過(guò)敏毒素C3a在腎小球足細(xì)胞中的分泌性表達(dá)試驗(yàn)

鄭敬民，尹 廣，趙文緊

作為先天性免疫的一個(gè)重要組成部分，補(bǔ)體系統(tǒng)在機(jī)體免疫防御中起著極為重要的作用［1-3］。但補(bǔ)體系統(tǒng)的不適當(dāng)激活也會(huì)導(dǎo)致組織的損傷，成為引發(fā)人類(lèi)疾病發(fā)生和發(fā)展的重要因素［4-7］。在腎臟，補(bǔ)體活化與包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種病變相關(guān)［8-11］，但有關(guān)補(bǔ)體系統(tǒng)參與糖尿病腎病等腎組織損傷的機(jī)制仍未明了。長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)功能了解更多的是基于膜攻擊復(fù)合物對(duì)病菌和病變細(xì)胞裂解的效應(yīng)，在各種途徑的補(bǔ)體活化過(guò)程中，還產(chǎn)生了一系列被稱(chēng)作過(guò)敏毒素的補(bǔ)體成分小片段(包括 C3a、C4a和 C5a，分別由 C3、C4 和 C5裂解產(chǎn)生)，它們也可能參與糖尿病腎病等腎組織損傷過(guò)程。有研究顯示［12-13］，包括腎小管上皮細(xì)胞、腎小球足細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞在內(nèi)的腎組織上皮細(xì)胞均有表達(dá)過(guò)敏毒素C3a的受體C3aR，且在糖尿病腎病等特定病理?xiàng)l件下腎組織上皮細(xì)胞中C3aR的表達(dá)水平亦明顯增加，提示過(guò)敏毒素C3a可通過(guò)其受體參與糖尿病腎病等腎臟疾病的腎組織損傷過(guò)程，然而各種過(guò)敏毒素在腎組織損傷中的確切病理作用和意義仍不是很清楚。為了探討過(guò)敏毒素C3a在腎小球足細(xì)胞中的可能作用和病理意義，本文設(shè)計(jì)和建立了過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)慢病毒體系，并將其導(dǎo)入人腎小球足細(xì)胞系中，建立了分泌性高表達(dá)過(guò)敏毒素C3a的人腎小球足細(xì)胞株，為深入探討C3a對(duì)腎小球足細(xì)胞的作用及機(jī)制提供了很好的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑來(lái)源 人足細(xì)胞系(human podocytes，HPC)從美國(guó) ATCC購(gòu)得;胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒試劑、胎牛血清和1640培養(yǎng)基從Gibco公司購(gòu)得;殺稻瘟菌素、凝聚胺(Polybrene)和TRIZOL為 invitrogen公司產(chǎn)品;“PrimeScript RT Master Mix”逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和“SYBR Premix Ex Taq II”熒光定量PCR試劑盒為T(mén)arkara產(chǎn)品;293 T細(xì)胞、慢病毒空載體和包裝質(zhì)粒均由Invitrogen公司提供;人C3a ELISA試劑盒購(gòu)自BD公司。

1.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分泌性高表達(dá)過(guò)敏毒素C3a細(xì)胞株的構(gòu)建方法

1.2.1 HPC的培養(yǎng) HPC采用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中含1%ITS和10%胎牛血清，HPC細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為33℃(于含CO25%的孵箱中)。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選 將HPC細(xì)胞以2×105/mL接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔接種0.5 mL);33℃培養(yǎng)24 h后，按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)等于10的比例吸取適量過(guò)敏毒素C3a表達(dá)重組慢病毒，以培養(yǎng)液稀釋病毒液(最后稀釋致 100 μL/孔的量)，同時(shí)加入 8 μg/mL(終濃度)的Polybrene，吹打混勻后將其加入至吸去培養(yǎng)液的24孔板細(xì)胞上;繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);48 h后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞是否發(fā)出綠色熒光(成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可發(fā)出綠色熒光，據(jù)此判斷細(xì)胞轉(zhuǎn)染是否成功);消化細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)移到6孔板中，加入殺稻瘟菌素(終濃度為10 g/mL)進(jìn)行藥物篩選，每3 d換一次培養(yǎng)液，2周后，即得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒的足細(xì)胞。

