趙建國(guó)，李琴，陶大利，姜金斗

（農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心哈爾濱，150090）

0 引言

砷是一種廣泛分布于自然界的元素。各種不同的砷形態(tài)其物理、化學(xué)性質(zhì)、毒性亦各不相同。其中無(wú)機(jī)砷的毒性最大如As（Ⅲ）和As（Ⅴ）,有機(jī)砷的毒性較小如MMA和DMA,而AsB,AsC和砷糖等通常被認(rèn)為是無(wú)毒的[1]。因此,分析砷在食品的形態(tài)對(duì)評(píng)價(jià)對(duì)人體危害的風(fēng)險(xiǎn)分析具有重要意義。國(guó)家對(duì)液態(tài)乳總砷限量要求為0.1 mg/kg；乳粉為0.5 mg/kg[2]。

砷不同形態(tài)分析研究近年來(lái)報(bào)道較多，主要集中在水產(chǎn)品及環(huán)境樣品等[3-14,20-23]，而其他食品[15-16]特別是生乳及乳制品中不同砷形態(tài)含量的分析研究方面少有報(bào)道[1]。由于通用的原子熒光僅能對(duì)樣品中的無(wú)機(jī)砷或經(jīng)消化處理后的總砷進(jìn)行測(cè)定[17]。其他測(cè)定不同砷形態(tài)方法如微波萃取-原子熒光光譜法、離子色譜法也有報(bào)道[18-19]，但目前對(duì)測(cè)定不同砷形態(tài)仍以HPLC-ICP-MS方法最多。乳品類樣品基質(zhì)復(fù)雜，本研究重點(diǎn)集中在樣品前處理優(yōu)化方面：通過(guò)酶水解解決了對(duì)不同砷形態(tài)的吸附問(wèn)題，通過(guò)采用萃取小柱以脫去脂肪。從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳品中5種不同砷形態(tài)的準(zhǔn)確測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑

無(wú)水乙酸鈉，硝酸鉀，磷酸二氫鈉，氫氧化鈉，無(wú)水乙酸鈉，無(wú)水乙醇，檸檬酸鈉，冰乙酸，乙二胺四乙酸二鈉，堿性蛋白酶（20萬(wàn)單位），砷甜菜堿、一甲基砷、二甲基砷、砷酸根、亞砷酸根標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 儀器及材料

Waters 2695高效液相色譜，ICP-MS Elan6000電感耦合等離子體質(zhì)譜儀；固相萃取裝置；PEP-2SPE小柱，200mg/6mL；高速冷凍離心機(jī)。

1.3 樣品處理

1.3.1 酶解析提取砷

稱取生乳樣品40 g（精確至0.1 mg）或乳粉樣品稱取8g（精確到0.1 mg）于錐形瓶中，乳粉用30 mL溫水溶解樣品。用濃度為0.5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH=9.5后分別加入0.2 g堿性蛋白酶（20萬(wàn)活力單位），放入60℃恒溫箱中水解30 min。取出后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%檸檬酸溶液4.0 mL，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中定容。4℃冰箱中靜止5 min，將部分樣液轉(zhuǎn)入離心管中，以8 000 r/min離心10 min，同時(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 固相萃取柱脫脂凈化

將PEP-2SPE小柱置于固相萃取裝置上，用5mL甲醇活化，用5mL去離子水過(guò)柱并排干，吸取2mL樣液過(guò)柱棄掉后，再吸取3mL樣液通過(guò)小柱,并接收于試管中，通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾后用于測(cè)定。

1.4 分析方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：陰離子保護(hù)柱IonPac AG 19（50 mm×4 mm,11 μm）；陰 離子分析柱IonPac AS 19（250 mm×4mm,7.5 μm）；柱溫 35 ℃ ；流速 1.0mL/min；進(jìn)樣量50μL；流動(dòng)相[10 mmol/L無(wú)水乙酸鈉+3mmol/L硝酸鉀+2.0 mmol/L磷酸二氫鈉+0.2 mmol/L乙二胺四乙酸鈉，用4.0%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=10.7]∶無(wú)水乙醇為99∶1。

