賈國賓 ， 李卓偉 ， 楊國輝 *， 魏麗娟 ， 張 沛 ， 王德功 ， 劉 冬

（1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，河北石家莊 050041；2.河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050041）

淀粉酶是能夠催化淀粉使其水解為葡萄糖、麥芽糖、低聚糖類的一類酶的總稱。目前工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用所需的淀粉酶以微生物為主要來源，尤其是以芽孢桿菌所產(chǎn)的淀粉酶較多 （謝鳳行等，2009；張雙民，2006）。產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌具有易貯存、耐高溫高壓、抗逆性強(qiáng)等獨(dú)特的生物學(xué)特性 （辛娜等，2011）。本試驗(yàn)以雞、豬、牛的小腸黏膜為菌源進(jìn)行耐膽鹽產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選，并對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以為工業(yè)生產(chǎn)淀粉酶提供菌株。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌源 健康青年雞、豬、?？漳c黏膜。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 NB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，pH值7.2～7.4。

0.3%膽酸鹽NB瓊脂培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基+瓊脂2%+0.3%膽酸鹽，pH值7.0。

NA培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基+瓊脂1.5%～2%，pH值7.2～7.4。

淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉0.2%，蛋白胨1%，牛肉膏 0.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，Na2HPO45%，瓊脂1.5% ～2%，NaCl 5%，pH值7.0～7.2。

淀粉酶基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g，牛肉浸粉 20.0 g，Na2HPO45.0 g，NaCl 0.1 g，水 1000 mL，pH值7.0～7.4。

生理生化鑒定所用培養(yǎng)基參照 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）。

NaCl、NaOH、HCl、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaC12、ZnCl2、Cu-Cl2、FeCl2、MnCl2均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 膽酸鹽耐受性菌株的分離 無菌條件下剪下屠宰后青年雞、豬、?？漳c各一小段，分別擠出腸道內(nèi)容物后縱向剖開，刮取空腸黏膜黏液，涂抹在無菌載玻片上并盛于無菌燒杯內(nèi)，37℃風(fēng)干48 h。

烘干后將載玻片上樣品放入無菌三角瓶中，并加入無菌生理鹽水，利用漩渦振蕩器充分振搖，80℃水浴加熱15 min后，進(jìn)行梯度稀釋。

取1.0 mL樣品進(jìn)行梯度稀釋，分別取適宜稀釋度的樣品液0.1 mL加入到凝固的0.3%膽酸鹽LB瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)，涂布器均勻涂布后，于37℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h，從中挑取出具有不同菌落形態(tài)的單菌落轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基試管斜面上，培養(yǎng)48 h后，4℃保存，備用。

2.2 產(chǎn)酶菌株的初篩 將得到的已保存菌株點(diǎn)種于淀粉培養(yǎng)基平板上，37℃進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后從平皿中選取生長的菌落轉(zhuǎn)接至NA培養(yǎng)基試管斜面，并點(diǎn)種在淀粉培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，時(shí)間為48 h。

在培養(yǎng)后的淀粉平板上滴加盧戈氏碘液。記錄水解圈直徑與菌落直徑比值 （H/C值），H/C值較大的菌株即為所需菌株。

2.3 產(chǎn)酶菌株的復(fù)篩 將以上所得初篩各菌株接種于裝有50 mL NB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，培養(yǎng)溫度37℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)16 h，制成種子液。

將種子液按體積分?jǐn)?shù)6%的接種量接種于裝有50 mL淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中37℃培養(yǎng)36 h，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min。將發(fā)酵液在4℃條件下以10000 r/min離心10 min，取上清液制粗酶液。

采用Yoo等（1987）改良法計(jì)算酶活力，以在55℃，5 min內(nèi)水解1 mg（0.5%）淀粉定義為一個(gè)酶活力單位。以此為復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn)，從中選取產(chǎn)酶活性較高的菌株3～4株。

2.4 產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化 改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無機(jī)鹽、緩沖對等成分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌15 min，250 mL三角瓶裝量50 mL，以6%的接種量接種發(fā)酵15 h種子液，37℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)36 h。并在以測定粗酶液酶活性為主要參考指標(biāo)的同時(shí)測定發(fā)酵液吸光度值即菌液OD值進(jìn)行含菌量測定，以確定菌株的最佳碳、氮源，無機(jī)鹽及緩沖液的成分，并通過正交試驗(yàn)確定各成分最佳百分比。

3 結(jié)果與分析

3.1 芽孢桿菌的分離 在含0.3%膽酸鹽LA平板上通過對腸道壁刮取物的培養(yǎng)，共分離出205株耐膽酸鹽的芽孢桿菌。其中在淀粉平板上出現(xiàn)水解圈的有56株菌，挑選產(chǎn)淀粉酶活力較高的YZ-ZH03、YZ-ZK22、YZ-JH41、YZ-JH43 和 YZNH65五株芽孢桿菌測定搖瓶條件產(chǎn)酶能力，進(jìn)行復(fù)篩。

