索江華， 楊 森， 喬宏興

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程系，河南鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南鄭州 450046）

屎腸球菌是乳酸菌類益生菌的一種，能調(diào)整單胃動物腸道菌群，抑制腸道內(nèi)致病菌的過度繁殖。其作為微生態(tài)制劑可單獨使用或與其他益生菌復配，用于調(diào)節(jié)動物腸道菌群，提高免疫力及改善生長性能（容庭等，2008；文靜等，2001）。

乳酸菌凍干發(fā)酵劑是將乳酸菌和凍干保護劑一起進行真空冷凍干燥得到的具有體積小、含菌量高、活力強、用量少、污染低、便丁運輸、保藏，使用方便等優(yōu)點的制劑。為了提高微生物真空冷凍干燥后細胞的成活率及穩(wěn)定性，常在冷凍時加入各種保護劑，保護劑包括蛋白質(zhì)類、多糖類、小分子糖類、醇類和維生素類，其中被廣泛認可的保護劑主要成分包括脫脂乳、蔗糖、海藻糖等。保護劑具有兩個作用，一是作為支持物和受體在復水過程中為干物質(zhì)提供一定的骨架結(jié)構(gòu)；二是冷凍干燥過程中保護活細胞。凍干保護劑可以有效地減少環(huán)境對菌體細胞的傷害，所以對其冷凍干燥保護劑的篩選和研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 屎腸球菌 （Enterococcus Faecium），購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，菌種編號CICC 21067。

1.1.2 試劑與儀器 甘油，購自上海國藥集團，分析純；脫脂奶粉（完達山）；蔗糖，購自上海國藥集團，分析純；無菌水，自制。培養(yǎng)箱、pH計、離心機、光學顯微鏡、超凈工作臺、-80℃冰箱 （DW-86L388A）、真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器 FD-1B-50）。

1.1.3 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏 10 g，酵母膏 5 g，葡萄糖 20 g，吐溫- 801 mL，乙酸鈉 5 g，檸檬酸銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，無水磷酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化和擴培 取屎腸球菌凍存管1支，在MRS平板上劃線，37℃培養(yǎng)36～48 h，挑取單菌落接種于5 mL液體MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h后，菌種以5%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)18～22 h，鏡檢無雜菌后，等量分裝9 mL于無菌離心管中，4000 r/min離心15 min，棄上清液收集菌體。革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細菌。

1.2.2 單因素試驗及正交試驗設(shè)計 將滅菌后的甘油、脫脂乳、蔗糖分別按照表1的配比組合溶于100 mL蒸餾水中備用。

表1 單因素試驗設(shè)計配比組合試驗表%

基于單因素試驗結(jié)果，選取甘油、脫脂乳、蔗糖水平分別為：甘油1%、1.5%、2%，脫脂乳8%、10%、12%，蔗糖 3%、4%、5%，進行三因素三水平正交試驗，因素與水平見表2。

表2 正交試驗因素與水平

1.2.3 預(yù)凍及真空冷凍干燥 將離心所得菌泥樣品用滅菌后的保護劑溶液2 mL沖洗到無菌培養(yǎng)皿中，放在-80℃條件下預(yù)凍2 h，待樣品完全凍結(jié)后迅速轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機中，根據(jù)真空冷凍干燥機說明書和樣品量冷凍干燥24 h，即可收獲成品。

1.2.4 活菌計數(shù)及存活率計算 平板混菌計數(shù)法：樣品溶解于無菌水中混勻，以10倍梯度進行稀釋，取適合的稀釋度0.1 mL涂布在MRS培養(yǎng)基上，每個梯度涂布三個樣本，37℃培養(yǎng)48 h后，計數(shù)菌落數(shù)，以菌落平均數(shù)計為該樣品的單位活菌數(shù)。設(shè)冷凍干燥前菌泥活菌數(shù)為N1（cfu/mL）；冷凍干燥后菌粉活菌數(shù)N2（cfu/mL）。

細胞冷凍存活率/%=（N2/N1）×100。

2 結(jié)果與分析

屎腸球菌在MRS上生長48 h的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果表明：屎腸球菌在顯微鏡下形態(tài)均一，主要成二聯(lián)球狀，或多連球狀，革蘭氏染色呈陽性；在MRS培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)48 h之后，菌落光滑，呈乳白色突起，具有明顯的乳酸菌特征。

2.1 單因素試驗 單因素試驗最終確定取10-9梯度計數(shù)，三個樣本取平均值結(jié)果如下：A 30，B 41，C 36，D 194，E 145，F(xiàn) 132，G 300，H 39，I 174，J 459，K 98，L 35，M 178。 由此可知，單因素試驗中活菌數(shù)保留最高的組合是J：甘油1%、脫脂乳10%、蔗糖4%或 5%（圖1）。

圖1 單因素試驗數(shù)據(jù)分析

2.2 正交試驗 由表3可知，影響屎腸球菌凍干后存活率的因素主次順序為C蔗糖＞A甘油＞B脫脂乳，即蔗糖的效果最明顯極差可達到22.534，甘油次之，脫脂乳最小。通過優(yōu)化凍干保護劑的正交試驗結(jié)果，可以得到屎腸球菌的最佳凍干保護劑配方為：甘油1.5 mL/100 mL，脫脂乳12 g/100 mL、蔗糖5 g/100 mL。屎腸球菌在使用此保護劑的情況下凍干存活率可以達到93.2%。

