王茜，王昕，張杰，李倬林，李鐵柱

（1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，長(zhǎng)春130022；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長(zhǎng)春130124）

0 引言

干酪是我國(guó)乳制品工業(yè)新的增長(zhǎng)點(diǎn)，凝乳酶是干酪產(chǎn)業(yè)的核心原料，其品質(zhì)決定了干酪的品質(zhì)。世界干酪生產(chǎn)中所使用凝乳酶約30%為微生物來(lái)源的基因工程凝乳酶[1-2]。

我國(guó)干酪生產(chǎn)所使用的高品質(zhì)凝乳酶基本依賴進(jìn)口，國(guó)產(chǎn)凝乳酶主要從小牛皺胃中獲得，來(lái)源不穩(wěn)定且成本較高。開(kāi)發(fā)成本低、生產(chǎn)周期短的基因工程凝乳酶對(duì)于我國(guó)干酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[3-5]。然而，微生物來(lái)源的基因工程凝乳酶普遍具有水解專一性差和熱穩(wěn)定性過(guò)高的缺陷[6-8]。

本研究針對(duì)前期構(gòu)建的微小毛霉凝乳酶表達(dá)載體[9,10]，依托計(jì)算機(jī)輔助分子模擬技術(shù)確定了突變位點(diǎn)Thr218（第218位蘇氨酸）和Leu287（第287位亮氨酸）[11]，通過(guò)生物工程技術(shù)實(shí)施分子改造，旨在獲得更適于干酪加工的基因工程凝乳酶。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

巴斯德畢赤酵母GS115，大腸桿菌DH5α，重組微小毛霉凝乳酶質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

LLB培養(yǎng)基（胰蛋白胨1%，酵母浸提物0.5%，NaCl 0.5%，瓊脂粉1.5%）；YPD酵母培養(yǎng)基（酵母浸提物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂粉2%）。均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同。

1.1.2 試劑和儀器

PrimeSTAR HS DNA Polymerase，限制性內(nèi)切酶，DNA marker，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 凝乳酶基因定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)

微小毛霉凝乳酶基因定點(diǎn)突變方法采用PCR介導(dǎo)的一步法突變技術(shù)。根據(jù)PCR介導(dǎo)的一步法定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)原則，利用primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì) Thr218Ser（T218S）、Thr218Ala（T218A）、Leu287Gln（L287G）三對(duì)含預(yù)定突變的完全互補(bǔ)的寡核苷酸引物，送生工生物上海股份有限公司合成,如表1所示。

表1 定點(diǎn)突變所用引物

1.2.2 凝乳酶基因定點(diǎn)突變PCR反應(yīng)

以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的重組微小毛霉凝乳酶質(zhì)粒為模板，及PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真聚合酶，分別用3對(duì)引物對(duì)目的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。PCR反應(yīng)中各物質(zhì)及含量如表2所示。

表2 PCR反應(yīng)體系

表2中，PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，68 ℃退伙延伸5 min；18次循環(huán)；72 ℃后延伸8 min。

本研究通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定PCR反應(yīng)中的模板DNA的質(zhì)量濃度，以保證在PCR成功擴(kuò)增的同時(shí)，模板質(zhì)粒能被DpnI酶完全消化，提高突變效率。選擇的模板質(zhì)量濃度分別為20，30，40和50 μg/mL。PCR結(jié)束后取10 μL上樣進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 突變結(jié)果驗(yàn)證

采用寶生物公司的mix酶及微小毛霉凝乳酶基因通用引物α-Factor（TACTATTGCCAGCATTGCTGC）3`AOX1（GCAAATGGCATTCTGACATCC）進(jìn)行突變質(zhì)粒的擴(kuò)增，質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和NotI酶切后DNA電泳，完成PCR擴(kuò)增目的基因和雙酶切初步驗(yàn)證。

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s；共進(jìn)行31個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min。雙酶切及PCR鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒，送生工生物上海股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4 重組子的篩選

質(zhì)粒DNA的線性化有利于提高轉(zhuǎn)化效率和與酵母基因組DNA組整合效率。SacI酶切后可與酵母基因組DNA發(fā)生單交換可提高轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)。設(shè)定質(zhì)粒濃度梯度，來(lái)確保質(zhì)粒DNA完全線性化。之后采用乙醇沉淀法將線性化的質(zhì)粒濃縮后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，分別挑取平板上30個(gè)單克隆轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接入15 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min，培養(yǎng)30 h后，每隔24 h向培養(yǎng)基中加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%甲醇至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，連續(xù)誘導(dǎo)96 h。轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，離心1 min，取上清，得粗酶液。

