林 莉，秦禮康,*，張 偉

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州鑫龍食品開發(fā)有限公司，貴州 安順 561000）

薏米糠蛋白的提取工藝優(yōu)化及其功能性質(zhì)

林 莉1，秦禮康1,*，張 偉2

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州鑫龍食品開發(fā)有限公司，貴州 安順 561000）

以超臨界脫脂薏米糠粉粕為研究對象，采用正交試驗優(yōu)化堿提蛋白工藝，并以酶法提取水相液蛋白為對照，比較兩種蛋白的功能性質(zhì)。結(jié)果表明，最佳的堿提條件為料液比1∶8、提取溫度45 ℃、提取時間4 h、pH 9，平均提取率為63.75%；兩種蛋白均含16 種氨基酸，且7 種必需氨基酸齊全；水酶法提取蛋白的溶解性、乳化性及其穩(wěn)定性、起泡性均優(yōu)于粉粕堿提蛋白。

薏米糠蛋白；提?。还δ苄再|(zhì)

薏苡（Coix lachrymajobi L.）為禾本科（Gramineae），屬草本植物，它的干燥成熟種仁稱為薏苡仁，俗稱“苡仁米”、“藥王米”、“回回米”、“六谷米”等，其蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等成分含量遠超過大米，含有薏苡酯等功效成分，有豐富的營養(yǎng)藥用價值[1]。薏米糠是薏苡在加工成精米的過程中所產(chǎn)生的黃粉，其占總質(zhì)量的5%左右，與米糠營養(yǎng)成分相似[2]。目前主要用作飼料，在畜牧業(yè)發(fā)展中有重要作用。

堿法提取簡單易行，提取率及純度較高，但產(chǎn)品風(fēng)味和色澤不理想[3]。酶法提取反應(yīng)條件較為溫和，對蛋白影響小，而且降解后的多肽具有一定的生理活性，在增大米糠蛋白溶解度同時，能改善蛋白發(fā)泡、乳化等物化性能[4]，但提取率低，成本較高。

本實驗以薏米糠蛋白的提取方法為參照，優(yōu)化了堿提薏米糠蛋白工藝，比較了堿提薏米糠蛋白和水酶法提取蛋白的純度及功能性質(zhì)，旨在為薏米糠的進一步利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米糠（薏米經(jīng)篩選除雜、干燥脫殼后，碾成精白米過程中產(chǎn)生的黃粉） 貴州安順鑫龍食品開發(fā)有限公司；脫脂薏米糠（超臨界CO2提油所得薏米糠粉粕[5]）實驗室自制。

氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀等（均為分析純） 成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S6型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；UV-7520 PC型紫外-可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；AR224CN型電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海錦昱科學(xué)儀器有限公司；BZF-30型L-8800氨基酸分析儀 日本Hitachi Science Systems公司；TGL20M型臺式高速冷凍離心機 長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 堿提薏米糠粉粕蛋白工藝流程

稱取50 g脫脂薏米糠粉粕，過60 目篩后按照一定的料液比（g/mL）與水混合，加入0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，在一定的溫度條件下反應(yīng)一段時間，4 000 r/min離心15 min，取上清液。用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至等電點（5.5），將溶液倒入培養(yǎng)皿并放置于真空干燥箱中冷凍干燥24 h，得薏米糠蛋白粉[6-7]。

1.3.2 堿提薏米糠粉粕蛋白的正交試驗設(shè)計

1.3.2.1 單因素試驗

準確稱取一定量過60 目篩的脫脂薏米糠，分別以料液比、提取時間、提取溫度、pH值4 個因素進行單因素試驗，以蛋白提取率為衡量指標。具體方案見表1。

表 1 粉粕堿提蛋白條件的單因素試驗條件Table 1 Single factor design for alkali extraction of protein

1.3.2.2 正交試驗優(yōu)化堿提薏米糠粉粕蛋白工藝參數(shù)

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交試驗設(shè)計選出堿提薏米糠蛋白提取率的最佳條件。

表 2 正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.3 水酶法提取水相液蛋白工藝流程

分別稱取未脫脂薏米糠粉50 g，過60 目篩后按照1∶6（g/mL）的料液比與水混合，在沸水中煮1 h，冷卻后調(diào)節(jié)pH 6，然后加入質(zhì)量分數(shù)0.8%的酶（淀粉酶+中性蛋白酶）在50 ℃條件下進行酶解反應(yīng)3 h，待酶解結(jié)束，冷卻加入150 mL正己烷萃取10 min，同時用玻璃棒攪拌，4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心得到油和有機溶劑、乳狀液、水解液、渣。收集水解液濃縮，放入真空冷凍干燥箱中冷凍干燥24 h，得到水酶法提取蛋白粉[8-9]。

