異鼠李素誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞自噬

劉 佳， 郭文潔， 耿 驥， 談德斐， 湯新慧， 高 靜*

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.鹽城師范學(xué)院江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鹽城224051）

異鼠李素誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞自噬

劉 佳1，2， 郭文潔1， 耿 驥1， 談德斐1， 湯新慧2*， 高 靜1*

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.鹽城師范學(xué)院江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鹽城224051）

目的 研究中華補(bǔ)血草［Limonium sinense（Girard）Kuntz］中主要抗癌活性成分之一異鼠李素誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌（HCT116）細(xì)胞自噬的機(jī)理。方法 采用四唑鹽比色法 （MTT）檢測異鼠李素對HCT116細(xì)胞的抑制作用，單丹尸磺酰胺（MDC）染色法檢測自噬小泡的形成，蛋白印跡法（Western blot）檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)情況。結(jié)果

中華補(bǔ)血草；異鼠李素；HCT116細(xì)胞；細(xì)胞自噬

中華補(bǔ)血草［Limonium sinense（Girard）Kuntz］是藍(lán)雪科補(bǔ)血草屬植物，為多年泌鹽草本植物，具有耐鹽、耐瘠、耐旱、耐濕等特點(diǎn)，廣泛分布于我國東北、華北等地區(qū)，尤以江蘇、浙江、福建省沿海灘涂分布甚廣［1］。該植物適應(yīng)性強(qiáng)，人工栽培產(chǎn)量高［2］。中華補(bǔ)血草是一種傳統(tǒng)的中草藥，具有清熱解毒、止血散瘀、祛風(fēng)消炎、抗癌等作用［3］，它的活性成分主要包括異鼠李素、甘

露醇、β-谷甾醇、齊墩果酸、槲皮素、沒食子酸乙酯、山柰酚等［4-5］。

異鼠李素（isorhamnetin），也稱3，5，7-三羥基-2-（4-羥基-3-甲氧基苯基）苯并吡喃-4-酮，是一種黃酮類化合物，存在于多種植物中，是中華補(bǔ)血草中主要單體之一［6］。已有研究表明，異鼠李素具有清除氧自由基、擴(kuò)張血管降血壓、降低血膽固醇、防止冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等作用［7］。另外，異鼠李素還具有顯著的抗腫瘤作用，可抑制如胃癌、肺癌、肝癌等細(xì)胞的生長［8-9］。目前，有關(guān)異鼠李素抗腫瘤作用的機(jī)理研究主要集中在其抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡方面［10-12］，而細(xì)胞的死亡方式不僅有凋亡，作為細(xì)胞發(fā)生死亡的另一種機(jī)制—自噬，在抗腫瘤的研究中日漸引起廣泛注意［13］。因此，本實(shí)驗(yàn)從抑制腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬方面對異鼠李素抑制HCT116細(xì)胞的作用進(jìn)行了研究。

1 材料與儀器

DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；MTT、胰酶 （美國Amresco公司）；MDC（美國Sigma公司）；LC3抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；中華補(bǔ)血草，采自江蘇省鹽城灘涂，由鹽城師范學(xué)院于延球副教授鑒定。

HealForce CO2孵箱；TS100 Nikon倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Spectra Max 190酶標(biāo)儀（美國Molecular Device公司）；Nikon eclipse Ti-E熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；Mini-PROTEIN電泳系統(tǒng)（美國Biorad公司）。