篩選指標(biāo)分別為凝乳酶水解活力（P），凝乳活力與水解活力比值（C/P比值）及熱穩(wěn)定性，具體測(cè)定方法如下：

凝乳活性（C）的測(cè)定：采用改進(jìn)的MAGDA方法[12]；

水解活力（P）的測(cè)定：采用中華人民共和國(guó)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶活力測(cè)定法SB/T10317-1999；

熱穩(wěn)定性的篩選方法：將待測(cè)樣品分別放在45℃溫度下保溫120 min，每隔10 min取樣，冰浴冷卻，在35℃下測(cè)定微小毛霉凝乳酶的剩余凝乳酶活力；以相對(duì)凝乳活力（凝乳酶加熱后與加熱前活力比值）為縱坐標(biāo)，以加熱時(shí)間為橫坐標(biāo)，做改造前后凝乳酶熱穩(wěn)定性比較圖。

2 結(jié)果

2.1 凝乳酶基因定點(diǎn)突變PCR反應(yīng)

提取重組微小毛霉出發(fā)菌株質(zhì)粒作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。T218S，T218A，L287G的目的片段長(zhǎng)1283bp，載體約3.6 kb，目的基因加載體總長(zhǎng)度約4.9 kb，模板梯度稀釋，突變擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，T218A模板質(zhì)量濃度在20，30，40 μg/mL均擴(kuò)增出清晰、明亮條帶。T218S模板質(zhì)量濃度在30 μg/mL和40 μg/mL擴(kuò)增出條帶清晰PCR產(chǎn)物。L287G模板質(zhì)量濃度在40 μg/mL擴(kuò)增出條帶清晰明亮，無(wú)拖尾現(xiàn)象，與預(yù)期長(zhǎng)度1283 bp相同，即為實(shí)驗(yàn)所需。結(jié)果表明，在這四個(gè)模板濃度范圍內(nèi)，三個(gè)突變PCR反應(yīng)，均能得到所需PCR產(chǎn)物。隨著模板濃度的增加，PCR產(chǎn)物的亮度也有所增加，顯示產(chǎn)物的濃度也相繼增加，但是，根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，同時(shí)為了保證突變的成功率，分別選擇T218A模板質(zhì)量濃度為20 μg/mL，T218S的模板質(zhì)量濃度為30 μg/mL，L287G的模板質(zhì)量濃度為40 μg/mL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于DpnI酶切。

圖1 不同模板濃度進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR的擴(kuò)增結(jié)果

圖1中，M為D15000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為模板質(zhì)量濃度40 μg/mL，2為模板質(zhì)量濃度30 μg/mL，3為模板質(zhì)量濃度20 μg/mL，4為模板質(zhì)量濃度10 μg/mL。取上述PCR產(chǎn)物和同PCR產(chǎn)物中含有相同模板濃度DNA（對(duì)照）經(jīng)DpnI酶切作用，轉(zhuǎn)入大腸肝菌DH5α，涂于含有zeocin的抗性LLB固體選擇培養(yǎng)基，結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)組T218A，T218S，L287G均出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子，對(duì)照組選擇培養(yǎng)基上未出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子，證明DpnI酶對(duì)模板質(zhì)粒已消除干凈。

圖2 DpnⅠ消化模板質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌結(jié)果

2.2 突變結(jié)果驗(yàn)證

制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將PCR介導(dǎo)位點(diǎn)一步法突變得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，提取突變質(zhì)粒，經(jīng)PCR及雙酶切（NotI，EcoRI）進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖3和圖4所示。由圖3和圖4可以看出，擴(kuò)增片段1，2，3大小約為1.3 kb，與微小毛霉凝乳酶基因片段大小相一致。酶切結(jié)果同樣顯示，1，2，3得到兩條片段分別約為1.3 kb（目的片段）和3.6 kb（表達(dá)載體）。證明目的基因存在于擴(kuò)增后的pPICZα A載體中。

圖3 PCR驗(yàn)證結(jié)果

圖4 雙酶切驗(yàn)證結(jié)果

圖3中，M為D2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為T218A突變質(zhì)粒，2為T218S突變質(zhì)粒，3為L(zhǎng)287G突變質(zhì)粒。圖4中，M為D15000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～3同圖3。

