蓮子心黃酮提取測(cè)定及其抗氧化和抑菌活性進(jìn)展

吳梅青

(湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湘潭 411102)

蓮子心為睡蓮科水生草本植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn)成熟種子中的胚根及幼葉［1］，既可入藥，也可食用。蓮子心含有黃酮類化合物、生物堿等活性成分，具有降血壓、抗心律失常、抑制血小板聚集、抗氧化及清除活性自由基、抗心肌缺血、松弛平滑肌、強(qiáng)心、抗癌、腦缺血損傷保護(hù)、改善急性肺損傷及肺纖維化、中樞抑制、降血糖等藥理作用［2］。蓮子心中黃酮類化合物有蕓香苷、金絲桃苷、木犀草素等，是蓮子心中重要的活性成分。大量研究表明，黃酮類化合物除具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、清熱解毒等作用外，對(duì)冠心病、心絞痛等疾病也有較好的治療效果。黃酮類化合物安全、無(wú)毒，已在醫(yī)藥、食品加工等方面得到廣泛應(yīng)用［3］。筆者就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)蓮子心中黃酮類化合物的提取測(cè)定及抗氧化和抑菌活性等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 蓮子心總黃酮的提取分離方法比較

1.1 提取分離方法

1.1.1 水浸提法 水浸提得到的是黃酮苷類物質(zhì)。肖貴平［4］以建蓮蓮心為原料，以水為提取溶劑，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定水浸提蓮心黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件為浸提溫度90℃、浸提時(shí)間45min、料液比3∶100，在此條件下蓮心黃酮類物質(zhì)提取率為0.99%。由于蓮子心黃酮類物質(zhì)具有酚羥基，顯酸性而易溶于堿水，故可用堿水提取，堿水提取液加酸酸化，黃酮類物質(zhì)游離以沉淀的形式析出。蔡定建等［5］用石灰水從蓮子心中提取黃酮類物質(zhì)，再用鹽酸(HCl)調(diào) pH到適宜值，黃酮類物質(zhì)的提取率為0.41%。該法雖然提取率低，但經(jīng)濟(jì)、安全、方便，所得產(chǎn)品質(zhì)量好，是實(shí)際生產(chǎn)中常用的方法。

1.1.2 醇提法 由于乙醇無(wú)毒，還能增加蓮子心的滲透性，提高黃酮類物質(zhì)的溶解度，所以乙醇是最常用的提取溶劑。周芳［6］以總黃酮提取量及浸膏得率為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比對(duì)提取效果的影響，確定了最佳提取工藝為20倍量70%乙醇提取2次，第一次1.5 h，第二次1 h。在此工藝條件下總黃酮物質(zhì)的提取率為2.17%。醇提法的提取效率高于水提法，但提取成本也較高。

1.1.3 超聲輔助提取法 超聲波輔助提取法是利用超聲波的空化作用，破壞蓮子心細(xì)胞，使溶劑易于滲入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)超聲波的許多次級(jí)作用也能加速細(xì)胞內(nèi)有效成分的擴(kuò)散、釋放和溶解，促進(jìn)提取的快速進(jìn)行，增加了黃酮類物質(zhì)在溶劑中的溶解。周燕芳［7］采用超聲波輔助提取的方法，通過(guò)正交試驗(yàn)提取蓮子心黃酮，以40%乙醇作提取劑，按料液比1∶50(m∶V)，在60℃下采用超聲波提取60min，蓮子心總黃酮提取率1.80%，提取效果優(yōu)于熱回流提取法。肖貴平［8］用超聲輔助醇提法，對(duì)影響蓮心黃酮類物質(zhì)提取率的主要因素進(jìn)行單一比較分析，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，測(cè)得黃酮類物質(zhì)提取率為2.56%，與傳統(tǒng)微波水提取方法相比，該方法提取率較高，提取時(shí)間較短。

