響應(yīng)面分析法優(yōu)化馬蘭總黃酮提取工藝研究

響應(yīng)面分析法優(yōu)化馬蘭總黃酮提取工藝研究

王諍，王國(guó)凱，劉勁松，蔡百祥，高衛(wèi)娜，王剛

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230012)

[摘要]目的應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化馬蘭總黃酮的提取工藝。方法以單因素研究為基礎(chǔ)，以總黃酮提取量為響應(yīng)值，以4因素3水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化馬蘭總黃酮的提取工藝。結(jié)果馬蘭總黃酮的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇濃度為40%，液料比為16.5∶1，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)3次，在該條件下，馬蘭總黃酮提取量預(yù)測(cè)值為162.538 mg，實(shí)際驗(yàn)證值為156.867 mg，并得出各因素對(duì)馬蘭總黃酮提取量的影響大小依次為乙醇濃度、液料比、提取次數(shù)、提取時(shí)間。結(jié)論響應(yīng)面分析法可用于優(yōu)化馬蘭總黃酮的提取工藝，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證值與模型預(yù)測(cè)值基本相符。

[關(guān)鍵詞]馬蘭；總黃酮；提取工藝；響應(yīng)面分析法

[中圖分類號(hào)]R284.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.05.026

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)

作者簡(jiǎn)介：王諍(1991-)，男，碩士研究生

收稿日期：(2015-01-27；編輯：姚實(shí)林)

馬蘭，別名魚鰍串、田邊菊，菊科，多年生草本。馬蘭載于《本草拾遺》，全草藥用，有清熱解毒、消食積、利小便、散瘀止血之效[1]。全國(guó)各地均有分布，具有極其豐富的野生資源。民間常作為保肝明目的保健食品大量食用[2]。

近年來對(duì)馬蘭總黃酮的研究較多，優(yōu)化總黃酮最佳提取工藝不僅能更有效地利用資源，也為進(jìn)一步深入研究馬蘭提供依據(jù)。響應(yīng)面分析法能夠以最小的成本對(duì)多變量系統(tǒng)進(jìn)行極其有效的優(yōu)化，并能準(zhǔn)確分析各因素對(duì)響應(yīng)值的影響以及各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。通過傳統(tǒng)正交方法只能得出最佳的因素水平組合，不能得出整體區(qū)域中各因素的最優(yōu)組合和最優(yōu)響應(yīng)值，而響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法通過更多的水平實(shí)驗(yàn)方案，擬合二階以上的模型，以找到設(shè)計(jì)的最優(yōu)點(diǎn)[3-4]。

通信作者：王國(guó)凱，wanggk7779@163.com

本研究以馬蘭總黃酮提取含量為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化馬蘭總黃酮的提取條件，從而得出最優(yōu)的馬蘭總黃酮提取工藝，以期為今后的馬蘭相關(guān)研究提供參考。

1　儀器與材料

馬蘭：購(gòu)自安徽省亳州市藥材市場(chǎng)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本中心黃和平副教授鑒定為菊科植物馬蘭Kalimerisindica(L.) Sch-Bip的干燥全草；蘆丁對(duì)照品：購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；實(shí)驗(yàn)過程中所用化學(xué)試劑：純度均為分析純。UV759CRT紫外分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；十萬分之一電子天平：賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

Determination of Content of 6-Gingerol in Kean Cream by High-Performance Liquid Chromatography

ZHENGZhi-yun1,GUIShuang-ying1,LONGZi-jiang1,ZHOUXu-tian2

(1.AnhuiUniversityofChineseMedicine&AnhuiEngineeringResearchCenterforChineseMedicinePreparation&InstituteofPharmaceutics,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.AnqingAnticancer&AnalgesiaResearchInstitute,AnhuiAnqing246001,China)

Abstract[] ObjectiveTo establish a method for determination of the content of 6-gingerol in Kean Cream by high-performance liquid chromatography (HPLC). MethodsThe C18 chromatographic column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was used with a mobile phase of methanol-water (70∶30). The detection wavelength was 280 nm; the flow rate was 1.0 mL/min; the column temperature was 30 ℃; the sample size was 20 μL. ResultsA good linear relationship was achieved when the concentration of 6-gingerol ranged between 1.02 and 20.4 μg/mL (r=0.999 9). The average recovery rate was 98.83%, and the relative standard deviation was 1.08% (n=6).ConclusionThe HPLC-based method is simple, precise, and reliable for determination of content of 6-gingerol in Kean Cream.