1.3.4 分析測定方法

1.3.4.1 蛋白含量測定

采用凱氏定氮法測定蛋白含量，由式（1）、（2）計算蛋白提取率和純度。

1.3.4.2 薏米糠蛋白氨基酸評分

采用氨基酸自動分析儀法，氨基酸評分（amino acid scores，AAS）計算[10]如式（3）所示。

1.3.4.3 薏米糠蛋白基本性質(zhì)

1）溶解性

稱取約1 g左右的薏米糠蛋白，加入50 mL蒸餾水，室溫條件下磁力攪拌45 min，3 000 r/min離心30 min，取上清液用凱氏定氮法測定蛋白含量，重復(fù)3 次[11]。

2）乳化性及其穩(wěn)定性

配制1%蛋白溶液，在室溫條件下攪拌使其充分溶解；將5 mL配制好的蛋白溶液和5 mL大豆色拉油混合均勻在10 000 r/min轉(zhuǎn)速均質(zhì)30 s，形成均一的乳化溶液后在2 500 r/min條件下離心5 min。測量離心管中乳化層高度和液體總高度，重復(fù)測定3 次[12]。用式（5）計算。

將上述處理好的乳化樣品置于80 ℃水浴中保溫30 min，然后于2 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，計算其乳化穩(wěn)定性。

3）持水性

精確稱取1g的薏米糠蛋白置于已稱質(zhì)量的離心管中，緩慢加入10mL水并用玻璃棒攪拌至樣品呈漿狀析出，振蕩離心管并在2 500r/min轉(zhuǎn)速離心10min，測定上清液體積[13]。

4）吸油性

準確稱取0.5 g薏米糠蛋白于10 mL離心管中，加入5 mL大豆油攪拌1 min，放置于室溫條件下保溫30 min并在2 500 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，體積前后差即為吸油量[13]。

式中：V為前后體積差/mL；m為蛋白質(zhì)量/g。

5）起泡性及其穩(wěn)定性

配制5%薏米糠蛋白溶液100 mL放入燒杯中，以10 000 r/min速率均質(zhì)3 min，記錄液面高度為h0，靜置30 min后再次記錄液面高度為h30[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件及采用Origin軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉粕堿提蛋白單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對粉粕堿提蛋白提取率影響

圖 1 料液比對蛋白提取率影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate of protein

從圖1可看出，在1∶5～1∶8范圍內(nèi)，隨著溶劑用量增加，蛋白提取率逐漸增加，當料液比為1∶8時提取率達到53.99%。當料液比為1∶9時，蛋白提取率開始呈下降趨勢。因此，粉粕堿提蛋白提取率的最佳料液比為1∶8。

2.1.2 提取時間對粉粕堿提蛋白提取率影響

圖 2 提取時間對蛋白提取率影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of protein

從圖2可知，提取時間為3 h，蛋白提取率達到最大值55.14%。但是當提取時間在3 h之后，蛋白提取率逐漸呈下降趨勢。其原因可能是隨著提取時間的逐漸延長，薏米糠蛋白不斷被溶解出來，達到一定時間其溶解量達到峰值，延長提取時間，溶出的蛋白會發(fā)生水解導(dǎo)致提取率降低[15]。因此，粉粕堿提蛋白提取率的最佳時間為3 h。

2.1.3 提取溫度對粉粕堿提蛋白提取率影響

圖 3 提取溫度對蛋白提取率影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of protein

從圖3可知，粉粕堿提蛋白提取率在40 ℃之前隨著溫度的升高不斷增加，在40 ℃時達到最大值，當溫度不斷增加，蛋白提取率又呈下降趨勢。其原因可能是由于高溫使淀粉發(fā)生糊化，形成了黏稠體系妨礙蛋白的溶出[16]。因此，粉粕堿提蛋白的最佳溫度為40 ℃。

2.1.4 pH值對粉粕堿提蛋白提取率影響

圖 4 pH值對蛋白提取率影響Fig.4 Effect of solvent pH on the extraction rate of protein

由圖4可知，蛋白提取率隨著pH值增加而增加，當pH值增加到9后，蛋白提取率呈平緩趨勢。由于薏米糠粉粕中存在蛋白質(zhì)、纖維素等物質(zhì)結(jié)合形成的粒子，并且存在大量的二硫鍵和疏水基團，這些緊密結(jié)構(gòu)都會導(dǎo)致蛋白不易溶出[17]。在堿性環(huán)境中這些結(jié)構(gòu)會變疏松，并且氫鍵會被破壞，某些極性基團發(fā)生解離，從而提高蛋白溶出量。但是，強堿性也會引起薏米糠蛋白理化性質(zhì)的改變，氨基酸間會發(fā)生脫水縮合反應(yīng)而產(chǎn)生有毒物質(zhì)[18]，降低其營養(yǎng)價值。因此，綜合考慮粉粕堿提蛋白最佳pH值為9。

