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      雞TLR4基因抗沙門氏菌的研究進(jìn)展

      2015-12-10 04:15:40胡文元李琦華豆騰飛華葛長(zhǎng)榮賈俊靜劉麗仙云南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆明650202云農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院昆明65003
      養(yǎng)禽與禽病防治 2015年10期
      關(guān)鍵詞:內(nèi)含子外顯子沙門氏菌

      胡文元 李琦華豆騰飛 榮 華葛長(zhǎng)榮 賈俊靜劉麗仙,2* (云南農(nóng)業(yè)大學(xué),昆明65020;2云 南 農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,昆明 65003)

      沙門氏菌感染引起的畜禽疾病給當(dāng)代養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害,使得沙門氏菌病成為焦點(diǎn)而被持續(xù)爭(zhēng)論和關(guān)注。由于該病呈垂直和水平兩種方式傳播,且隱性感染家禽不能被及時(shí)發(fā)現(xiàn),使得控制和解決沙門氏菌污染成為世界性的難題。

      目前控制該病多利用凈化手段和飼喂抗生素的方法,然而由于抗生素的大量使用使得耐藥菌株不斷出現(xiàn)且造成了抗生素殘留問題。由于沙門氏菌感染與機(jī)體狀況有關(guān),所以,在抵抗沙門氏菌感染過程中機(jī)體自身固有的免疫系統(tǒng)起到了決定性的作用。因此,尋找與免疫相關(guān)的候選基因至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)TLR4基因可作為抗沙門氏菌感染的候選基因。TLR4作為內(nèi)毒素脂多糖(LPS)最重要的模式識(shí)別受體,不僅是連接獲得性免疫和先天性免疫的橋梁,在抗感染過程中調(diào)節(jié)獲得性免疫,發(fā)揮著天然免疫的作用,還在介導(dǎo)革蘭氏陰性菌及其LPS的宿主反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[1]。

      1 TLR4基因的結(jié)構(gòu)分布

      HashimotoC等在研究果蠅胚胎發(fā)育中發(fā)現(xiàn)了Toll樣受體[2]。自1997年以后,與Toll類似的一組蛋白被研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn),稱為Toll樣受體,TLR4是TLRs家族的重要成員之一,首先由Medzhitov等[3]發(fā)現(xiàn)。到目前為止至少有13種TLRs被發(fā)現(xiàn),在雞上已發(fā)現(xiàn)11種。作為機(jī)體的第一道防線,它們?cè)跈C(jī)體各組織中廣泛分布,并能特異性識(shí)別大量病原體及組織代謝產(chǎn)物,為機(jī)體抵抗外源病菌入侵提供可靠保障。

      在家禽及其抗沙門氏菌感染與免疫的研究上,對(duì)于TLR4的研究還處于初級(jí)階段。Leveque等[4]通過比較基因組學(xué)方法,首次克隆了雞的TLR4基因。該基因定位于雞17號(hào)染色體上,編碼843個(gè)氨基酸,序列全長(zhǎng)4452bp,共有3個(gè)外顯子,2個(gè)內(nèi)含子。由于第三外顯子較長(zhǎng),為2260bp,因此雞TLR4基因的SNP主要集中在第三外顯子區(qū)域。雞TLR4的兩個(gè)內(nèi)含子區(qū)域分別為934bp和984bp。2個(gè)內(nèi)含子區(qū)域也含有較為豐富的SNP,這些SNP與外顯子的SNP為研究SNP與雞抗革蘭氏陰性菌的關(guān)系提供了豐富的遺傳材料。