1.2.3 建立單克隆細(xì)胞株 通過(guò)連續(xù)梯度稀釋培養(yǎng)構(gòu)建單克隆細(xì)胞株。即先利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)欲建立單細(xì)胞克隆的細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，再利用培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)♂屩撩亢辽囵B(yǎng)液約含5個(gè)細(xì)胞時(shí)，將稀釋液以每孔50 μL、100 μL的量接種到96孔板中。置33℃孵箱培養(yǎng)14 d后，相差顯微鏡下觀察找出單克隆細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得單克隆細(xì)胞株。

1.3 C3a分泌水平分析 以2×105個(gè)細(xì)胞/孔分別將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)敏毒素C3a的單克隆細(xì)胞株和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照足細(xì)胞株接種于24孔板(每種細(xì)胞各3孔)，待細(xì)胞貼壁(約6 h)后，將培養(yǎng)液換成無(wú)血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清，10 000×g離心5 min后，取上清利用人C3a ELISA試劑盒分析培養(yǎng)上清中C3a水平。

1.4 C3a mRNA表達(dá)水平的分析 采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法進(jìn)行，具體如下:利用TRIZOL試劑提取細(xì)胞RNA;利用“PrimeScript RT Master Mix”試劑盒合成cDNA;采用“SYBR Premix Ex Taq II”試劑盒于ABI公司的7900型實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。檢測(cè)過(guò)程以18S RNA作為內(nèi)參。PCR過(guò)程為:95℃下預(yù)變性1 min，然后進(jìn)行DNA變溫?cái)U(kuò)增過(guò)程(95℃ 15 s，60℃ 30s，如此40個(gè)循環(huán))。所用引物由金唯智公司合成，其序列為:人18S RNA sense:5’-ttt ctc gat tcc gtg ggt gg-3’;人18S RNA antisense:5’-agc atg cca gag tct cgt tc-3’;人 C3a sense:5’-aag tcg gca agt acc cca ag-3’;人 C3a antisense:5’-agt tgc agc agt cca gga ag-3’。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。定量數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)敏毒素C3a分泌型慢病毒表達(dá)體系的構(gòu)建結(jié)果 通過(guò)先構(gòu)建過(guò)敏毒素C3a分泌型表達(dá)慢病毒載體、再在293 T細(xì)胞中包裝成重組慢病毒，最后得到滴度約為5×108/mL的過(guò)敏毒素C3a分泌型表達(dá)重組慢病毒溶液。圖1所示的是本文設(shè)計(jì)的過(guò)敏毒素C3a分泌型表達(dá)慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖［重組C3a基因由5’端的IL-6基因的信號(hào)肽序列和下游C3a編碼序列組成，整個(gè)基因的表達(dá)由CMV啟動(dòng)子控制;此外，載體上有一綠色熒光蛋白基因(EGFP)和殺稻瘟菌素分解酶基因(Blasticidin)］;圖2所示的是其部分測(cè)序結(jié)果，顯示所構(gòu)建載體的序列完全正確。

2.2 過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞細(xì)胞株的構(gòu)建結(jié)果 以過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)重組慢病毒轉(zhuǎn)染HPC細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)幾乎所有細(xì)胞均可發(fā)出很強(qiáng)的綠色熒光，說(shuō)明病毒轉(zhuǎn)染效率很高，轉(zhuǎn)染很成功。經(jīng)過(guò)14 d的培養(yǎng)液中加殺稻瘟菌素篩選，獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)重組慢病毒的細(xì)胞群，其中的每個(gè)細(xì)胞均可發(fā)出明亮的綠色熒光(圖3，其中d是c同一視野下的相差顯微鏡照片)。再通過(guò)連續(xù)梯度稀釋法篩選，構(gòu)建成了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)敏毒素C3a的重組細(xì)胞克隆(圖3中e，可見(jiàn)所有細(xì)胞發(fā)出了均勻的綠色熒光)，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)敏素素C3a重組慢病毒的細(xì)胞株HPC-C3a。