1.4.2 ICP-MS條件

積分時(shí)間1 s；功率1 100 W；玻璃同心霧化器；載氣流量1.0L/min；輔助氣流量1.2 L/min；采集質(zhì)量數(shù)74.9216；靈敏度≥260 mg/L；進(jìn)樣管內(nèi)徑≤0.2 mm。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

分別用超純水將5種形態(tài)砷質(zhì)量濃度分別為10.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度為 0.0，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,等離子體色譜軟件計(jì)算各色譜峰的積分面積并自動(dòng)繪制校準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理的優(yōu)化

2.1.1 蛋白質(zhì)等吸附對(duì)不同砷形態(tài)測(cè)定結(jié)果的影響

由于生乳及乳粉中成分復(fù)雜，蛋白質(zhì)及脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，基質(zhì)干擾大。為能達(dá)到既能有效降低基質(zhì)干擾，又能準(zhǔn)確測(cè)定各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的目的，前處理技術(shù)尤為重要。由于乳蛋白具有較強(qiáng)的吸附性，對(duì)不同砷形態(tài)可能具有明顯的吸附作用，若不能從中解析出來(lái)就會(huì)造成測(cè)定結(jié)果偏低，達(dá)不到準(zhǔn)確測(cè)定的目的。為此通過(guò)加入堿性蛋白酶的方式將蛋白質(zhì)進(jìn)行降解后測(cè)定收到顯著的效果。

由于樣品中各組分質(zhì)量濃度甚微，為此采用加入標(biāo)準(zhǔn)樣品的方式以考察蛋白對(duì)待測(cè)物因吸附而造成的影響。其實(shí)驗(yàn)方法為將生乳在高壓滅菌鍋中滅菌后取出，冷至室溫后在超凈工作臺(tái)中分別稱取40 g樣品置于150 mL錐形瓶中，分四組，每組4個(gè)樣品。每組中3個(gè)樣品分別加入各含有0.250 μg砷不同形態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)樣品，1個(gè)樣品作為空白。先取其中兩組其中一組加入堿性蛋白酶、一組不加入堿性蛋白酶直接按1.3樣品處理方法進(jìn)行處理后測(cè)定其質(zhì)量濃度；另兩組密閉后在無(wú)菌狀態(tài)室溫下放置2周，按上法進(jìn)行處理后分別測(cè)定其質(zhì)量濃度，以考察各組分變化情況。通過(guò)測(cè)定，所有未加入標(biāo)準(zhǔn)品的樣品各組分均未檢出，在表1中就不再一一列出，結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，加入標(biāo)準(zhǔn)砷樣品后直接測(cè)定兩組處理，不同砷形態(tài)回收率測(cè)定結(jié)果加酶處理稍高于未酶處理，但無(wú)變化顯著差異。而加入標(biāo)準(zhǔn)砷樣品放置兩周后再測(cè)定則差異顯著，特別是AsⅢ未加酶回收率僅81.2%，加酶處理達(dá)99.2%，說(shuō)明乳蛋白對(duì)不同砷形態(tài)各組分都有一定的吸附。采用堿性蛋白酶將乳蛋白降解后可有效釋放出被吸附的砷。

表1 堿性蛋白酶處理前后不同砷形態(tài)測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.1.1 PEP固相萃取小柱處理后對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

由于生乳及乳粉中含有較高的脂肪，根據(jù)該色譜柱的特性，若大量的脂肪進(jìn)入陰離子分析柱，將會(huì)使脂肪吸附于色譜柱內(nèi)很難被洗脫，從而即影響色譜柱的分離，同時(shí)又可使色譜柱壽命大大縮短。另外若脂肪被導(dǎo)入等離子焰炬中會(huì)造成錐管等處積碳，從而使靈敏度降低，基質(zhì)干擾增大，為此必需先將樣品中脂肪去除。脂肪去除方式可采用有機(jī)溶劑如正己烷等去除，也可采用固相萃取小柱。本研究采用固相萃取小柱去除脂肪效果較好，且操作簡(jiǎn)便，同時(shí)避免了因大量使用有機(jī)溶劑而對(duì)人體產(chǎn)生的危害。