      2 雞TLR4基因的研究進(jìn)展

      2.1 沙門氏菌感染對(duì)TLR4基因表達(dá)的影響

      目前研究表明,家禽的腸道和脾臟在抵抗沙門氏菌感染的局部免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。Abasht等[5]對(duì)雞感染沙門氏菌后機(jī)體內(nèi)各組織器官TLRs的mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)不同品系的雞群中,F(xiàn)ayouni雞與來航雞相比,TLR4在盲腸和脾臟中的表達(dá)量差異顯著。感染組與對(duì)照組相比,雛雞腸炎沙門氏菌感染后,TLR4基因的表達(dá)水平在盲腸和脾臟中明顯上調(diào),并通過分析發(fā)現(xiàn)在盲腸中TLR4的表達(dá)量與盲腸的沙門氏菌載菌量呈極顯著相關(guān)[6]。李鵬等[7]研究表明,感染沙門氏菌組TLR4基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,并在感染后的第3和第7天mRNA的表達(dá)量達(dá)到了極顯著水平。Sadeyen等[8]通過對(duì)雞沙門氏菌易感和抗性品系進(jìn)行TLR4基因mRNA表達(dá)水平的試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果表明,在沙門氏菌感染7天后,TLR4基因在抗性品系雞的組織器官中的表達(dá)水平極顯著高于易感品系雞,同時(shí)還發(fā)現(xiàn),一氧化氮合成酶基因的表達(dá)量在抗病品系雞中也極顯著高于易感品系,說明了TLR4基因的表達(dá)量與機(jī)體免疫相關(guān)基因存在著不同程度的相關(guān)性,同時(shí)也表明了在發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子幫助下,TLR4基因可能為宿主提供沙門氏菌感染的危險(xiǎn)信號(hào)。所以沙門氏菌感染與TLR4基因的表達(dá)水平存在著緊密的相關(guān)性。

      2.2 沙門氏菌感染與TLR4基因多態(tài)性的關(guān)系

      目前對(duì)于沙門氏菌感染與雞TLR4基因的多態(tài)性的關(guān)系[9]的研究進(jìn)展比較緩慢。研究表明,雞TLR4基因第三外顯子上有2個(gè)突變位點(diǎn),可造成編碼TLR4蛋白的氨基酸發(fā)生改變,進(jìn)而引起機(jī)體對(duì)沙門氏菌感染產(chǎn)生不同反應(yīng)[10,11]。宋詠梅等[12]利用基因組直接測(cè)序法對(duì)引進(jìn)品種雞和地方品種雞進(jìn)行TLR4基因的部分序列單核苷酸多態(tài)性檢測(cè),SNP檢測(cè)發(fā)現(xiàn),共檢測(cè)到36個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),并發(fā)現(xiàn)TLR4基因編碼序列的突變位點(diǎn)與機(jī)體對(duì)于病原菌的抗性具有重要作用。還有研究表明,雞TLR4基因上的突變可能與機(jī)體沙門氏菌載菌量相關(guān)。Beaumont等[13]研究報(bào)道雞TLR4與沙門氏菌易感性相關(guān),試驗(yàn)以產(chǎn)蛋母雞為研究素材,在TRL4序列中共發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs,這些突變位點(diǎn)與某些組織器官的沙門氏菌載菌量有一定的相關(guān)性,尤其是在盲腸和卵巢中顯著相關(guān)。Malek等[14]對(duì)雞的遺傳資源群體進(jìn)行了TLR4基因內(nèi)含子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TLR4基因內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)1個(gè)G156C的SNP突變位點(diǎn)。進(jìn)一步做關(guān)聯(lián)分析表明,該SNP與脾臟載菌量呈中度相關(guān),并且還發(fā)現(xiàn)TLR4基因與雞抗沙門氏菌感染存在一定相關(guān)。Leveque等[4]以沙門氏菌抗感和易感品系作比較,通過序列遺傳變異分析發(fā)現(xiàn),在TLR4基因第三外顯子編碼區(qū)域共發(fā)現(xiàn)TLR4基因的14個(gè)突變位點(diǎn)。經(jīng)預(yù)測(cè)分析表明,在保守區(qū)域有5個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變進(jìn)而導(dǎo)致氨基酸的改變;在非保守區(qū)域的2個(gè)突變位點(diǎn)導(dǎo)致了氨基酸發(fā)生改變,而且這2個(gè)突變位點(diǎn)引起氨基酸改變僅存在于易感品系的商品代雞的基因組信息中。因此,Leveque等表明,TLR4基因有可能為宿主抗沙門氏菌感染相關(guān)的候選免疫基因。劉艷等[15]以紅色原雞與14個(gè)地方品種雞為試驗(yàn)對(duì)象,通過PCR-SSCP技術(shù)對(duì)TLR4基因第二外顯子的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果基因分型發(fā)現(xiàn)在第二外顯子區(qū)域有3種基因型AA、AB和BB,分析認(rèn)為BB基因型可能是機(jī)體免疫應(yīng)答的有利基因型,對(duì)于抗沙門氏菌感染具有一定的免疫應(yīng)答作用。陶志云等[16]對(duì)我國(guó)4個(gè)地方雞種的TLR4基因第2內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn),在1 894bp處有1個(gè)為G-C替換的SNP位點(diǎn),這一SNP導(dǎo)致種間基因型差異顯著,并推測(cè)出品種間對(duì)特定病原菌及其所引發(fā)的免疫反應(yīng)類型具有較大差異。因此研究表明,TLR4基因很有可能為宿主抗沙門氏菌感染相關(guān)的候選免疫基因。