2.2 粉粕堿提蛋白正交試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以蛋白提取率作為評價指標，利用正交試驗篩選出粉粕堿提蛋白的最佳工藝參數(shù)，試驗結(jié)果見表3。

表 3 粉粕堿提蛋白正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Results of orthogonal array experiments for the optimization of alkali extraction of protein

由極差分析可得出影響蛋白提取率的主次因素為pH值＞提取溫度＞提取時間＞料液比，最佳提取條件是A2B3C3D2，即提取pH 9、提取溫度45 ℃、提取時間4h、料液比1∶8。在正交試驗得出的最佳條件下進行堿提粉粕蛋白，其提取率為63.75%，此結(jié)果與曲曉婷等[19]的相似。

2.3 兩種提取方式對薏米糠蛋白提取率及純度影響

圖 5 不同提取方式對蛋白提取率影響Fig.5 Effect of extraction methods on the extraction rate of protein

從圖5可看出，粉粕堿提蛋白得率比水酶法提取蛋白高，粉粕堿提蛋白得率為63.75%，水酶法提取蛋白得率為42.67%。其原因在于堿液可以使薏米糠中緊密的結(jié)構(gòu)變得疏松，同時堿液可使某些基團發(fā)生解離，促使蛋白質(zhì)分離出來[20]。

圖 6 不同提取方式對蛋白純度的影響Fig.6 Effect of extraction methods on protein purity

從圖6可看出，兩種方法所得到的薏米糠蛋白純度均不高，但粉粕堿提蛋白純度高于水酶法提取蛋白，粉粕堿提蛋白純度71.55%、水酶法提取蛋白純度55.93%。其原因可能是薏米糠中纖維和淀粉含量較高，而水酶法加入淀粉酶后淀粉等水解成單糖溶解在水解液中，導(dǎo)致水解液中的蛋白純度不高。

2.4 兩種薏米糠蛋白氨基酸分析

表 4 薏米糠蛋白氨基酸組成分析Table 4 Amino acid composition of adlay bran protein

從表4可看出，兩種蛋白氨基酸在組成上完全相同均有16 種，但含量有差別，粉粕堿提蛋白的總氨基酸遠遠高于水酶法水解。兩種方式所得到的蛋白均含有7 種必需氨基酸，從每種氨基酸含量來看，堿提方式也比水酶法得到的氨基酸含量高。兩種方式所得蛋白中含量最高的氨基酸為谷氨酸，粉粕堿提蛋白達到139.82 mg/g，水酶法提取蛋白為37.06 mg/g，谷氨酸在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝中占重要地位，參與動物、植物和微生物中的許多重要化學(xué)反應(yīng)，是生物機體內(nèi)氮代謝的基本氨基酸之一[21]。在必需氨基酸中，亮氨酸含量較其他更高，分別為82.46 mg/g和13.33 mg/g，亮氨酸的缺乏會導(dǎo)致低血糖癥狀[22]。賴氨酸具有促進胃酸分泌、增進食欲的作用，在所得蛋白中賴氨酸的含量分別為45.87 mg/g和13.18 mg/g。從表5可看出，粉粕堿提蛋白氨基酸評分與FAO/WHO推薦模式接近，必需氨基酸構(gòu)成合理，限制性氨基酸為蛋氨酸、胱氨酸、賴氨酸、蘇氨酸；水酶法提取蛋白氨基酸評分均小于1，必需氨基酸均為限制性氨基酸。粉粕堿提蛋白和水酶法提取蛋白的氨基酸綜合評分分別為1.05和0.23，因此，粉粕堿提蛋白的營養(yǎng)價值高于水酶法提取蛋白。

Tab

表 5 薏米糠蛋白必需氨基酸組成評價Table 5 Amino acid scores (AAS) in adlay bran protein

2.5 薏米糠蛋白基本性質(zhì)測定

2.5.1 薏米糠蛋白溶解性

圖 7 不同薏米糠蛋白溶解性折線圖Fig.7 Solubility of adlay bran proteins extracted by different methods

蛋白溶解性的優(yōu)劣直接關(guān)系到蛋白質(zhì)生理功能的強弱，而在不同pH值條件下其溶解性也不同。從圖7可看出，粉粕堿提蛋白的溶解性隨pH值的變化呈先降低再升高的趨勢，在pH 5時溶解性最低，這是由于堿提蛋白的等電點在pH 5附近，蛋白在此pH值時易析出，故溶解性差。而水酶法提取蛋白溶解性的變化趨勢與堿提不同，在pH 5時仍然有較好的溶解性，這是因為酶法提取時加入的酶將薏米糠蛋白酶解成小肽，從而提高了溶解性。