[Key words]high-performance liquid chromatography; 6-Gingerol; Kean Cream; content determination

2　方法與結(jié)果

2.1線性關(guān)系考察準(zhǔn)確稱取干燥后的蘆丁對(duì)照品8.6 mg，以濃度為75%的乙醇于25 mL容量瓶中定容至刻度，充分溶解后搖勻，得對(duì)照品溶液(0.344 mg/mL)。分別量取0.25、0.5、0.75、1.00、1.25 mL置于5個(gè)5 mL容量瓶中，再分別加入0.2 mL濃度為5%的NaNO2溶液，搖勻，靜置5 min后，再加入0.2 mL濃度為10%的Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min后，加入2 mL濃度為4%的NaOH溶液，然后，以75%的乙醇定容，搖勻后靜置15 min，以樣品空白溶劑為參比液，在波長(zhǎng)506 nm處測(cè)得其吸光度[5-6]。繪制以所測(cè)得的吸光度值為縱坐標(biāo)，以稀釋后對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到以濃度為自變量、吸光度為因變量的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.112 5x+0.008 1，r=0.999 5。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液濃度在8.72～52.32 μg/mL時(shí)與吸光度有較好的線性關(guān)系。

2.2馬蘭總黃酮的提取工藝取干燥藥材粉末50 g，用乙醇回流提取，濾過，合并濾液，減壓濃縮，干燥，得干浸膏，取樣定容，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)得吸光度。

2.3單因素試驗(yàn)根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，通過控制變量的方法分別考察乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素對(duì)馬蘭中總黃酮提取量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。由結(jié)果可知，綜合考慮，4個(gè)因素的最優(yōu)值分別確定為：乙醇濃度為50%，液料比為15∶1，提取3次，每次提取1.5 h。

圖1 乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)對(duì)馬蘭總黃酮提取含量(50 g馬蘭中提取量)的影響

參考文獻(xiàn)2.4Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)以單因素試驗(yàn)及相關(guān)為依據(jù)來設(shè)定Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中各因素的水平，以馬蘭總黃酮提取量為響應(yīng)值，對(duì)影響馬蘭總黃酮提取量的乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平見表1。使用Design Expert 8.05b對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平表

2.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理及單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，選擇“2.4”項(xiàng)4個(gè)影響因素，并以單因素試驗(yàn)結(jié)果為中心水平，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定最佳提取條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

使用Design Expert 8.05b 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到總黃酮提取量對(duì)A、B、C、D四因素的二次多項(xiàng)回歸方程：總黃酮提取量=145.74-10.15A-8.43B-1.95C+ 4.41D-9.39AB-16.73AC+9.33AD-1.16BC+2.33BD+8.21CD-3.35A2-0.82B2-5.37C2-5.57D2。

對(duì)上述模型進(jìn)行方差分析(見表3)發(fā)現(xiàn)，一次項(xiàng)中乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取次數(shù)(D)，二次項(xiàng)中提取時(shí)間(C2)、提取次數(shù)(D2)，交互項(xiàng)中乙醇濃度和提取時(shí)間(AC)、乙醇濃度和提取次數(shù)(AD)、提取時(shí)間和提取次數(shù)(CD)對(duì)總黃酮提取量的影響均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明各因素對(duì)總黃酮提取量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。回歸方程的顯著性檢測(cè)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)，回歸方程的失擬(lack of fit)檢驗(yàn)結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.696 1)；回歸方程的擬合優(yōu)度很高(R2=0.948 5，校正R2=0.897，CV=3.11%)，說明上述方程能較好地反映A、B、C、D四個(gè)因素與馬蘭總黃酮提取量的關(guān)系。

圖2顯示，總黃酮提取量隨著提取時(shí)間和提取次數(shù)的增加呈不斷上升趨勢(shì)，由其等高線圖可看出，等高線在提取時(shí)間軸方向分布較為密集，說明提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響較提取次數(shù)的影響大，另外，等高線呈現(xiàn)出較規(guī)則的橢圓形，說明C、D因素之間存在較為顯著的交互效應(yīng)[7]。由圖3可知，黃酮含量隨液料比和提取次數(shù)的增大而不斷增大，由等高線圖可知，液料比對(duì)總黃酮提取量的影響比提取次數(shù)大。同理，由圖4、圖5、圖6、圖7可得出，液料比對(duì)總黃酮提取量的影響大于提取時(shí)間的影響，乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響大于提取次數(shù)，乙醇濃度和提取時(shí)間二者對(duì)總黃酮提取量的交互作用很強(qiáng)，且乙醇濃度的影響大于提取時(shí)間，乙醇濃度與液料比之間也有較好的交互作用。因此，可以得出各因素對(duì)總黃酮提取量的影響程度依次為：A>B>D>C。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3　回歸模型方差分析