      3 展望

      采用免疫遺傳學(xué)原理篩選與沙門氏菌感染有關(guān)的抗病基因可為選育抗病新品種提供可靠依據(jù)。因此,探索TLR4基因的作用機(jī)制為尋找預(yù)防和治療沙門氏菌感染提供了新的思路和方法,為畜禽的分子標(biāo)記輔助選育、抗病品種選育和疾病防治等方面的研究提供理論依據(jù)。

      [1]溫樂.LPS和沙門氏菌刺激時(shí)雞腦內(nèi)TLR4的表達(dá)規(guī)律研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

      [2]Hashimoto C,Hudson K L,Anderson K V.The Toll gene of Drosophila,required for dorsal ventral embryonic polarity,appears to encode a transmembrane protein[J].Cell,1988,52(2):269-279.

      [3]Medzhitov R,Preston-Hurburt P,Janeway CA.A human homologue of the Drosophila Tollprotein signals activation of adaptor immunity[J].Nature,1997,388:394-7.

      [4]Leveque G,F(xiàn)orgetta V,Morroll S,et al.Allelic variation in TLR4 is linked to susceptibility to Salmonella enterica serovar Typhimurium infectionin chickens[J].Infect Immun,2003,71(3):1116-24.

      [5]Abasht B,Kaiser M.G,Van der Poel J,Lamont S.J.Genetic lines differ in Toll-like receptor gene expression in spleens of chicks inpculated with Salmonella enterica serovar Enteritidis[J].Poultry Sci,2009,88(4):744-749.

      [6]AbashtB.KaiserM.G.LamontS.J.Toll-like receptor gene expression in cecum,spleen of advanced intercross line chicks infected with Salmonella enterica serovar Enteritidis[J].Veterinary Immunology,Immunopathology,2008,123(3-4):314-323.

      [7]李鵬,夏平安,宋詠梅,等.雞TLR4基因表達(dá)水平與沙門氏菌感染關(guān)系的研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2009,36(5):72-4.

      [8]Sadeyen JR,Trotereau J,Protais J,et al.Salmonella carrierstate in hens:study ofhost resistance by a gene expression approach.Microb Inf,2006,8:1308-14.

      [9]孫鈺.TLR4基因的變異分析及TLRs基因與雞沙門氏菌感染的相關(guān)性研究.[D].山東:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

      [10]趙興旺.雞TLR4不同突變基因型對(duì)抗腸炎沙門氏菌感染的差異[D].北京:北京畜牧獸醫(yī)研究所,2011.

      [11]宋詠梅.雞TLR4信號(hào)通路與腸炎沙門氏菌感染關(guān)系的研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2010.

      [12]宋詠梅,龐建建,趙桂蘋,等.TLR4基因SNP檢測(cè)及在中外雞種中的群體變異分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(16):1-7.

      [13]Beaumont C,Protais J,Pitel F,et al.Effect of two candidate genes on the Salmonella carrier state in fowl[J].Poultry Science,2003,82(5):721.

      [14]Malek M,Hasenstein J R,Lamont S J.Analysis of chicken TLR4,CD28,MIF,MD-2,and LITAFgenes in a Salmonella enteritidis resource population[J].Poultry Science,2004,83(4):544-549.

      [15]劉艷,包文斌,常國(guó)斌,等.14個(gè)雞品種和紅原雞TLR4基因外顯子2多態(tài)性分析[C].中國(guó)動(dòng)物遺傳育種研究進(jìn)展——第十五次全國(guó)動(dòng)物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集,2009,40.

      [16]陶志云,徐文娟,宋衛(wèi)濤,等.4個(gè)品種雞Toll樣受體4基因第2內(nèi)含子的多態(tài)性分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2013,40(1):145-148.

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