鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-T細(xì)胞核因子信號通路在應(yīng)力誘導(dǎo)成肌細(xì)胞凋亡中的作用

丁弦 夏晨蕾 賀苗 孫文娜 王芳 姜文心張彩霞 王爽玉 張強(qiáng) 姚如永 袁曉

1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，青島 266075；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室，青島 266003

頜面部肌肉組織在錯 畸形的發(fā)生、發(fā)展、矯治和療效維持中發(fā)揮重要作用。臨床上，正畸醫(yī)生通過調(diào)控矯形力來牽張咀嚼肌，影響牙齒、頜骨及顳下頜關(guān)節(jié)的改建，進(jìn)而使軟硬組織發(fā)生適應(yīng)性變化，重建新的功能平衡，達(dá)到預(yù)防錯 畸形及調(diào)控生長的目的[1-2]。在此過程中，成肌細(xì)胞作為適應(yīng)性改建的主要體現(xiàn)者，明確其力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制對于闡明功能矯形時面頜部肌肉組織的適應(yīng)性改建機(jī)制有重要意義[3]。本課題前期研究已證實，周期性張應(yīng)力可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞凋亡，在凋亡過程中Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一，具有重要的作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）作為現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca2+/鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）調(diào)節(jié)的磷蛋白磷酸酶，其介導(dǎo)的信號通路與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，在細(xì)胞信號傳遞過程中直接受Ca2+的調(diào)節(jié)，通過其重要底物活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）去磷酸化和核內(nèi)轉(zhuǎn)位發(fā)揮功能調(diào)節(jié)作用。CaN-NFAT信號通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一條重要通路，本研究擬在周期性張應(yīng)力作用下明確CaN-NFAT信號通路在成肌細(xì)胞凋亡中的作用，進(jìn)一步探明應(yīng)力作用下成肌細(xì)胞適應(yīng)性改建的分子機(jī)制，為功能矯形提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

大鼠L6成肌細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。胎牛血清、胰蛋白酶（Hyclone公司，美國），Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒（北京嘉美諾斯生物科技有限公司），RT-PCR試劑盒、Trizol提取試劑盒（Takara公司，日本），半胱天冬氨酸蛋白酶9兔抗大鼠抗體（Abcam公司，英國），BioFlex彈性細(xì)胞培養(yǎng)板（Flexcell公司，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將成肌細(xì)胞按1×107·L-1的濃度接種于培養(yǎng)瓶中，加入含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、雙抗，配成最終濃度為100 UI·mL-1的高糖DMEM培養(yǎng)液，在CO2孵箱中37 ℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度下培養(yǎng)。48 h換液一次，并通過倒置相差顯微鏡觀察成肌細(xì)胞生長狀況及變化。待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底80%以上時進(jìn)行傳代。

1.3 成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)—力學(xué)刺激模型的構(gòu)建

選擇對數(shù)生長期傳至第3代左右的成肌細(xì)胞胰酶消化后，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，將接種密度調(diào)整到3×105·mL-1后接種至BioFlex培養(yǎng)板，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～2 d，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%以上時，用低血清濃度（含體積分?jǐn)?shù)為3%胎牛血清的DMEM）的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

將成肌細(xì)胞分為加力組和對照組，利用多通道應(yīng)力加載系統(tǒng)對加力組細(xì)胞分別施加1、2、6、12、24 h頻率為10 cycles·min-1、15%細(xì)胞形變的張應(yīng)力，每一循環(huán)包括3 s拉伸和3 s松弛；對照組放在同一培養(yǎng)箱內(nèi)不加力（即加力0 h）。應(yīng)力結(jié)束后，于倒置相差顯微鏡下觀察成肌細(xì)胞生長狀況以及形態(tài)變化。

1.4 Hoechst 33258染色法檢測成肌細(xì)胞凋亡

2組細(xì)胞加入固定液固定10 min，沖洗完后向培養(yǎng)板中加入Hoechst 33258染色液，染色5 min，于熒光顯微鏡（激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm）下觀察細(xì)胞凋亡情況。將CaN的特異性抑制劑環(huán)孢素（cyclosporin A，CsA）加入24 h（加抑制劑組）后，觀察細(xì)胞凋亡情況。每組重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測成肌細(xì)胞凋亡