表4結(jié)果表明，三個因素對菌體存活率影響均不顯著，究其原因可能是本試驗誤差略大且誤差自由度小，而且試驗因素間存在交互作用，會夸大試驗誤差，有可能掩蓋考察因素的顯著性。經(jīng)正交試驗得到的最佳組合為6號試驗組的凍干菌體存活率會更高。

表3 屎腸球菌保護劑的篩選

表4 正交試驗數(shù)據(jù)分析

3 討論與結(jié)論

3.1 乳酸菌細胞的凍干損傷 本研究中，乳酸菌活菌數(shù)減少的主要原因是冷凍和干燥過程引起的，許多研究者認為在快速降溫時產(chǎn)生細胞損傷的主要原因是細胞內(nèi)外冰晶生長產(chǎn)生的機械力量引起的溶質(zhì)損傷（Bumsoo和 John，2004）。溶質(zhì)損傷又稱“溶液損傷”，是由于水的凍結(jié)使細胞間隙內(nèi)的液體逐漸濃縮，從而使電解質(zhì)的濃度顯著增加。由于細胞內(nèi)外滲透壓的存在導致細胞脫水，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)對高濃度的電解質(zhì)極為敏感，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，進而喪失其功能，因此增加了細胞死亡的可能性。通常細胞膜中的磷脂的極性端在一定程度上是以水合形式存在的，而且每個磷脂的極性端與其他磷脂分子的極性端被水分子隔開。當磷脂干燥脫水時，極性端的密度增加，糖鏈間的范德華引力增強，平時處于液晶態(tài)的脂膜變成凝膠態(tài)，相的變化使復水時細胞膜的通透性增加，胞內(nèi)一些可溶性物質(zhì)發(fā)生滲漏，從而導致細胞死亡（陳聲明和呂琴，1996）。細胞代謝調(diào)節(jié)作用損傷是當細胞內(nèi)某一關(guān)鍵酶失活，會造成細胞代謝受阻，積累了影響正常生理功能的某種產(chǎn)物，從而整個細胞代謝紊亂，導致細胞死亡。

3.2 保護劑的保護機理 甘油具有良好的滲透性，它能滲透到細胞內(nèi)部，以羥基和胞內(nèi)大分子形成氫鍵，部分取代由水分子形成的氫鍵，使生物體中的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪和其他大分子物質(zhì)在缺水條件下仍可保持其原有結(jié)構(gòu)，維持生物體活力。關(guān)于糖類保護作用機理主要有兩大學說：“水替代假說”和“玻璃態(tài)假說”，總之生物活性物質(zhì)保護劑要有較高的玻璃態(tài)溫度，或有一定的羥基來替代水，使蛋白質(zhì)保持較低的主相變溫度，即有效保持活性。但目前這兩種假說還不能完全解釋現(xiàn)有的試驗現(xiàn)象，所以其保護機理仍需深入研究。脫脂奶粉、可溶性淀粉等高分子保護劑溶于水，溶液可呈過冷狀態(tài)，即在冰點以下的相同溫度該溶液中的溶質(zhì)濃度較小，蛋白質(zhì)鹽析變性也較少。另外，它們能減少細胞暴露于氧氣和介質(zhì)中的面積，同時在菌體表面形成保護層，減少由于細胞壁損壞引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而起到保護作用。

不同的保護劑在凍干過程中發(fā)揮著不同的作用，一般認為，低分子化合物（如低聚糖、氨基酸等）在凍干過程中直接發(fā)揮作用，而高分子化合物（如蛋白質(zhì)、多糖等）則可促進低分子化合物的保護作用。根據(jù)有關(guān)文獻（孫盈等，2011；朱東升等，2010；陳衛(wèi)等，2008），確定甘油、脫脂乳、多糖三種保護劑的最佳配比分別在2%、10%、1%，而本試驗通過單因素試驗確定三種凍干保護劑最佳配比為甘油1%、脫脂乳10%、蔗糖5%。挑選部分有代表性的水平組合進行正交試驗，利用正交試驗最終得出屎腸球菌真空冷凍干燥保護劑的優(yōu)化組合為甘油2 mL/100 mL、脫脂乳12 g/100 mL、蔗糖3 g/100 mL，凍干后菌體存活率超過93.2%。

[1]陳聲明，呂琴．微生物冷凍干燥的抗性機理[J].微生物學通報，1996，23（4）：236～238.

[2]陳衛(wèi)，陸英，田豐偉，等.干酪乳桿菌LC-15凍干發(fā)酵劑制備條件研究[J].中國乳品工業(yè)，2008，36（7）：9～13.

[3]容庭，何前，陳莊，等.屎腸球菌及其在仔豬生產(chǎn)上的研究現(xiàn)狀[J].飼料工業(yè)，2008，29（22）：55～57.

[4]孫盈，黃金海，李瑩，等.耐熱型復合乳酸菌凍干保護劑的研究[J].中國乳品工業(yè)，2011，39（4）：12～15.

[5]文靜，孫建安，周緒霞，等.屎腸球菌對仔豬生長性能、免疫和抗氧化功能的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2011，23（1）：70～73.

[6]朱東升，馬鎏鎏，李青青，等.嗜酸乳桿菌冷凍干燥過程中保護劑的篩選及液氮預(yù)凍[J].食品科學，2010，31（1）：198～200。

[7]Bumsoo H，John C.Bischof.Direct cell injuryassociated with eutectic crystllization during freezing[J].Cryobiology，2004，48：8～21.