施 瑛，裴 斐，周玲玉，楊方美，胡秋輝,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學理學院，江蘇 南京 210095；2.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210023；3.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

響應面法優(yōu)化復合酶法提取紫菜藻紅蛋白工藝

施 瑛1，裴 斐2，周玲玉1，楊方美3，胡秋輝3,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學理學院，江蘇 南京 210095；2.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210023；3.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

研究復合酶法提取紫菜藻紅蛋白的最優(yōu)工藝，篩選了復合酶的配比，并選取酶解溫度、提取時間、加酶量和pH值為自變量，采用響應面法研究各因素及其交互作用對紫菜藻紅蛋白得率和純度的影響。結果表明，紫菜藻紅蛋白復合酶法提取的最優(yōu)酶配比為纖維素酶和果膠酶質量比7∶3，通過響應面優(yōu)化，確定藻紅蛋白最優(yōu)提取工藝為：pH 6.8、酶解溫度39 ℃、提取時間7.2 h、在5 g樣品中加酶0.04 g。在此條件下藻紅蛋白得率為2.257%，純度達到1.656。經(jīng)過驗證，所得工藝參數(shù)準確，可用于復合酶法生產(chǎn)紫菜藻紅蛋白。

紫菜；藻紅蛋白；提??；復合酶法；響應面

紫菜是肉眼可見多細胞的生物，是海中互生藻類生物的統(tǒng)稱。紫菜一般生活在距離潮間帶數(shù)十米的海底，外表通常呈綠色，偶爾呈紅色。紫菜中含有豐富的藻紅蛋白，是海洋藻類中重要的捕光色素蛋白之一[1-2]。藻紅蛋白具有很高的醫(yī)療價值，它經(jīng)適宜波長的光激發(fā)后，可以產(chǎn)生單線態(tài)氧及其他的氧自由基，殺傷生物大分子，為癌癥等疾病的輔助治療提供了新的技術手段[3]，具有十分重要的研究價值和應用意義。

藻紅蛋白是一種胞內蛋白質，要提取分離，必須先要破碎紫菜細胞的壁和膜，使其以溶解的狀態(tài)釋放出來，并且要保持其活性。目前，提取分離藻紅蛋白的細胞破碎方法主要有機械破碎法、反復凍融法[4]、溶脹法[5]及超聲輔助提取法[6]等。應用酶法提取藻紅蛋白相對較少。酶法輔助提取反應條件溫和、能耗低，并且酶催化具有高效性和專一性，可以克服其他提取方式能耗高、提取率低、純度低等不足[7-8]。目前，酶法提取已經(jīng)廣泛的應用在多種植物多糖[7]、蛋白[9]和其他功能性成分[10]的提取中。采用復合酶破碎細胞的方法有助于紫菜的細胞壁膜的破碎，能有效提高藻紅蛋白的得率，而且，操作過程中可一直保持低溫狀態(tài)，確保其生物活性[11]。

響應面法是一種應用廣泛的試驗優(yōu)化方法，它可以有效快速地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，已應用于多種優(yōu)化實踐中[12-14]。因此，本實驗以紫菜為原料，以藻紅蛋白得率和純度為響應指標，采用復合酶法提取紫菜藻紅蛋白，并通過響應面法對藻紅蛋白提取工藝進行優(yōu)化，為藻紅蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫菜，由南通天福海苔有限公司提供。干紫菜經(jīng)粉碎后，過60 目篩，密封避光保存于—18 ℃冰箱備用。

纖維素酶（酶活力≥15 000 U/g）、果膠酶（酶活力≥500 U/g） 國藥集團化學試劑有限公司；硫酸銨（分析純） 南京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Mikro-ACM空氣篩分式粉碎機 日本Hosokawa Micron公司；BS210S電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TGL20M離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；DCTZ-200三頻多用途恒溫超聲提取機弘祥龍生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

紫菜粉碎（5.000 g）→按料液比1∶50加入0.1 mol/L PBS緩沖液（pH 6.8），加酶→避光水浴提取8 h→二次紗布過濾（100、200 目）→清液用20% (NH4)2SO4溶液鹽析除雜蛋白→離心→取上清液，45% (NH4)2SO4溶液鹽析得藻紅蛋白→ 透析→定容→檢測