1.1.4 微波輔助提取法 微波可直接作用于分子，使其熱運(yùn)動(dòng)加劇，溫度升高，這種熱效應(yīng)使微波穿透到介質(zhì)內(nèi)部，加速細(xì)胞壁的破壞，使蓮子心黃酮類物質(zhì)更快地被分離提取出來(lái)。余其鳳等［9］采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定微波輔助提取蓮子心總黃酮的優(yōu)化工藝條件為乙醇濃度65%、固液比1∶25(g·mL－1)、微波輻射功率400 W、微波輻射時(shí)間30 s×3(間歇作用3次)，在此工藝條件下，蓮子心總黃酮提取率1.00%。肖貴平［10］采用微波輔助提取方法，對(duì)影響蓮心黃酮類物質(zhì)提取率的主要因素進(jìn)行單一比較分析，利用正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化提取工藝，確定微波功率700 W，提取10min，料液比2∶100工藝條件下黃酮類物質(zhì)提取率為1.87%，與傳統(tǒng)水浸提法比較發(fā)現(xiàn)，微波法提取效率明顯優(yōu)于水浸提法，且能為后續(xù)工序節(jié)約時(shí)間、能源和成本。

1.1.5 酶輔助提取法 該法是利用適當(dāng)?shù)拿?，通過(guò)酶反應(yīng)較溫和地將植物組織分解，最大限度地從植物體內(nèi)提取有效成分的新技術(shù)。該法提取效率高，還可將提取液中的雜質(zhì)如果膠、蛋白質(zhì)、淀粉等分解除去，從而簡(jiǎn)化后續(xù)純化工序。其中纖維素酶和果膠酶最常用于黃酮類物質(zhì)的提取。肖貴平［11］為有效提高蓮心中黃酮類物質(zhì)的提取效果，采用果膠酶輔助提取方法，通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選其最佳工藝條件為酶解溫度50℃、pH4.5、酶用量0.6 mg·mL－1、酶解時(shí)間 2.0 h，在此條件下蓮心黃酮類物質(zhì)提取率1.27%，與傳統(tǒng)水提取工藝(90℃、45min)相比，蓮心黃酮類物質(zhì)提取率提高了28.64%。林志欽等［12］在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析法，確定了纖維素酶提取工藝的最佳參數(shù)為50%乙醇、液料比 19∶1、纖維素酶添加量 0.3%、pH5.5、在60℃下酶解2 h，測(cè)得總黃酮得率4.50%。

1.1.6 超臨界流體萃取法 超臨界流體萃取技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)，集萃取分離于一體。它通過(guò)使植物細(xì)胞壁高度破碎，增加黃酮類物質(zhì)與溶劑的接觸面積和萃取通道，同時(shí)還使黃酮與纖維素結(jié)合力降低，從而提高萃取率［13］。季愛民等［14］采用乙醇為夾帶劑，萃取溫度45℃，萃取壓力6.5 MPa，用超臨界CO2流體萃取法從蓮子心中萃取親脂性成分，萃取物得率2.50%。

1.1.7 大孔吸附樹脂分離法 大孔吸附樹脂主要用于水溶性化合物的分離純化，是目前應(yīng)用最多也較為實(shí)用的分離純化方法。影響因素主要有樹脂的型號(hào)和性質(zhì)、被吸附物的性質(zhì)、上樣液的pH、上樣量、洗脫劑的性質(zhì)等。曾紹校等［15］采用X-5型大孔吸附樹脂對(duì)蓮子心總黃酮進(jìn)行純化，確定的最佳工藝條件為上樣液含量為5 mg·mL－1，上樣液pH6，上樣量2 BV，洗脫劑為50%乙醇4 BV，洗脫劑流速2 BV·h－1，純化后蓮子心總黃酮純度可達(dá)50%。

1.2 7種提取分離方法的比較 上述7種提取方分離法的優(yōu)缺點(diǎn)比較見表1。楊明等［16］比較了乙醇法、微波法、超聲波法等3種提取方法提取蓮子心中黃酮的效果。結(jié)果表明，乙醇法得到的黃酮含量低，超聲波法和微波法所得的結(jié)果比較接近，但從所用時(shí)間看，建議選用微波法。