3.2 淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選 由表1可以看出，在淀粉平板上的點(diǎn)種的5株菌中YZ-ZH03的Hc值高于其他4株菌，而經(jīng)過粗酶液的酶活力測定，該菌株的酶活力均高于其他菌株，為最優(yōu)菌株，即選擇YZ-ZH03菌株作為進(jìn)一步研究的對象。

表1 產(chǎn)淀粉酶菌株在淀粉平板的水解淀粉特性和發(fā)酵液淀粉酶活性

3.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

3.3.1 不同碳源對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度和酶活力的影響 分別以等量淀粉、玉米粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、糊精、麩皮替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的牛肉浸粉，在其他成分不變的情況下，按裝液量50mL/250mL三角瓶，接種量為2%，37℃、180r/min搖瓶發(fā)酵24 h后測定發(fā)酵液菌體濃度并計(jì)算酶活力大小（圖1）。

圖1 不同碳源對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度和酶活力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明YZ-ZH03菌株以葡萄糖作為碳源時(shí)發(fā)酵液酶活力大小為94.21 U/mL，與初始培養(yǎng)基發(fā)酵液酶活力相比提高了2.80%（P＜0.05），發(fā)酵液OD600值為0.587；糊精作為碳源時(shí)發(fā)酵液酶活力大小為92.52 U/mL，與初始培養(yǎng)基發(fā)酵酶活力相比提高了1.00%（P＜0.05），發(fā)酵液OD600值為0.572，而其他碳源的選擇對酶活力的影響不顯著，尤其個(gè)別碳源的代替降低了發(fā)酵液的酶活力。最終選擇葡萄糖為其最優(yōu)碳源。3.3.2 不同氮源對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 選用上述優(yōu)化后的最佳碳源，分別以等量大豆蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿、黃豆餅粉、酵母膏、尿素、硫酸銨作為氮源替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，在其他成分及培養(yǎng)條件不變的情況下測定發(fā)酵24 h后各指標(biāo)值，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同氮源對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，YZ-ZH03菌株以尿素為氮源時(shí)發(fā)酵液酶活力為96.60 U/mL，發(fā)酵液OD600值為0.604；黃豆餅粉作為氮源時(shí)發(fā)酵液酶活力大小為94.43 U/mL，發(fā)酵液OD600值為0.661，而其他氮源的選擇對酶活力的增加效果不明顯。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，尿素作為氮源酶活力提高了5.50%（P＜0.05），對發(fā)酵結(jié)果影響顯著，而其他氮源的替換使發(fā)酵效果降低。最終選擇尿素為最優(yōu)氮源。

3.3.3 不同無機(jī)鹽對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 選用上述優(yōu)化后的最佳碳源和氮源， 分別添加0.2%的 CaCO3、CuSO4、Zn-SO4、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O 替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中NaCl，在其他成分及培養(yǎng)條件不變的情況下測定發(fā)酵24 h后各指標(biāo)值，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同無機(jī)鹽對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明YZ-ZH03菌株以其他無機(jī)鹽進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵液酶活力均小于初始培養(yǎng)基中所使用的NaCl。最終選擇Nacl為最佳無機(jī)鹽成分。

3.3.4 不同配比緩沖液對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 選用K2HPO4和KH2PO4緩沖對按 0、1∶0.1、0.2∶0.1、0.3∶0.1、0.4∶0.1的比例加入至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。測定發(fā)酵24 h后各指標(biāo)值，結(jié)果見圖4。

圖4 不同配比緩沖液對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，YZ-ZH03菌株以0.4∶0.1作為緩沖液配比的發(fā)酵液酶活力大小為101.27 U/mL，發(fā)酵液OD600值為0.632，而其他配比的選擇對酶活力的增加幾乎沒有影響。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，以0.4∶0.1作為緩沖液配比使酶活力提高了10.56%（P＜0.05），對發(fā)酵結(jié)果影響顯著。根據(jù)最終分析選擇緩沖對最佳配比為0.4∶0.1。

3.3.5 發(fā)酵時(shí)間對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 選用所選最佳發(fā)酵培養(yǎng)成分，按裝液量50 mL/250 mL三角瓶，接種量為2%，37℃、180 r/min培養(yǎng)，測定搖瓶發(fā)酵 18、24、30、36 h后發(fā)酵液菌體濃度及酶活力，結(jié)果見圖5。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，YZ-ZH03菌株在發(fā)酵過程中隨著時(shí)間的延長酶活力逐漸增大，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為30 h時(shí)酶活力達(dá)到最大值109.62 U/mL，發(fā)酵液OD值為0.782，自此發(fā)酵液酶活力不再增高，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為36 h時(shí)，出現(xiàn)酶活力降低現(xiàn)象，分析原因可能為部分酶活不穩(wěn)定所致。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，選擇發(fā)酵時(shí)間為30 h，酶活力提高了19.67%（P ＜ 0.05）。