1.3.2 紫菜藻紅蛋白提取方法

準 確稱取5.000 g紫菜干粉于6 個400 mL燒杯中，分別加入250 mL 0.1 mol/L的PBS緩沖溶液（pH值分別為6.6、6.8、7.0），再加入不同量的混合酶（經(jīng)實驗優(yōu)化后纖維素酶與果膠酶質量比為7∶3），攪拌均勻，分別在不同溫度（30、35 ℃和40 ℃）的水浴中避光提取8 h。然后分別用100 目和200 目的紗布過濾，收集清液，逐步加入分析純的固體(NH4)2SO4至終質量分數(shù)為20%，鹽析12 h，以8 000 r/min離心10 min，除去雜蛋白，再將清液中逐步加入分析純的固體(NH4)2SO4至終質量分數(shù)為45%，鹽析12 h，8 000 r/min離心10 min，去除清液，將沉淀溶解，用相對分子質量為3 000的透析袋流水透析24 h，再用去離子水透析24 h時，每4 h換一次水，將透析袋中的溶液定容到200 mL，進行檢測。

1.3.3 藻紅蛋白得率與純度計算方法

藻紅蛋白的得率和純度根據(jù)馬海樂等[15]的方法測定。將定容后的溶液稀釋10 倍，用1 cm比色皿測定其吸光度（A560nm、A617nm、A650nm及A280nm），然后按照式（1）、（2）計算藻紅蛋白得率和純度。

式中：ρPE為提取液中藻紅蛋白的質量濃度/（mg/mL），ρPE=0. 123A560nm—0. 068A617nm＋0. 015A650nm；VPE為提取液的體積/mL；MPE為干紫菜的質量/g。

1.3.4 酶的配比對藻紅蛋白得率和純度的影響

分別研究采用果膠酶、纖維素酶以及不同配比復合酶對藻紅蛋白得率和純度的影響，篩選最優(yōu)的復合酶配比。根據(jù)預實驗，纖維素酶含量越高有利于獲得更高的藻紅蛋白得率，因此，選擇纖維素酶質量分數(shù)分別為50%、70%和90%進行進一步研究。

1.3.5 單因素試驗

諸多研究表明，紫菜藻紅蛋白得率和純度主要受酶解溫度、提取時間、pH值等因素影響[16]。分別以藻紅蛋白得率和純度為指標，分別考察酶解溫度（20、25、30、35、40、45、50 ℃）、提取時間（6、7、8、9、10、11、12 h）、加酶量（0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g）和pH值（6.2、6.5、6.8、7.1、7.4）對藻紅蛋白得率和純度的影響。

1.3.6 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，以酶解溫度、提取時間、加酶量和pH值為關鍵工藝參數(shù)，設計四因素三水平Box-Behnken響應面試驗，以藻紅蛋白得率和純度為相應指標，共設計5 個中心點和29 個不同組合的試驗，試驗因素水平如表1所示。

表1 響應面試驗的因素水平及編碼Table1 Factors and levels used in response surface experiments

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)通過PASW statistics 18軟件進行分析，ANOVA程序用于方差分析，當P＜0.05時認為平均值間有顯著性差異。最小顯著差異法用于數(shù)據(jù)多重比較分析。數(shù)據(jù)以3 次獨立樣品測定結果的平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 酶的配比對藻紅蛋白得率和純度的影響

由圖1可知，當纖維素酶與果膠酶質量比 為0∶10～7∶3時，隨著纖維素酶添加比例的上升，藻紅蛋白得率顯著上升，但當纖維素酶質量分數(shù)超過70%后，得率略有下降。從純度來看，當纖維素酶與果膠酶質量比為0 ∶10～9∶1時，隨著纖維素酶添加比例的上升，藻紅蛋白純度逐漸上升，且添加90%的纖維素酶處理組的藻紅蛋白純度與只添加纖維素酶的處理組相比并無顯著性差異。綜合藻紅蛋白得率和純度考慮，選擇纖維素酶和果膠酶質量比為7∶3進行進一步研究。

圖1 酶的配比對藻紅蛋白得率和純度的影響Fig.1 Effects of ratio between two enzymes on the extraction rate and purity of phycoerythrin from laver