2 蓮子心黃酮的檢測(cè)方法

2.1 主要檢測(cè)方法

2.1.1 紫外-可見分光光度法 紫外-可見分光光度法測(cè)定黃酮的基本原理是以蘆丁為對(duì)照品，硝酸鋁-亞硝酸鈉為顯色劑，全波段掃描最大吸收峰，測(cè)定其吸光度，以此來(lái)計(jì)算含量。該方法是目前測(cè)定天然藥物中黃酮含量的主要方法。張麗珍等［17］以蘆丁為對(duì)照品，以聚酰胺柱色譜分離，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉為顯色劑，510 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，用分光光度法測(cè)定6批蓮子心藥材中的總黃酮含量，含量0.66% ～1.52%。此方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速、靈敏度高，但特異性差，只適用于總黃酮的測(cè)定。

2.1.2 高效液相色譜(HPLC)法 目前，分析和鑒定黃酮類物質(zhì)最常用的方法是HPLC法，一般采用反相柱，反相體系則一般優(yōu)先選擇甲醇/水及乙腈/水體系為流動(dòng)相，還需要加入酸調(diào)節(jié)pH，抑制解離，克服拖尾現(xiàn)象，為了提高分離度需要梯度洗脫，多用C18柱分離［18］。曾建偉等［19］以 Ultimate C18(250mm ×4.6mm，5 μm)為色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液(40∶60)，流速為 1.0mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng) 256 nm，柱溫30℃，用HPLC法測(cè)定蓮子心中蘆丁含量，蘆丁進(jìn)樣量在 0.122 ～ 1.094 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，RSD為1.72%，測(cè)得4個(gè)不同產(chǎn)地蓮子心蘆丁的平均含量為0.14%，未檢測(cè)到金絲桃苷和木犀草素。

2.1.3 毛細(xì)管電泳-安培檢測(cè)法 蓮子心黃酮類物質(zhì)含有較多的酚羥基，在堿性條件下帶負(fù)電荷，而且酚羥基容易氧化，可以得到較好的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)，適合于毛細(xì)管電泳-安培檢測(cè)法的檢測(cè)分析。在檢測(cè)過(guò)程中主要考慮檢測(cè)電位、運(yùn)行緩沖液濃度和pH，分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間對(duì)分離和檢測(cè)的影響。許雪琴等［20］采用毛細(xì)管電泳-柱端安培檢測(cè)法測(cè)定蓮子心中蘆丁和金絲桃苷的含量，以微碳圓盤電極(φ=0.5mm)為工作電極，檢測(cè)電位為0.95 V(vs.Ag/AgCl)，pH 為7.25 的50mmol·L－1Na2B4O7和100mmol·L－1NaH2PO4緩沖液為運(yùn)行液，當(dāng)分離電壓為15 kV時(shí)，在15min內(nèi)完全分離，荷葉堿、蘆丁和金絲桃苷檢出限(S/N=3)分別為 0.02，0.05 和0.04 μg·mL－1，并測(cè)得蓮子心中荷葉堿、蘆丁和金絲桃苷的含量分別為0.41%、0.11% 和0.0 82%，檢測(cè)結(jié)果令人滿意，可為蓮子心的質(zhì)量控制提供快速的分析方法。

2.2 檢測(cè)方法比較 以上3種檢測(cè)方法都有其優(yōu)點(diǎn)和不足。紫外-可見分光光度法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、適用性廣、準(zhǔn)確度和精密度較好的特點(diǎn)，但特異性差，目前只用來(lái)測(cè)定天然藥物中總黃酮含量;毛細(xì)管電泳-安培檢測(cè)法具有高分辨率和低檢測(cè)限的優(yōu)勢(shì)，在檢測(cè)天然藥物黃酮中的應(yīng)用越來(lái)越多，但要求被檢測(cè)物質(zhì)具有良好的電化學(xué)活性，檢測(cè)范圍受到限制;HPLC法既有分離又有檢測(cè)功能，結(jié)果準(zhǔn)確，還可以檢測(cè)到單體化合物;近年發(fā)展的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在對(duì)黃酮定性定量測(cè)定的同時(shí)，還可以對(duì)單體成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，是檢測(cè)蓮子心中未知黃酮組分的有效手段。