2.5.2 薏米糠蛋白乳化性及其穩(wěn)定性

圖 8 不同薏米糠蛋白乳化性折線圖Fig.8 Emulsifying properties of adlay bran proteins extracted by different methods

從圖8、9可看出，兩種薏米糠蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性與蛋白溶解性呈正相關(guān)性，在pH 5附近時，蛋白溶解性最小，其乳化性及其穩(wěn)定性也最小。這主要是由于當?shù)鞍兹芙庑孕r，蛋白無法與油脂形成乳化液。因此，要提高薏米糠蛋白的乳化性及其穩(wěn)定性，就要增加其溶解性。

圖 9 不同薏米糠蛋白乳化穩(wěn)定性折線圖Fig.9 Emulsifying stability of adlay bran proteins extracted by different methods

2.5.3 薏米糠蛋白持水性及吸油性

表 6 不同薏米糠蛋白的持水/持油能力Table 6 Water-holding and oil-holding capacities of adlay bran proteins extracted by different methods

文獻[24]報道，蛋白質(zhì)的持水能力與溶解性有關(guān)，溶解性越好，其持水能力越差。粉粕堿提蛋白的溶解性沒有水酶法提取蛋白高，故其持水能力好。蛋白質(zhì)的持油性是與其分子表面的親脂基團性質(zhì)有關(guān)[25]，容積密度越大，持油能力越大，粉粕堿提蛋白的持油能力為3.85mL/g。

2.5.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

圖 10 不同薏米糠蛋白起泡性折線圖Fig.10 Foaming capacity of adlay bran proteins extracted by different methods

圖 11 不同薏米糠蛋白起泡穩(wěn)定性折線圖Fig.11 Foaming stability of adlay bran proteins extracted by different methods

蛋白的起泡性是指能降低氣-液界面表面張力而幫助形成起泡的能力[26]。起泡穩(wěn)定性是指蛋白維持泡沫穩(wěn)定存在的能力。從圖10、11可看出，兩種薏米糠蛋白起泡性是隨pH值的增大呈上升趨勢，但是在等電點（pH 5）附近起泡能力弱，而起泡穩(wěn)定性正好相反。蛋白的起泡性與溶解性存在一定的關(guān)系，蛋白溶解越多，可溶部分就能參與泡沫形成，在等電點附近蛋白溶解性很低，故起泡性差；對于泡沫穩(wěn)定性而言，等電點附近的泡沫最穩(wěn)定，因為未溶解的蛋白通過吸附，增加了蛋白膜的黏合力[27]。

3 結(jié) 論

1）在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗對粉粕堿提蛋白工藝進行優(yōu)化，得到最佳的堿提蛋白條件為料液比1∶8、提取溫度45 ℃、提取時間4 h、pH 9。在此條件基礎(chǔ)上進行驗證實驗，蛋白提取率為63.75%。2）比較兩種蛋白的提取率和純度，粉粕堿提蛋白的得率（63.75%）高于水酶法提取蛋白（42.67%），粉粕堿提蛋白純度為71.55%，水酶法提取蛋白純度為55.93%；3）兩種蛋白含有16 種氨基酸且7 種必需氨基酸齊全，但粉粕堿提蛋白的氨基酸含量比水酶法提取蛋白高。4）水酶法提取蛋白的溶解性、乳化性及其穩(wěn)定性、起泡性均優(yōu)于粉粕堿提蛋白。

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Extraction and Functional Properties of Adlay Bran Protein

LIN Li1, QIN Likang1,*, ZHANG Wei2
(1. School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. Food Development Co. Ltd. of Xinlong, Anshun 561000, China)

The alkali extraction of protein from defatted adlay bran was optimized using orthogonal array design and the functional properties of the extracted protein were investigated in comparison to that obtained by aqueous enzymatic extraction. The optimal extraction conditions were found to be extraction at 45 ℃ for 4 h with a solid-to-solvent ratio of 1:8 at pH 9, resulting in an average extraction yield of 63.75%. The products obtained by both extraction methods contained 16 amino acids including 7 essential ones. However, the protein obtained by aqueous enzymatic extraction was superior to that obtained by this method regarding solubility, emulsifying properties and foaming properties.

adlay bran protein; extraction; functional properties

TS213

A

1002-6630（2015）02-0046-06

10.7506/spkx1002-6630-201502009

2014-06-22

貴州省重大專項（黔科合重大專項字[2013]6010-5；黔科合重大專項字[2014]6023）；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目（黔科合農(nóng)G字[2012]4001）；省市縣三方合作項目（安西科合gzassxxlch[2012]3006（1）；安市科合（2012）5）

林莉（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：240324317@qq.com

*通信作者：秦禮康（1965—），男，教授，博士，研究方向為食品加工與安全。E-mail：likangqin@126.com