圖1 過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)慢病毒載體的部分測(cè)序結(jié)果(示過(guò)敏毒素C3a基因3’端插入點(diǎn)周?chē)臏y(cè)序結(jié)果)

圖3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)敏毒素C3a的細(xì)胞株(HPC-C3a細(xì)胞株)的構(gòu)建結(jié)果

2.3 HPC-C3a細(xì)胞株中C3a表達(dá)和分泌水平分析結(jié)果 PCR分析顯示:與作為對(duì)照的正常(非轉(zhuǎn)染)HPC細(xì)胞相比，HPC-C3a細(xì)胞株中C3a mRNA表達(dá)水平顯著升高［正常對(duì)照C3a mRNA相對(duì)水平為(1.0 ±0.6)，HPC-C3a細(xì)胞株 C3a mRNA 相對(duì)水平為(771.0±172.0)］。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中過(guò)敏毒素C3a水平的檢測(cè)顯示:與作為對(duì)照的未轉(zhuǎn)染HPC細(xì)胞相比，HPC-C3a細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的C3a水平增加了 600 多倍［(201.0 ±21.0)ng/mL vs(0.3 ±0.1)ng/mL］。

3 討論

近年來(lái)，有關(guān)補(bǔ)體系統(tǒng)的不當(dāng)激活在人類(lèi)疾病中的作用引起了越來(lái)越多研究者的關(guān)注，成為了人類(lèi)疾病機(jī)制研究的一個(gè)新熱點(diǎn)［1-4］。雖然人們?cè)缇驼J(rèn)識(shí)到包括糖尿病腎病、膜性腎病和狼瘡性腎炎在內(nèi)的多種腎臟疾病患者腎組織中均存在補(bǔ)體過(guò)度活化現(xiàn)象，但對(duì)于補(bǔ)體系統(tǒng)在腎組織損傷中的確切作用和參與腎組織損傷的確切分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)卻仍然很有限。