2.2 復合酶法提取紫菜藻紅蛋白的單因素試驗結果

圖2 pH值（A）、加酶量（B）、提取時間（C）、酶解溫度（D）D對紫菜藻紅蛋白得率和純度的影響Fig.2 Effect of pH (A)′total enzyme amount (B)′hydrolysis time (C and temperature (D on the extraction rate and purity of phycoerythrin from laver

pH值的高低直接影響著復合酶法提取紫菜藻紅蛋白過程中的酶活力[17]，由圖2A可知，隨著pH值的升高，紫菜藻紅蛋白的得率和純度均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，當pH值為6.8時，藻紅蛋白的得率和純度均達到最大值，這是因為試驗過程所用纖維素酶的最適pH值為6.5～7.0，過低或過高的pH值都會影響纖維素酶的活力，從而導致藻紅蛋白得率和純度下降[18]。酶反應底物的水解程度直接取決于所加酶量的多少[19]，如圖2B所示，紫菜藻紅蛋白的得率和純度隨著加酶量的增加呈現(xiàn)出了先上升、后下降，最后保持平穩(wěn)的趨勢。出于工業(yè)生產(chǎn)中成本核算的考慮，后續(xù)試驗中酶添加量以0.04 g為上限。由圖2C可以看出，紫菜藻紅蛋白的得率隨著提取時間的延長而增大，曲線呈先上升后下降，最終趨于平穩(wěn)的趨勢。在紫菜藻紅蛋白提取初期，多糖得率相對較高，隨著提取時間的進一步延長藻紅蛋白得率下降的原因可能是由于過長的提取時間導致藻紅蛋白的分解[20]。而紫菜藻紅蛋白的純度呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)下降的趨勢，這可能是由于過長的催化時間導致反應體系中的酶解速率進一步降低，而此時多糖等較難溶出的物質也隨著時間的增加逐漸被提取出來[21]，從而導致藻紅蛋白的純度降低。綜合考慮，選擇提取時間7 h作為最佳提取時間。溫度也是決定酶活力的重要因素，溫度過高，酶會變性失活，溫度過低，酶活力也會降低[22]。如圖2D所示，當酶解溫度在20～35 ℃時，紫菜藻紅蛋白的得率和純度均隨著溫度的升高而增加，當溫度達到35 ℃時，最大得率可達到（2.171±0.169）%，當酶解溫度超過35 ℃時，得率和純度開始下降。溫度升高可以提高酶的活性，且隨溫度的升高，布朗運動速率增加，分子相互碰撞的機會增加，酶催化效率增大，故紫菜藻紅蛋白的得率和純度呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。當溫度繼續(xù)升高，超過了酶的最適宜溫度時，酶逐漸失活，導致蛋白得率和純度下降[23]。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 Box-Behnken試驗設計及結果

本研究采用復合酶法提取紫菜藻紅蛋白，并通過響應面法中的Box-Behnken試驗設計優(yōu)化藻紅蛋白提取工藝參數(shù)。根據(jù)前期單因素試驗，結合文獻[24-26]，確定選擇pH值、酶解溫度、提取時間、加酶量為自變量，以紫菜藻紅蛋白的得率和純度為響應值，進行四因素三水平Box-Behnken響應面優(yōu)化試驗。在29個試驗組合條件下，試驗設計方案及數(shù)據(jù)處理結果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設計及其響應值Table2 Box-Behnken design matrix and response values for the yield and purity of phycoerythrin from llaavveerr

2.3.2 模型的建立及顯著性分析

基于參數(shù)評估，運用Design-Expert V6.0軟件可得出響應值與被檢變量之間的邏輯關系。對這些試驗數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，獲得編碼應變量（Y1紫菜藻紅蛋白得率與Y2純度）對編碼自變量（X1pH值、X2酶解溫度、X3提取時間和X4加酶量）的關系為：

為檢驗方程有效性，利用分析軟件進一步對其進行分析，其中復合酶法提取藻紅蛋白得率和純度的系數(shù)顯著性結果見表3，多元回歸模型的方差分析結果見表4。

表3 紫菜藻紅蛋白得率和純度擬合多元二次方程模型的方差分析Table3 Analysis of variance for each term in the fitted quadratic polynomial models for phycoerythrin yield and purity

表4 多元回歸模型方差分析表Table4 Analysis of variance (ANOVA for the quadratic polynomial models