2 方法

2.1 異鼠李素提取與分離方法 中華補(bǔ)血草根3.6 kg，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，濾過，合并濾液，減壓濃縮回收溶劑，得粗浸膏，加水依次用等體積石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取濃縮物3次，回收溶劑得各部分萃取物，分別合并萃取物，得到5個(gè)萃取部位，分別為：石油醚部位（LSPF）62.7 g，氯仿部位（LSCF）40.6 g，乙酸乙酯部位（LSEF）58.2 g，正丁醇部位（LSBF）81.3 g和水部位（LSWF）93.4 g。取氯仿部位和乙酸乙酯部位，利用凝膠柱色譜、制備薄層色譜、ODS柱色譜、Sephadex LH-20進(jìn)一步純化，從氯仿部位得到化合物1（30.7 mg）、2（16.8 mg）、3（24.1 mg）、4（56.8 mg）、5（46.2 mg）；從乙酸乙酯部位得到化合物6（103.4 mg）、7（22.6 mg）、8（206.0 mg）、9（31.9 mg）、10（93.4 mg）、11（9.7 mg）、12（32.7 mg）、13（45.3 mg）、14（21.7 mg）。經(jīng)過抗腫瘤活性篩選，取活性較好的化合物1、4、5、6、8、10，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定分別為異鼠李素 （純度≥95%）、齊墩果酸、烏蘇酸、槲皮素、沒食子酸、木犀草素。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人腫瘤細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 MTT法檢測細(xì)胞活性 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以4×104個(gè)/m L的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL。以不同劑量的化合物處理細(xì)胞48 h后，去上清，每孔加入100μLMTT（1 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入100μL二甲基亞砜，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光度值（D）值，每組5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算抑制率，公式：抑制率（%）=（1-給藥組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。

2.4 MDC染色檢測自噬小泡的形成 取對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以4×104個(gè)/m L的密度接種于24孔板中，每孔500μL，以一定劑量的化合物處理細(xì)胞后，加入50μmol/L MDC染液300 μL避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察自噬小泡的產(chǎn)生。

2.5 Western blot檢測LC3蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，離心，PBS洗兩次，加入一定量的細(xì)胞裂解液，置冰上裂解30 min，12 000×g離心5 min，吸上清。用BCA（bicinchonininc acid）蛋白定量法進(jìn)行定量，其余樣品按比例加入6×SDS凝膠上樣緩沖液溶解，煮沸5 min。取20μg蛋白樣品進(jìn)行15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；在300 mA恒流的條件下、將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜 （PVDF）上；將膜置于封閉液中封閉2 h；一抗孵育4℃過夜；之后用磷酸鹽吐溫緩沖液 （PBST）清洗；二抗室溫孵育2 h；再用PBST清洗；ECL發(fā)光液檢測目的條帶。

3 結(jié)果

3.1 異鼠李素抑制HCT116細(xì)胞的增殖 將不同劑量的異鼠李素作用于3種腫瘤細(xì)胞株 （HCT116、Hela、HepG2），48 h后檢測細(xì)胞活性，計(jì)算IC50。從表1可以看出，異鼠李素對不同腫瘤細(xì)胞作用效果不同，對HCT116細(xì)胞的效果最為明顯，如圖1所示，隨著劑量的增加，異鼠李素對HCT116細(xì)胞的抑制率也有所增加。用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長情況 （圖2），與空白組相比，異鼠李素處

理組隨著劑量的增加，細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞數(shù)目減少。

表1 異鼠李素作用48 h抑制不同腫瘤細(xì)胞增殖的IC50值Tab.1 IC50of isohamnetin on different tumor cell lines for 48 h

圖1 異鼠李素劑量依賴性抑制HCT116細(xì)胞增殖 （ˉx± s，n=5）Fig.1 Dose-dependent effect of isorhamnetin on cell proliferation of HCT116 cells（ˉ，n=5）

圖2 異鼠李素誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)觀察（×200）Fig.2 M orphological changes of HCT116 cellswere induced by isorphamnetin（×200）

3.2 異鼠李素誘導(dǎo)自噬小泡的形成 MDC染色結(jié)果表明，10、30、100μmol/L異鼠李素作用于HCT116細(xì)胞24 h，隨著劑量的增大細(xì)胞內(nèi)點(diǎn)狀熒光增多，熒光強(qiáng)度增加，即自噬小泡顯著增多，如圖3所示。

3.3 異鼠李素誘導(dǎo)LC3蛋白表達(dá)增加 為了進(jìn)一

圖3 異鼠李素誘導(dǎo)自噬小泡形成 （M DC染色，×200）Fig.3 Formation of autophagosomes was induced by isorhamnetin（×200）

步驗(yàn)證異鼠李素誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生自噬，我們還對其自噬標(biāo)志性的蛋白LC3的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。如圖4所示，以不同劑量 （0、10、30、100 μmol/L）的異鼠李素處理細(xì)胞24 h，能增加細(xì)胞內(nèi)LC3總蛋白的量以及活性形式LC3-Ⅱ的表達(dá)，且在30μmol/L時(shí)最為顯著。以上結(jié)果均說明，異鼠李素可劑量依賴性誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生自噬。