3 蓮子心中黃酮類化合物抗氧化和抑菌活性

黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、解毒護(hù)肝和細(xì)胞保護(hù)作用，并對(duì)心血管、機(jī)體內(nèi)分泌和代謝、細(xì)胞均有影響［21］。它能通過(guò)血腦屏障，吸收活性自由基，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，并能將起催化氧化作用的金屬離子絡(luò)合，具有抗氧化、抗衰老的作用［22］。黃酮類化合物是蓮子心的活性成分之一，在抗氧化和抑菌活性方面研究較少，現(xiàn)綜述如下。

3.1 抗氧化、清除自由基作用 傳統(tǒng)合成抗氧化劑存在一定毒性，甚至可致畸、致癌，許多國(guó)家開始限制甚至禁止使用某些合成抗氧化劑，而多酚類物質(zhì)中黃酮類化合物因在自然界分布廣泛、抗氧化活性強(qiáng)、毒副作用低而備受關(guān)注［23］。張敏等［24］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，蓮子心水提液可較好地清除Fenton體系產(chǎn)生的羥自由基和鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子，能明顯降低小鼠肝、腎勻漿自氧化產(chǎn)生的丙二醛(malondialdehyde，MDA)，同時(shí)對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的小鼠紅細(xì)胞溶血有較明顯的抑制作用，說(shuō)明蓮子心水提液具有很強(qiáng)自由基清除能力，對(duì)組織細(xì)胞以及亞細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用。張俊生等［25］參照Fenton反應(yīng)建立羥基自由基生成模型，測(cè)得當(dāng)蓮子心總黃酮的濃度為21.78 μg·mL－1時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除能力達(dá)到12.16%;采用國(guó)際通用的烘箱強(qiáng)化貯存法，65℃下測(cè)得對(duì)植物油的抗氧化能力強(qiáng)于對(duì)動(dòng)物油的抗氧化能力，說(shuō)明蓮子心黃酮提取物可作為天然抗氧化劑使用。

3.2 抑菌作用 細(xì)菌耐藥性是全球公共衛(wèi)生面臨的最嚴(yán)重的威脅之一，也迫切需要尋找新的有效治療藥物。黃酮是廣泛存在于植物中的一類化合物，具有直接抑菌、協(xié)同抑菌及抑制細(xì)菌毒性等作用［26］，作用機(jī)制主要通過(guò)抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶、抑制細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的功能、抑制細(xì)菌能量代謝等方面發(fā)揮抑菌功效［27］。曾紹校等［15］研究發(fā)現(xiàn)，蓮子心總黃酮對(duì)沙門菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌等 細(xì) 菌 的 最 低 抑 菌 濃 度 分 別 為 0.5，1，2，4，4 mg·mL－1，蓮子心總黃酮的抑菌活性與蘆丁相近，結(jié)果為蓮子心黃酮作為天然防腐劑的開發(fā)和利用提供了一定的理論依據(jù)。

4 展望

黃酮類化合物只存在于植物中，對(duì)其提取、分離、檢測(cè)技術(shù)的研究很重要。隨著現(xiàn)代提取、分離、鑒定技術(shù)的發(fā)展，超臨界流體技術(shù)、半仿生提取技術(shù)、連續(xù)逆流提取技術(shù)、膜分離技術(shù)等在蓮子心黃酮類化合物的提取分離中將會(huì)得到廣泛應(yīng)用，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法等一些現(xiàn)代分析工具的應(yīng)用也會(huì)日趨增多。

我國(guó)蓮子心資源十分豐富，從蓮子心中提取的黃酮安全、無(wú)毒，具有清除自由基和抗氧化活性功能，也具有明顯的抑菌作用，因此蓮子心黃酮具有較高的開發(fā)價(jià)值。隨著對(duì)蓮子心黃酮抗氧化、抑菌活性的進(jìn)一步研究，特別是體內(nèi)抗氧化、抑菌活性的研究，使其在預(yù)防和治療自由基誘發(fā)的疾病以及抗衰老等方面有著廣泛的前景，并將有助于其在藥品、化妝品、保健品、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:256.