3.3.6 發(fā)酵溫度對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 選用裝液量50 mL/250 mL三角瓶、接種量2%、180 r/min，測定搖瓶在36、37、38、39℃發(fā)酵30 h后發(fā)酵液菌體濃度及酶活力，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 發(fā)酵溫度對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，YZ-ZH03菌株在發(fā)酵過程中隨著溫度的變化其酶活力先增大后減小，當(dāng)發(fā)酵溫度為37℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值112.25 U/mL，發(fā)酵液OD值為0.751，隨著溫度的增加發(fā)酵液酶活力逐漸降低，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，選擇發(fā)酵溫度為37℃時(shí)發(fā)酵液酶活力提高了22.54%（P＜0.05），對發(fā)酵結(jié)果影響顯著。

3.3.7 不同裝液量對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 30 h測定裝液量分別為30、50、70、90 mL 的 250 mL 搖瓶發(fā)酵液各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果見圖7。

圖7 不同裝液量對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)裝液量為50 mL時(shí)，其酶活力最大，為113.16 U/mL，菌液OD值為0.751，為所有試驗(yàn)組效果最好。分析其原因?yàn)檫m宜的裝液量為菌株的生長提供了合適的需氧量促進(jìn)了菌株的生長。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，選擇裝液量為50 mL時(shí)，發(fā)酵酶活力提高了25.72%（P＜0.05）。

3.3.8 不同搖瓶轉(zhuǎn)速對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 30 h時(shí)測定不同轉(zhuǎn)速對酶活力大小及菌液濃度的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 不同搖瓶轉(zhuǎn)速對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

結(jié)果表明，YZ-ZH03菌株培養(yǎng)液在搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)酶活力最大為119.23 U/mL，OD600為0.782，為其培養(yǎng)最佳轉(zhuǎn)速。分析原因?yàn)檫m宜的轉(zhuǎn)速為菌株的生長提供了適宜的發(fā)酵液通氣量，增加了其溶氧量促進(jìn)了菌株的生長。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，選擇轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)酶活力提高了30.16%（P ＜ 0.05）。

3.4 正交試驗(yàn) 綜合以上各單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定 K2HPO4∶KH2PO4為 0.4∶0.1，選擇葡萄糖、尿素、氯化鈉、pH、接種量設(shè)計(jì) 5因素4水平的 L16（45）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

依據(jù)正交試驗(yàn)的直觀分析結(jié)果，極差值R接種量＞R尿素＞RNaCl＞RpH值＞R葡萄糖，可得接種量為主要影響因素。由表2可見，3號試驗(yàn)組合酶活力大小最高，為 121.69 U/mL，增長了 32.85%（P ＜ 0.05）。而由均值K得出的最佳組合為A1B3C2D2E3，在正交試驗(yàn)表中沒有該組合，通過驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)該組合發(fā)酵液的酶活力大小為122.43 U/mL，比未做優(yōu)化前酶活力提高了33.66%（P＜0.05）。

由表 3 可以看出，F(xiàn)葡萄糖＜F0.05（3.3），即葡萄糖含量對發(fā)酵結(jié)果影響不顯著；F尿素＞F0.05（3.3），即尿素含量對發(fā)酵結(jié)果影響顯著；FNaCl＜F0.05（3.3），即NaCl含量對發(fā)酵結(jié)果影響不顯著；FpH值＜F0.05（3.3），即發(fā)酵液pH值對發(fā)酵結(jié)果影響不顯著；F接種量＞F0.05（3.3），即接菌量對發(fā)酵結(jié)果影響顯著。綜合分析顯示對發(fā)酵酶活力影響最大的因素是接菌量。最終確定YZ-ZH03的最佳酶活力培養(yǎng)條件為：葡萄糖1.0%，玉米漿1.5%，NaCl 0.10%，K2HPO40.4%，KH2PO40.1%，初始 pH 6.0，接種量4%。

4 討論與結(jié)論

經(jīng)過產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的分離篩選，最終獲得一株產(chǎn)淀粉酶活力較強(qiáng)的芽孢桿菌，并對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，發(fā)酵液酶活力與發(fā)酵接種量和氮源的含量有顯著相關(guān)性，最終確定產(chǎn)酶發(fā)酵工藝為：葡萄糖1.0%，玉米漿1.5%，NaCl 0.10%，KH2PO40.4%，KH2PO40.1%，初始pH 6.0，接種量4%，250 mL搖瓶中裝液量50 mL，37℃、200 r/min培養(yǎng)30 h。在此條件下，菌株的產(chǎn)酶酶活力由初始的91.60 U/mL提升到122.43 U/mL，提高了33.66%。本試驗(yàn)菌株的獲得可以為工業(yè)化生產(chǎn)淀粉酶以及微生態(tài)飼料添加劑菌株的選擇提供一定的參考價(jià)值。

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