2組細(xì)胞棄舊培養(yǎng)液，PBS洗兩遍，用不含EDTA的胰酶消化后收集細(xì)胞至離心管中，再按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記，在室溫下避光染色15 min后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。在加力24 h的成肌細(xì)胞中加入CsA（加抑制劑組）后，再次檢測細(xì)胞凋亡。每組重復(fù)3次。

1.6 實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測CaN和NFAT mRNA的表達(dá)情況

收集2組細(xì)胞，按照Gibco BRL公司的說明書提取細(xì)胞總RNA，分光光度計測量RNA的濃度和純度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將得到的反應(yīng)液加入到real-time PCR的反應(yīng)體系中，再對上海生工生物技術(shù)有限公司合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測CaN和NFAT mRNA的表達(dá)情況。2組細(xì)胞中加入CsA后，再次檢測CaN和NFAT mRNA的表達(dá)情況。各因子的引物見表1。

表1 real-time PCR各因子引物Tab 1 Primers of genes used in real-time PCR

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（western blot）檢測NFAT3的蛋白含量

收集2組細(xì)胞，使用裂解液提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，各組取等量蛋白上樣，電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后將一抗與一抗稀釋液按比例混勻后與PVDF膜4 ℃過夜，PBST沖洗3遍；再將配好的二抗稀釋液和膜在搖床上搖動孵育1 h，用PBST沖洗3遍。加顯影液后放入計算機(jī)顯影系統(tǒng)內(nèi)，將蛋白的表達(dá)量拍照，并保存記錄。2組細(xì)胞中加入CsA后，再重復(fù)上述步驟。對圖像進(jìn)行分析并計算灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和配對t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)力學(xué)刺激模型的構(gòu)建

倒置相差顯微鏡下觀察可見，對照組成肌細(xì)胞貼壁良好，但排列方向雜亂無章；加力組細(xì)胞貼壁良好且生長狀態(tài)佳，無明顯變性、脫落；隨著加力時間的延長，成肌細(xì)胞逐漸順應(yīng)力場方向排列，且呈時間依賴性（圖1）。成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)—力學(xué)刺激模型構(gòu)建成功。

圖1 各組成肌細(xì)胞的形態(tài) 倒置相差顯微鏡 × 400Fig 1 Myoblasts morphology of every group inverted phase contrast microscope × 400

2.2 Hoechst 33258染色檢測成肌細(xì)胞凋亡

對照組成肌細(xì)胞的胞核清晰且呈卵圓形，染色質(zhì)分布均勻，發(fā)出淡藍(lán)色熒光；加力組出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，胞核發(fā)生固縮，發(fā)出致密濃染的亮藍(lán)色熒光，個別顏色發(fā)白，隨加力時間的延長，凋亡現(xiàn)象越發(fā)明顯；加抑制劑組凋亡細(xì)胞明顯比加力24 h組減少，說明CsA能有效抑制細(xì)胞凋亡（圖2）。

圖2 各組成肌細(xì)胞的形態(tài) Hoechst 33258染色 × 400Fig 2 Myoblasts morphology of every group Hoechst 33258 staining × 400

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測成肌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞的凋亡率為（4.47±0.93）%，加力1、2、6、12、24 h組的細(xì)胞凋亡率分別為（5.83±0.26）%、（6.56±0.34）%、（6.93±0.52）%、（7.75±0.15）%、（8.17±0.28）%，加抑制劑組的細(xì)胞凋亡率為（2.17±0.13）%。統(tǒng)計分析表明，加力組與對照組之間的細(xì)胞凋亡率有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。隨加力時間的延長，細(xì)胞凋亡率及死細(xì)胞比率逐漸升高，24 h達(dá)到高峰。與單純加力24 h組相比，加抑制劑組的細(xì)胞凋亡率和死細(xì)胞比率均下降，而活細(xì)胞比率有所上升（圖3）。