［2］何錦婷，虞舜.蓮子心的現(xiàn)代臨床應(yīng)用［J］.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，8(6):544－546.

［3］朱利蘭.黃酮類化合物抗氧化活性的Free-Wilson模型［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，34(4):392－394.

［4］肖貴平.建蓮蓮心黃酮類物質(zhì)水浸提條件優(yōu)化［J］.亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2011，7(3):192－196.

［5］蔡定建，柳茶花，鐘鴻鳴，等.蓮子心中黃酮類物質(zhì)的提取和測(cè)定［J］.中國(guó)釀造，2010，(1):132－135.

［6］周芳.蓮子心中總黃酮、多糖的分離純化及氨基酸、農(nóng)殘測(cè)定研究［D］.長(zhǎng)沙:中南大學(xué)，2013:5.

［7］周燕芳.超聲波輔助提取蓮子胚芽總黃酮的研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52(24):6132－6135.

［8］肖貴平.響應(yīng)面法優(yōu)化蓮心黃酮類物質(zhì)微波提取工藝的研究［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32(11):2163－2168.

［9］余其鳳，周文富.蓮子心總黃酮的微波輔助提取研究［J］.化學(xué)與生物工程，2011，28(2):43－48.

［10］肖貴平.微波輔助提取蓮心黃酮類物質(zhì)工藝參數(shù)的優(yōu)化［J］.農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2011，(10):19－23.

［11］肖貴平.果膠酶對(duì)蓮心中黃酮類物質(zhì)提取效果研究［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(3):267－271.

［12］林志欽，彭彬，曾紹校，等.響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取蓮子心中黃酮類化合物［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，12(3):45－51.

［13］韓雅慧，陶寧萍.甘草黃酮提取及其抗氧化能力測(cè)定方法研究進(jìn)展［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(11):89－93.

［14］季愛民，徐峰，張忠義，等.蓮子心超臨界CO2萃取物化學(xué)成分分析［J］.中國(guó)藥業(yè)，2006，15(2):31－34.

［15］曾紹校，林志欽，陳玲，等.蓮子心總黃酮的大孔吸附樹脂純化及其抑菌活性［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013，42(6):660－664.

［16］楊明，黃劍波，胡文娥.微波、超聲波提取蓮子芯黃酮方法比較［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(4):70－73.

［17］張麗珍，周之榮.聚酰胺柱層析-分光光度法測(cè)定蓮子心藥材中的總黃酮含量［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19(6):1299－1300，1303.

［18］張巖，曹國(guó)杰，張燕，等.黃酮類化合物的提取以及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(1):154－158.

［19］曾建偉，朱曉勤，葉錦霞，等.HPLC法測(cè)定蓮子心中蘆丁的含量［J］.今日藥學(xué)，2010，20(7):7－9.

［20］許雪琴，余麗雙，陳國(guó)南.毛細(xì)管電泳-柱端安培檢測(cè)測(cè)定蓮子心中荷葉堿、蘆丁和金絲桃苷的含量［J］.分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2008，14(3):140－143.

［21］陳叢瑾，王琪，李欣.黃酮類化合物抗氧化和抑菌生物活性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥房，2011，22(35):3346－3348.

［22］KHLEBNIKOV A I，SCHEPETKIN I A，DOMINA N G，et al.Improved quantitative structure-activity relationship models to predict antioxidant activity offlavonoids in chemical，enzymatic，and cellular systems［J］.Bioorg Med Chem，2007，15(4):1749－1770.

［23］陳叢瑾，王琪，李欣.黃酮類化合物抗氧化和抑菌生物活性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥房，2011，22(35):3346－3348.

［24］張敏，鄭鐵松，陶錦鴻，等.蓮子心水提液體外抗氧化活性的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(8):83－86.

［25］張俊生，陳莉華，楊順清，等.超聲波輔助乙醇提取蓮子心總黃酮及其抗氧化活性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(3):220－223.

［26］游庭活，劉凡，溫露，等.黃酮類化合物抑菌作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)雜志，2013，38(21):3645－3650.

［27］玄紅專，胡福良.黃酮類化合物抑制微生物活性及其作用機(jī)制［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22(1):171－174.