2.2 方法線性范圍與檢出限

按照1.4分析方法,分別對(duì)5種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，在系列濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（見圖1和表1）。采用生乳樣品按照1.3樣品處理方法處理后對(duì)各組分進(jìn)行了最低檢出限的測(cè)定，并以本底3倍噪音分別計(jì)算樣品最低檢出限，結(jié)果如表2。

圖1 5種不同砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表2可知，5種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好，相關(guān)系數(shù)（r）在0.9996～0.9999間；最低檢出限在0.5～1.6 μg/kg間。完全可以滿足國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)乳中總砷為0.1 mg/kg規(guī)定測(cè)定的要求。

2.3 方法的回收率和精密度

分別選取嬰兒配方奶粉與生乳添加五種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液后按1.3進(jìn)行樣品處理，測(cè)定回收率；分別稱取6份嬰兒配方奶粉與生乳樣品后再分別添加0.250 μg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，處理液分別進(jìn)樣測(cè)定精密度，未添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的兩樣品測(cè)定值均為小于檢出限。經(jīng)測(cè)定，兩樣品各組分不同添加量回收率平均值A(chǔ)sB，DMA，AsⅢ，MMA，AsV分別為99.4%，92.7%，101.1%，91.8%，92.0%，兩個(gè)樣品RSD平均值分別為4.54%，4.39%，5.58%，4.92%，4.68%。回收率與精密度測(cè)定結(jié)果如表3和表4所示。

表2 5種形態(tài)砷分線性回歸方程與最低檢出限

3 樣品分析

選取乳粉、生鮮奶各3種,按所建立的HPLC-ICP-MS的分析方法檢測(cè)5種形態(tài)砷含量,以驗(yàn)證實(shí)際應(yīng)用的可靠性。結(jié)果參見表5。圖2為奶粉樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液中5種形態(tài)砷的色譜圖。結(jié)果表明,所檢測(cè)樣品中只檢測(cè)出了AsⅢ和AsV，其含量極低，遠(yuǎn)低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn),故樣品中無(wú)機(jī)砷的指標(biāo)是安全的。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及奶粉樣品提取液色譜

4 結(jié)論

（1）本研究建立了生乳與乳制品中5中形態(tài)砷的液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜測(cè)定方法。該法具有樣品處理簡(jiǎn)單、測(cè)定周期短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

（2）通過(guò)對(duì)樣品前處理方法的優(yōu)化。通過(guò)在樣品中加入砷標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，放置2周后采用堿性蛋白酶水解前后的比較，發(fā)現(xiàn)水解乳蛋白后可將吸附態(tài)的砷解析。酶水解液再加入3%檸檬酸可進(jìn)一步去除雜質(zhì)，從而大大減小了基質(zhì)干擾。樣液再通過(guò)PEP固相萃取小柱處理則可有效去除樣液中的脂肪，使色譜柱的分離度顯著提高、色譜柱的壽命延長(zhǎng)。通過(guò)上述對(duì)樣品的處理，從而實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確測(cè)定乳品中5種形態(tài)砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，大大提高了檢測(cè)靈敏度；AsB，DMA，AsⅢ，MMA，AsV 最低檢出限分別達(dá)到 0.56，0.54，1.56，1.56，0.84 μg/kg，滿足了對(duì)痕量成分測(cè)定的要求。

（3）該方法砷質(zhì)量濃度在0～10 ng/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。5種形態(tài)砷其相關(guān)系數(shù)（r）全部在0.999以上。

（4）AsB，DMA，AsⅢ，MMA，AsV的加標(biāo)回收率平均值分別為99.4%，92.7%，101.1%，91.8%，92.0%；RSD平均值分別為4.54%，4.39%，5.58%，4.92%，4.68%。完全能滿足微量成分定量測(cè)定的要求。

