聚為Aβ40寡聚體或者單體，而且這可以從FC-9與金屬-Aβ40聚集體作用的熒光測(cè)試和BCA蛋白含量分析等多種檢測(cè)方法得到證實(shí)。

不同Αβ42樣品的透射電鏡結(jié)果與Aβ40樣品類似。單獨(dú)的Αβ42樣品在37℃條件下反應(yīng)兩d后形成了纖維狀的聚集體，隨著Cu2+、Zn2+的加入，可觀測(cè)到形成的金屬-Αβ42網(wǎng)狀纖維聚集體都比單獨(dú)的Αβ42聚集程度大，說(shuō)明Cu2+、Zn2+促進(jìn)了Αβ42的聚集(圖11F，G，H)。和Aβ40樣品對(duì)比，Aβ42聚集體和金屬-Aβ42聚集體的聚集程度更大，這又表明了Aβ42比Aβ40更易聚集。在加入FC-9到金屬-Aβ42聚集體中反應(yīng)2 d后，在Cu2+-Aβ42聚集體中觀察到聚集體結(jié)構(gòu)疏松了很多，而在Zn2+-Aβ42聚集體中觀察到了小的無(wú)定形顆粒狀聚集體(圖11I，J)，這也表明了FC-9的加入使得金屬-Aβ42聚集體解聚。

圖11 不同Aβ40/42樣品于37℃反應(yīng)2 d后的透射電鏡圖片F(xiàn)ig.1 1TEM images of different Aβ40/42 samples after reacted for 2 days at 37℃

圖12 FC-9加入或不加入金屬-Aβ42聚集體的圓二色譜Fig.1 2CD spectra of metal-Aβ42 aggregates systems in the presence and absence of FC-9

圓二色(circular dichroism，CD)是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的一種快速、簡(jiǎn)單、較準(zhǔn)確的方法。我們研究了將FC-9加入或不加入金屬-Aβ42聚集體體系的圓二色光譜(圖12)。測(cè)試的結(jié)果表明，在Zn2+和Cu2+的存在下，Aβ42在225 nm左右出現(xiàn)了其纖維特征的負(fù)吸收波段(β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu))[29]。加入FC-9到金屬-Aβ42聚集體中后，表示β-折疊的特征的負(fù)吸收波段均上移，表明FC-9的加入使得具有β-折疊結(jié)構(gòu)的Cu2+-Aβ聚集體和Zn2+-Aβ聚集體中的β-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白減少，這不但說(shuō)明它們的構(gòu)象都發(fā)生了改變，還暗示FC-9的加入可能使得金屬-Aβ聚集體解聚了，其結(jié)果也與上述濁度和BCA蛋白質(zhì)含量分析的測(cè)試結(jié)果一致。

2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究

將FC-9(10 μmol·L-1)加入到HeLa細(xì)胞中并共培養(yǎng)一段時(shí)間后，在紫外光下激發(fā)下(360～370 nm)，用倒置熒光顯微鏡可觀察到細(xì)胞發(fā)淺黃綠色的熒光(圖13)，這表明FC-9能夠跨過(guò)細(xì)胞膜。事實(shí)上，和曾經(jīng)進(jìn)行了二期臨床實(shí)驗(yàn)的螯合劑氯碘羥喹(CQ)一樣，F(xiàn)C-9在理論上也完全符合嚴(yán)格的Lipinski類藥標(biāo)準(zhǔn)和跨越血腦屏障的計(jì)算方法(表4)[30-31]。

圖13 向HeLa細(xì)胞中加入FC-9的倒置熒光顯微鏡圖片F(xiàn)ig.1 3FM images of HeLa cells exposed to FC-9(excited with UV light)

表4 FC-9和氯碘羥喹的Lipinski參數(shù)和lgBB數(shù)值Table4 Lipinski′s parameters and lgBB Values of FC-9 and CQ

圖14 在FC-9存在或不存在的情況下,Aβ40和Cu2+-Aβ40聚集體在HeLa細(xì)胞體系中于37℃孵育24 h后的毒性Fig.1 4Cytotoxicity of Aβ40 and Cu2+-Aβ40 aggregates with and without FC-9 toward HeLa cells after incubation for 24 h at 37℃

用MTT方法測(cè)試了FC-9與金屬-Aβ40聚集體在HeLa細(xì)胞體系中的毒性。結(jié)果如圖14所示，在相同的條件下，單獨(dú)的Aβ40、Cu2+和FC-9對(duì)HeLa細(xì)胞只顯示很小的毒性，細(xì)胞活力依然大于90% (相對(duì)值為100%)。含有Cu2+的Aβ40毒性稍微高于Aβ40，細(xì)胞存活率下降。在有FC-9存在的情況下，Cu2+-Aβ40聚集體的毒性下降，細(xì)胞活力略有上升，這表明FC-9能在一定程度上抑制由Cu-Aβ40聚集體產(chǎn)生的毒性。

3結(jié)論

本文以硫磺素T為母體，將其與氯碘羥喹類似的螯合基團(tuán)組合在一起，設(shè)計(jì)合成了一種識(shí)別和抑制Aβ聚集體的熒光螯合劑FC-9。在pH 3.0～8.0的范圍內(nèi)，它的熒光強(qiáng)度基本穩(wěn)定，基本不受時(shí)間和光照的影響，而且與各種常見的金屬離子作用其熒光強(qiáng)度也基本沒有變化。FC-9能識(shí)別和解聚金屬-Aβ40/42聚集體，它符合嚴(yán)格的Lipinski類藥標(biāo)準(zhǔn)，能夠跨過(guò)細(xì)胞膜，在一定程度上可抑制由Cu-Aβ40聚集體產(chǎn)生的毒性，這使得FC-9在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Aβ40聚集體和用于螯合治療AD方面可能有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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A Thioflavin T-Based Fluorescent Chelator Disaggregated Metal-Aβ Aggregates

ZHANG Yong1,2ZHANG Zhe1DONG Xiong-Wei1YIN Wen-Xing1ZHANG Dan1LIU Chang-Lin＊,1
(1College of Chemistry,Central China Normal University,Wuhan 430079,China)
(2College of Chemistry and Chemical Engineering,Hubei Polytechnic University,Huangshi,Hubei 435003,China)

A thioflavin T-based fluorescent chelator 5-amino-2-(benzo[d]thiazol-2-yl)phenol(FC-9)was synthesized and characterized.Its interaction with metal-Aβ aggregates and the change of morphology,conformation, cytotoxicity of the resulting Aβ aggregates were investigated.The results showed that FC-9 can not only recognize different Aβ40/Aβ42 aggregates but also disaggregate metal-Aβ40/Aβ42 aggregates.After the interaction between FC-9 and metal-Aβ40/Aβ42 aggregates,the morphology of aggregates changed from fibril to amorphousness,and their β-sheet conformation was also reduced.Moreover,the cell membrane penetration of FC-9 fulfilled common drug-like criteria,and it can inhibit cytotoxicity of the Cu-Aβ40 aggregates,indicating that it could have potential prospect in the treatment of Alzheimer disease.CCDC:960540.

Aβ aggregates;thioflavin T;fluorescent chelators;disaggregation

O626.25

A

1001-4861(2015)08-1495-10

10.11862/CJIC.2015.233

2014-10-31。收修改稿日期：2015-05-05。

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.21302059，21271079，21072074)和湖北省教育廳青年人才(No.Q20134402)資助項(xiàng)目。＊