圖4 異鼠李素劑量依賴性誘導(dǎo)LC3表達(dá)增加Fig.4 Dose-dependent effect of isorhamnetin on the expression of protein LC3

3.4 3-MA降低異鼠李素對HCT116的抑制作用

為了檢測本實(shí)驗(yàn)中異鼠李素誘導(dǎo)的自噬在細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮的作用，我們使用3-MA（自噬阻斷劑）預(yù)處理細(xì)胞，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)自噬被阻斷后，異鼠李素對細(xì)胞的抑制率明顯降低，表明本實(shí)驗(yàn)中異鼠李素誘導(dǎo)的自噬是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的一種方式。

4 討論

圖5 3-甲基腺嘌呤降低異鼠李素對HCT116細(xì)胞的抑制率（n=5）Fig.5 3-MA induces the inhibition rate of isorhamnetin in HCT116 cells（n=5）

本研究采用MTT法、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察等方法考察了異鼠李素對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116體外生長的影響。結(jié)果表明，異鼠李素可以劑量依賴性抑制HCT116的生長。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出異鼠李素處理過的細(xì)胞，出現(xiàn)自噬的特征性變化，隨著異鼠李素劑量的增加，自噬小泡增多，自噬標(biāo)志性蛋白LC3的總量及其活化形式LC3-II表達(dá)增多。自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后能夠明顯降低異鼠李素對細(xì)胞的抑制作用。因此，我們推測異鼠李素的抗腫瘤活性除了通過抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡外，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬在此過程中也起著重要作用。異鼠李素誘導(dǎo)自噬的發(fā)生的信號通路則需進(jìn)一步的研究。綜上所述，中華補(bǔ)血草活性成分異鼠李素對腫瘤有一定的調(diào)節(jié)作用，將來可被開發(fā)用于腫瘤治療。

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Isorhamnetin induces autophagy in HCT116 cells

LIU Jia1，2， GUOWen-jie1， GEN Ji1， TAN De-fei1， TANG Xin-hui2*， GAO Jing1*

（1.School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212O13，China；2.Jiangsu Provincial Key Laboratory of CoastalWetland Bioresourcesand Environmental Protection，Yancheng Normal University，Yancheng 224O51，China）

AIM To investigate the mechanism for the isorhamnetin-induced autophagy of human colon carcinoma cell line HTC116，which was one of the anticancer constituents from Limonium sinense（Girard）Kuntze. METHODS （MTT）assay was performed on the inhibitory effectof isorhamnetin againstHCT116 cells；the formation of autophagic vacuoles and the expression of autophagy-related protein LC3 were assessed bymonodansylcadervarine（MDC）staining and Western blot，respectively.RESULTS Isorhamnetin obviously exhibited the inhibition on HCT116 cells proliferation in a dose-dependentmanner.After being treated with isorhamnetin for 24 hours，both the fluorescence intensity ofMDC and the expression of protein LC3 were significantly enhanced.Furthermore，the inhibitory effect of isorhamnetin against HCT116 cells was weakened as these cells were pretreated with 3-methyladenine（3-MA）.CONCLUSION Isorhamnetin can induce the autophagic cell death in HCT116.

Limonium sinense（Girard）Kuntze；isorhamnetin；human colon carcinoma cell line（HCT116 cells）；autophagy

R285.5

A

1001-1528（2015）12-2596-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.005

2014-10-23

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （81102817）

劉 佳（1990—），女，碩士生，主要從事生藥藥理研究。Tel：18361811921，E-mail：average97@126.com

*通信作者：湯新慧（1966—），女，教授，博士，主要從事藥理學(xué)研究。E-mail：xinhuitang@sina.com高 靜（1966—），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事藥理學(xué)研究。E-mail：jinggao@ujs.edu.cn

異鼠李素明顯抑制HCT116細(xì)胞的增殖，且呈劑量依賴性效應(yīng)。異鼠李素處理24 h后，自噬小泡形成增多，LC3蛋白表達(dá)增強(qiáng)。3-甲基腺嘌呤 （3-MA）預(yù)處理能夠明顯降低異鼠李素對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中華補(bǔ)血草中的異鼠李素可以誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生自噬，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。