將PCR、酶切鑒定后正確的質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司測(cè)序。利用DNAMAN分子生物學(xué)應(yīng)用軟件將測(cè)序結(jié)果與原始凝乳酶基因和Genebank上已登錄的凝乳酶序列進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，218位Thr（ACC）突變?yōu)锳la（GCT）和Ser（TCC），287位Leu（CTT）突變?yōu)镚ln（CAA），除突變位點(diǎn)氨基酸突變正確外，未發(fā)生額外突變，證明突變成功。

圖5 基因突變測(cè)序結(jié)果

2.3 重組子的篩選

質(zhì)粒梯度濃度線性化酶切后電泳結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，質(zhì)粒體積為6 μL和5 μL時(shí)，電泳結(jié)果顯示出現(xiàn)兩條條帶，證明質(zhì)粒DNA并沒(méi)有完全線性化。當(dāng)質(zhì)粒體積為4 μL和3 μL時(shí)，酶切后電泳成單一條帶，大小約為5.0 kb，質(zhì)粒酶切完全，成線性條帶，證明質(zhì)粒DNA已經(jīng)完全線性化。為了提高酵母轉(zhuǎn)化的效率，所以選擇質(zhì)粒DNA體積4 μL，作為SacI酶切作用體積。并將酶切后呈線性化的質(zhì)粒DNA，采用乙醇沉淀法濃縮法得到高濃度的線性化DNA，按照酵母電轉(zhuǎn)化方法將濃縮的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞中，涂于YPD（含zeocin）抗性平板，30℃靜止培養(yǎng)4 d，如圖7中結(jié)果表明轉(zhuǎn)化效率較高，獲得了較多的轉(zhuǎn)化子。圖6中，M為D15000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；3～6為質(zhì)粒體積分別為3，4，5，6 μL電轉(zhuǎn)化電泳結(jié)果。

圖6 不同濃度質(zhì)粒線性化結(jié)果

圖7 電擊轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.3.1 凝乳酶酶學(xué)性質(zhì)篩選

突變質(zhì)粒T218A，T218S，L287G轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，經(jīng)YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨機(jī)挑取30個(gè)轉(zhuǎn)化子，在YPD液體培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵96 h，測(cè)定粗酶液凝乳酶活力，蛋白水解活力，計(jì)算C/P比值，最終獲得上述參數(shù)優(yōu)良的轉(zhuǎn)化子各一株。結(jié)果如表3所示。

表3 突變菌株凝乳特性

由表3可以看出，T218A突變凝乳酶蛋白水解活性明顯降低最為顯著，但凝乳活性極低，不利于凝乳作用；T218S和L287G突變凝乳酶蛋白水解活性均有降低，同時(shí)二者的C/P比值均有提高，且T218S突變凝乳酶C/P比值提高幅度顯著高于L287G突變凝乳酶。

2.3.2 凝乳酶熱穩(wěn)定性篩選

本研究將初篩C/P比值較高的T218S和L287G兩個(gè)突變菌株凝乳酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性的復(fù)篩，結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出，T218S和L287G兩個(gè)位點(diǎn)的突變，均使突變凝乳酶熱穩(wěn)定性降低，均低于出發(fā)菌株。相對(duì)于L287G位突變凝乳酶，T218S位突變凝乳酶具有更低的熱穩(wěn)定性。L287G位突變凝乳酶45℃處理60 min后，相對(duì)凝乳活力降到76.4%，經(jīng)同樣熱處理，T218S位突變凝乳酶相對(duì)凝乳活力為62.0%。45℃熱處理20 min后，T218S突變凝乳酶隨著溫度處理時(shí)間的增長(zhǎng)，相對(duì)凝乳活力持續(xù)降低，60 min后，凝乳活力降低迅速，120 min達(dá)到約40%。由此可知，T218S突變菌株凝乳酶具有更低的熱穩(wěn)定性。

圖8 45℃熱處理改造前后微小毛霉凝乳酶的熱穩(wěn)定性

3 結(jié)論

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上了，設(shè)計(jì)了微小毛霉凝乳酶的分子改造方案，利用生物工程技術(shù)完成了改造工作。比較了改造前后凝乳酶的凝乳活力、蛋白水解活力及熱穩(wěn)定性，最終篩選到了突變體T218S一株，其凝乳活力、水解活力分別為52.35 U/mL和1.8 U/mL，C/P比值為29.03。相對(duì)于其他突變體及改造前微小毛霉凝乳酶，突變體T218S所產(chǎn)凝乳酶凝乳活性及C/P比值較高，熱穩(wěn)性較低，具有一定的應(yīng)用前景。

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