由表3可知，方程的一次項中X1、X2、X4對響應值Y1（紫菜藻紅蛋白得率）的影響顯著（P＜0.05），X3對響應值Y1的影響極顯著（P＜0.01），X1和X3對響應值Y2（紫菜藻紅蛋白純度）的影響顯著（P＜0.05），X2對響應值Y2的影響極顯著（P＜0.01），X4對Y2的影響不顯著；二次項對Y1的影響極顯著（P＜0.01），對響應值Y1的影響不顯著，對響應值Y2的影響顯著（P＜0.05），對響應值Y2的影響極顯著（P＜0.01），和對Y2的影響不顯著；交互項X1X3和X1X4對響應值Y1的影響顯著（P＜0.05），X2X4對響應值Y1的影響極顯著（P＜0.01），X1X2、X2X3和X3X4對Y1的影響不顯著，X1X2對響應值Y2的影響顯著（P＜0.05），X1X3、X1X4、X2X3、X2X4和X3X4對Y2的影響不顯著。由此可知，各具體試驗因素對響應值的影響并非是簡單的線性關系。

由表4可知，回歸模型高度顯著，響應值Y1和Y2的相關系數(shù)R2分別為0.944 7和0.936 1，說明模型的擬合度好，表明紫菜藻紅蛋白得率和純度的試驗值和預測值時間有很好的一致性；調整相關系數(shù)R2Adj分別為0.889 4和0.872 2，說明藻紅蛋白得率和純度的模型分別能夠在88.94%和87.22%的程度上解釋試驗結果，僅分別有11.06%和12.78%不能用這兩個回歸模型表示。模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率[27]，本試驗中Y1和Y2模型失擬項的P值分別為0.173 9和0.476 0（都大于0.1），模型失擬項不顯著，進一步說明此模型的擬合度良好。離散系數(shù)（CV/%）表示試驗的精確度，數(shù)值越大，表明試驗的可靠性越差[28]，本試驗中Y1和Y2模型的CV值分別為2.33%和5.42%，說明模型方程能夠較好地反應真實值。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗誤差小，能夠準確的分析和預測復合酶法提取藻紅蛋白的得率和純度。

2.3.3 交互作用分析

響應面圖是回歸方程的形象描述，能夠直觀反映各個因素與響應值之間的關系以及兩因素間交互作用的類型，然后進一步優(yōu)化成生產(chǎn)條件[29-30]。響應面圖曲面坡度陡峭、等高線密集成橢圓形表示兩因素交互影響大，而坡度平緩、等高線呈圓形則與之相反[31]。

運用Design-Expert軟件所獲得的三維響應面圖如圖3、4所示。通過試驗發(fā)現(xiàn)，復合酶法輔助提取過程中的參數(shù)變化對藻紅蛋白得率和純度會產(chǎn)生不同的影響。圖3A和圖4A顯示了pH值（X1）和酶解溫度（X2）對紫菜藻紅蛋白得率（Y1）和純度（Y2）的影響，如圖可直觀的看出，當提取時間7 min、加酶量0.05g時，X1和X2對Y1的交互作用不顯著，X1和X2對Y2的交互作用顯著。圖3B和圖4B顯示了pH值（X1）和提取時間（X3）對紫菜藻紅蛋白得率（Y1）和純度（Y2）的影響，由圖可知，X1和X3對Y1存在交互作用，隨著pH值和提取時間的增加，紫菜藻紅蛋白的得率逐漸升高，但當pH值和提取時間增加到一定值后，紫菜藻紅蛋白的得率卻隨著pH值的增加和提取時間的延長而降低。X1和X3對Y2的相應曲面圖則較為平緩，說明X1和X3對Y2交互作用不顯著。同理，由圖3C～F和圖4C～F中可以看出，X1和X4、X2和X4對Y1的相應曲面圖坡度陡峭，等高線排列緊密且趨于橢圓形，表明pH值與加酶量、提取時間與加酶量對紫菜藻紅蛋白得率的交互影響相對較大，而X2和X3、X3與X4對Y1的響應面圖3C～F和X1與X4、X2與X3、X2與X4、X3與X4對Y2的相應曲面圖4C～F坡度相對平緩，等高線排列稀疏，表明酶解溫度與提取時間、提取時間與加酶量對紫菜藻紅蛋白得率，以及pH值與加酶量、酶解溫度與提取時間、酶解溫度與加酶量、提取時間與加酶量對紫菜藻紅蛋白純度的交互影響相對較弱。