使用Design Expert 8.05b對(duì)回歸方程進(jìn)行求解，得出預(yù)測(cè)最優(yōu)提取工藝為：乙醇濃度為40%，液料比為16.46∶1，提取時(shí)間2.00 h，提取次數(shù)為3.39，總黃酮含量的預(yù)測(cè)值為162.538 mg(50 g生藥)。綜合考慮將工藝調(diào)整為：乙醇濃度為40%，液料比為16.5∶1，提取2 h，提取3次。

按照上述所得工藝，平行提取3份，測(cè)定實(shí)際平均總黃酮提取量為156.86 mg(50 g生藥)，與預(yù)測(cè)值之間偏差較小，表明此回歸模型能與實(shí)際情況較好擬合，從而也更加證明此模型的可行性。

4　討論

響應(yīng)面分析法是一種更為合理有效的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它通過利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過試驗(yàn)得到數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因子和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，指導(dǎo)多變量?jī)?yōu)化問題[8]。以最經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的方式優(yōu)化得出最優(yōu)工藝，與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法不同，它不僅能夠克服正交設(shè)計(jì)無法從整體區(qū)域找出因素的最優(yōu)組合和響應(yīng)值的缺陷，還能夠得出精度較高的回歸方程，并且具有能夠分析各因素間交互效應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。

本研究以單因素研究為基礎(chǔ)，以響應(yīng)面分析法對(duì)馬蘭總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出了最優(yōu)的工藝條件，并且驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值相近，可見實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析都比較準(zhǔn)確可靠，綜上所述，響應(yīng)面分析法是優(yōu)化馬蘭總黃酮提取工藝的有效方法。

圖2　提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)馬蘭總黃酮提取量影響的效應(yīng)面圖和等高線圖

圖3　液料比和提取次數(shù)對(duì)馬蘭總黃酮提取量影響的效應(yīng)面圖和等高線圖

圖4　液料比和提取時(shí)間對(duì)馬蘭總黃酮提取量影響的效應(yīng)面圖和等高線圖

圖5　乙醇濃度和提取次數(shù)對(duì)馬蘭總黃酮提取量影響的效應(yīng)面圖和等高線圖

圖6　乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)馬蘭總黃酮提取量影響的效應(yīng)面圖和等高線圖

圖7乙醇濃度和液料比對(duì)馬蘭總黃酮提取量影響的效應(yīng)面圖和等高線圖

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Optimization of Extraction Technique for Total Flavonoids inKalimerisindica(L.) Sch-Bip by Response Surface Analysis

WANGZheng,WANGGuo-kai,LIUJin-song,CAIBai-xiang,GAOWei-na,WANGGang

(SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine&AnhuiKeyLaboratoryofModernChineseMateriaMedica,AnhuiHefei230012,China)

Abstract[] ObjectiveTo optimize the extraction technique for total flavonoids in Kalimeris indica (L.) Sch-Bip by response surface analysis. MethodsBased on the single-factor experiment and with the yield of total flavonoids as the response, a four-factor, three-level response surface analysis was used to optimize the extraction technique for total flavonoids in Kalimeris indica (L.) Sch-Bip. ResultsThe results indicated that in the optimal extraction technique, raw material was treated with 40% ethanol (16.5 times) three times (2 h each time). In this condition, the predicted and experimental yields of total flavonoids in Kalimeris indica (L.) Sch-Bip were 162.538 mg and 156.867 mg, respectively. The most important influencing factor for the yield of total flavonoids was ethanol concentration, followed by solid-liquid ratio, extraction times, and extraction duration. ConclusionResponse surface analysis can be used to optimize the extraction technique for total flavonoids in Kalimeris indica (L.) Sch-Bip. The experimental value almost accords with the predicted value.

[Key words]Kalimerisindica(L.) Sch-Bip; total flavonoids; extraction technique; response surface analysis