理論上，補(bǔ)體的過(guò)度活化可以多種方法參與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。其中膜攻擊復(fù)合物長(zhǎng)期以來(lái)一直為人們所關(guān)注。但在補(bǔ)體的鏈?zhǔn)郊せ钸^(guò)程中，同時(shí)產(chǎn)生了包括過(guò)敏毒素C3a在內(nèi)的一系列小片段分子，它們被釋放到周?chē)h(huán)境中，參與了對(duì)機(jī)體細(xì)胞功能的各種調(diào)節(jié)。作為一種重要的炎癥因子，過(guò)敏毒素C3a可通過(guò)與其受體C3aR的相互作用趨化和激活白細(xì)胞［14-17］。近年的研究顯示［11］，除了廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞外，過(guò)敏毒素C3a的受體C3aR還表達(dá)于包括腦、肝、肺、腎臟在內(nèi)的多種器官中的組織細(xì)胞中，且在不同的生理和病理情景中顯示出了多種重要功能。在腎臟，C3aR主要表達(dá)于上皮細(xì)胞(包括腎小管上皮細(xì)胞、腎小球足細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞)［12-13］，但目前對(duì)于腎組織細(xì)胞中C3aR的生理功能和各種病理情景下的病理意義仍不清楚?？紤]到多種腎病患者腎組織中存在的補(bǔ)體過(guò)度活化現(xiàn)象(即有大量的過(guò)敏素素C3a會(huì)被釋放出來(lái)并可能激活其腎組織細(xì)胞中的受體C3aR)、C3a信號(hào)傳導(dǎo)在一些組織細(xì)胞中所表現(xiàn)出來(lái)的包括影響細(xì)胞發(fā)育分化、細(xì)胞增殖或凋亡等在內(nèi)的重要功能［18-22］以及腎小球足細(xì)胞損傷在糖尿病腎病等腎臟疾病中的重要性，我們推測(cè):在糖尿病腎病等病理情況下，腎組織補(bǔ)體過(guò)度活化產(chǎn)生的過(guò)敏素素C3a很可能通過(guò)激活其位于足細(xì)胞上的受體參與足細(xì)胞損傷過(guò)程，從而在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。為了探討過(guò)敏毒素C3a在腎小球足細(xì)胞損傷中的可能病理作用和分子機(jī)制，本文進(jìn)行了分泌性過(guò)表達(dá)過(guò)敏毒素C3a人腎小球足細(xì)胞株的構(gòu)建。我們首先設(shè)計(jì)合成了過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)單元，并成功地將其克隆到了慢病毒表達(dá)載體上，經(jīng)全序列測(cè)序驗(yàn)證，得到序列完全正確的過(guò)敏毒素C3a分泌性慢病毒表達(dá)載體。在此基礎(chǔ)上，筆者利用293 T細(xì)胞進(jìn)行了重組慢病毒的包裝，并得到了高滴度的過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)重組慢病毒。利用過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)重組慢病毒轉(zhuǎn)染HPC細(xì)胞48 h后，筆者在熒光顯微鏡下觀察到了大量的能發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這些發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)染細(xì)胞可分為兩類(lèi):基因組中插入重組慢病毒DNA的細(xì)胞和基因組中未插入重組慢病毒DNA的細(xì)胞(重組DNA在細(xì)胞基因組外游離存在)。其中，只有基因組中插入重組慢病毒DNA的細(xì)胞可長(zhǎng)期穩(wěn)定地傳遞和表達(dá)轉(zhuǎn)基因(包括過(guò)敏毒素C3a基因、綠色熒光蛋白基因和殺稻瘟菌素分解酶基因)，故稱(chēng)為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。而重組DNA游離在細(xì)胞基因組外的轉(zhuǎn)染細(xì)胞卻不能將轉(zhuǎn)基因(包括過(guò)敏毒素C3a基因、綠色熒光蛋白和殺稻瘟菌素分解酶基因)穩(wěn)定地傳遞到下一代細(xì)胞，其轉(zhuǎn)基因的表達(dá)具有瞬時(shí)性，故稱(chēng)為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。根據(jù)這一原理，本文利用在培養(yǎng)液中長(zhǎng)期加殺稻瘟菌素的辦法來(lái)除去瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞群。在此基礎(chǔ)上，本文又利用連續(xù)梯度稀釋克隆法進(jìn)行了細(xì)胞的克隆化篩選培養(yǎng)，最終得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)重組慢病毒的足細(xì)胞株HPCC3a。利用PCR和ELISA方法，本文對(duì)HPC-C3a細(xì)胞株過(guò)敏毒素C3a的表達(dá)和分泌情況進(jìn)行了分析，結(jié)果證實(shí)了過(guò)敏毒素C3a在HPC-C3a細(xì)胞株中的分泌性高水平表達(dá)，說(shuō)明成功構(gòu)建了分泌性過(guò)表達(dá)過(guò)敏毒素C3a的人腎小球足細(xì)胞株。上述工作不僅為進(jìn)一步研究各種病理情況下過(guò)敏毒素C3a在人腎小球足細(xì)胞損傷中的作用和意義，探討補(bǔ)體活化產(chǎn)生的過(guò)敏毒素C3a致腎小球足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制提供了很好的細(xì)胞模型，所建立的過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)慢病毒體系也為進(jìn)一步開(kāi)展C3a對(duì)其他細(xì)胞的作用和病理意義創(chuàng)造了條件。

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