圖3 提取條件對紫菜藻紅蛋白得率影響的響應面圖Fig.3 Response surface plots showing the effects of extraction conditions on the extraction rate of phycoerythrin

圖4 提取條 件對藻紅蛋白純度影響的響應面圖Fig.4 Response surface plots showing the effects of extraction conditions on the purity of phycoerythrin

2.3.4 提取參數(shù)優(yōu)化及模型驗證

運用Design-Expert V6.0軟件，求出被檢變量的最優(yōu)值。即最優(yōu)提取工藝為pH 6.79、酶解溫度38.76 ℃、提取時間7.24 h、加酶量0.04 g。在此條件下，酶法提取紫菜藻紅蛋白得率為2.273%，純度為1.668?？紤]到操作的可行性，最優(yōu)提取參數(shù)調整為pH 6.8、酶解溫度39 ℃、提取時間7.2 h、加酶量0.04 g。將這些參數(shù)代入擬合方程，計算得出紫菜藻紅蛋白得率為2.264%，純度為1.677。在此條件下通過復合酶法提取紫菜藻紅蛋白，3 次平行實驗得出紫菜藻紅蛋白實際得率為（2.257±0.019）%，實際純度為1.656±0.024，與理論值非常接近。因此，該多元二次回歸方程能夠準確的且適合于對復合酶法提取紫菜藻紅蛋白得率和純度的預測。

3 結 論

根據(jù)實驗分析，確定提取紫菜藻紅蛋白所用復合酶配比為纖維素酶和果膠酶質量比7∶3，在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken響應面試驗設計得到了紫菜藻紅蛋白復合酶法提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為pH 6.79、酶解溫度38.76 ℃、提取時間7.24 h和在5 g樣品中加酶0.04 g?？紤]到實際操作可行性，最終確定紫菜藻紅蛋白復合酶法提取的最優(yōu)工藝為pH 6.8、酶解溫度39 ℃、提取時間7.2 h和在5 g樣品中加酶0.04 g。在此條件下，驗證實驗得紫菜藻紅蛋白得率為2.257%，純度為1.656。通過驗證實驗所得實際值與模型預測值接近，證明應用響應面法優(yōu)化復合酶法輔助提取藻紅蛋白是準確可行的，并為藻紅蛋白的進一步研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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Optimization of Phycoerythrin Extraction from Lavers by Mixed Enzymes Using Response Surface Methodology

SHI Ying1′PEI Fei2′ZHOU Lingyu1′YANG Fangmei3′HU Qiuhui3′*
(1. College of Science Nanjing Agricultural Un iversity Nanjing 210095′China; 2. College of Food Science and Engineering Nanjing University of Finance and Economics Nanjing 210023′China; 3. College of Food Science an d Technology Nanjing Agricultural University Nanjing 210095′China)

In order to obtain the optimal enzymatic extraction conditions for phycoerythrin from laver with both cellulase and pectinase, the mixing ratio between the two enzymes was selected, and response surface methodology was used to explore the effects of extraction temperature, extraction time, total enzyme amount, and pH as w ell as their interactions on the yield and purity of phycoerythrin. The optim al extraction conditions were determined as follows: a cellulase to pectinase ratio of 7:3 (m/m); pH 6.8, 39 ℃, 7.2 h, and a total enzyme amount of 0.04 g. Under these conditions, the extraction rate of phycoerythrin was 2.257%, and the purity of phycoerythrin was 1.656. The predicted parameters obtained from this work were accurate, and could be applied to extraction and production of phycoerythrin from lavers.

laver; phycoerythrin; extraction; mixed enzymes; response surface methodology

TS210.4

A

1002-6630（2015）06-0051-07

10.7506/spkx1002-6630-201506010

2014-09-23

江蘇省科技支撐計劃項目（BE2009368-2）

施瑛（1971—），女，博士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與化學。E-mail：shiying@njau.edu.cn

*通信作者：胡秋輝（1962—），男，教授，博士，研究方向為食品科學與工程。E-mail：qiuhuihu@njau.edu.cn