表3 樣品中5種形態(tài)砷回收率測(cè)定結(jié)果

表4 樣品5種形態(tài)砷精密度測(cè)定結(jié)果

表5 生乳與乳粉中5種形態(tài)砷測(cè)定結(jié)果（n=3） μg·kg-1

（5）通過(guò)對(duì)生乳及乳粉樣品的測(cè)定，只檢出了AsⅢ和AsV，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)[2]要求。

[1]陳光,林立,陳玉紅.液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法聯(lián)用（HPLC-ICP-MS）測(cè)定乳制品的無(wú)機(jī)砷及其它砷形態(tài)[J].環(huán)境化學(xué),2009,28（4）.

[2]GB 2762-2012食品中污染物限量[S].

[3]劉景泰，王煒.HPLC－ICP/MS聯(lián)用技術(shù)在環(huán)境有機(jī)汞分析中的應(yīng)用[J].環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù),2013,25（3）：58-61.

[4]干寧,李榕生,李天華，等.高效液相色譜-氫化物發(fā)生-動(dòng)態(tài)反應(yīng)池-電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測(cè)廢水中4種砷形態(tài).冶金分析,2009,29（4）：14-19.

[5]龐艷華，朱鳴鶴，趙景紅，等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定海洋產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷.分析實(shí)驗(yàn)室,2011，30（9）：71-74

[6]呂超,劉麗萍,董慧茹,等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定水產(chǎn)類膳食中5種砷形態(tài)的方法研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2010,29（5）：465-468

[7]王旭,李娜,耿安靜,等.高效液相色譜一電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定海產(chǎn)品中5種形態(tài)砷[J].南方水產(chǎn),2013,9（2）：50-56.

[8]袁建,王亞平,許春雪,等.地下水中砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制[J].巖礦測(cè)試,2012,31（2）：331-337.

[9]陳靜,周黎明,曲剛蓮.HPLC聯(lián)用技術(shù)在環(huán)境砷形態(tài)分析上的應(yīng)用[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2003,26（2）：60-62.

[10]楊紅麗,王鐠,朱四喜,等.聯(lián)用技術(shù)在砷形態(tài)分析中的應(yīng)用進(jìn)展[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2007,26（1）：65-73.

[11]李衛(wèi)華,劉玉海.高效色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析海藻類海產(chǎn)品中砷的形態(tài)[J].分析試驗(yàn)室,2012（8）：74-78.

[12]何紅蓼，李冰，楊紅霞，等.環(huán)境樣品中痕量元素的化學(xué)形態(tài)分析Ⅰ.分析技術(shù)在化學(xué)形態(tài)分析中的應(yīng)用[J].巖礦測(cè)試,2005,24（1）：51-58.

[13]張華,王英鋒,施燕支,等.高效液相色譜及聯(lián)用技術(shù)在砷形態(tài)分析中的應(yīng)用[J].光譜學(xué)與光譜分析,2007,27（2）：386-390.

[14]嚴(yán)秀平,倪哲明.聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于元素形態(tài)分析的新進(jìn)展[J].光譜學(xué)與光譜分析,2003,23（5）：945-954.

[15]楊麗君，宋曉華，陳麗娟，等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定果樹中6種砷形態(tài)[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2011，30（7）：62-66

[16]侯艷霞，劉麗萍，潘浩，等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定嬰幼兒輔食中的無(wú)機(jī)砷.食品科學(xué)，2011，32（24）：281-284

[17]GB/T5009.11-2003食品中總砷和無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)方法[S].

[18]劉勇建,牟世芬.離子色譜在砷化物形態(tài)分析中的應(yīng)用[J].環(huán)境化學(xué),2003,22（4）：404-408.

[19]楊慧,戴守輝,毛雪飛,等.微波萃取-原子熒光光譜法測(cè)定稻米中砷化學(xué)形態(tài)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2012（1）：98-101,115.