圖3 各組成肌細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig 3 Flow cytometry analysis in myoblasts of every group

2.4 real-time PCR檢測CaN和NFAT的mRNA表達(dá)

real-time PCR檢測結(jié)果表明，隨著加力時間的延長，CaN亞基CnA、CnB及NFAT3的mRNA表達(dá)量逐漸升高，24 h達(dá)到峰值，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；而NFAT4的mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。在相同加力時間情況下，加入抑制劑后，CnA、NFAT3的mRNA表達(dá)比不加抑制劑減少，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），CnB的mRNA僅在加力24 h時比不加抑制劑減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），NFAT4的mRNA表達(dá)2組間無統(tǒng)計學(xué)差異（圖4）。

圖4 各組成肌細(xì)胞CaN和NFAT的mRNA表達(dá)變化的比較Fig 4 Comparison of expression of CaN and NFAT mRNA in myoblasts of every group

2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測NFAT3的蛋白含量

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果表明，隨著加力時間的延長，NFAT3蛋白含量逐漸升高，24 h達(dá)到峰值，在12、24 h時與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；加入抑制劑后，NFAT3的蛋白含量明顯受到抑制，與相同加力時間的對應(yīng)組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（圖5）。

圖5 各組成肌細(xì)胞NFAT3蛋白量的相對灰度值Fig 5 Relative gray value of NFAT3 protein in myoblasts of every group

3 討論

臨床上正畸醫(yī)生通過功能矯形治療對生長發(fā)育期兒童施加生物力來引起肌肉形態(tài)和功能的變化，但其具體的作用機(jī)制尚不明確。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與了面頜部肌肉組織的適應(yīng)性改建，在此過程中Ca2+起到了十分重要的作用[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的Ca2+處理器，可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+的攝取、存儲和釋放。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到某些刺激時，胞內(nèi)游離的Ca2+濃度會迅速升高，從而因Ca2+超載引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而發(fā)生核酸內(nèi)切酶的活化、DNA斷裂等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；反之，當(dāng)細(xì)胞外的Ca2+缺乏或者細(xì)胞內(nèi)的Ca2+螫合時，可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡。

CaN是一種保守蛋白，由一個相對分子質(zhì)量為61×103的催化亞基CnA和一個相對分子質(zhì)量為19×103的調(diào)節(jié)亞基CnB緊密結(jié)合而成，是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一的一種受Ca2+/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的磷蛋白磷酸酶[6]。CaN介導(dǎo)的信號通路與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。通過對心肌細(xì)胞、神經(jīng)元、癌細(xì)胞及淋巴細(xì)胞系的研究[7-10]發(fā)現(xiàn)，CaN被激活后具有促凋亡和抗凋亡的雙重作用。因此，在細(xì)胞類型、刺激種類或強(qiáng)度不同的情況下，CaN所產(chǎn)生的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)也可能不同。

NFAT是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種能夠快速誘導(dǎo)的核因子，可以調(diào)節(jié)大量基因的表達(dá)[11-14]。目前已知的NFAT家族有5個成員，其中NFAT1、NFAT2、NFAT4主要存在于免疫組織中，NFAT3主要存在于其他組織細(xì)胞（如心臟）中[15]。NFAT的活化可以調(diào)節(jié)許多細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而干預(yù)某些疾病的發(fā)生、發(fā)展。

本研究應(yīng)用Hoechst 33258染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測周期性張應(yīng)力下成肌細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)成肌細(xì)胞凋亡率隨應(yīng)力加載時間的延長而升高，說明周期性張應(yīng)力可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。real-time PCR及蛋白質(zhì)印跡法研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著加力時間的延長，CnA、CnB及NFAT3的mRNA表達(dá)量及NFAT3的蛋白含量逐漸升高，24 h達(dá)峰值（P＜0.05），而NFAT4的mRNA表達(dá)量無明顯變化，這一結(jié)果可能與NFAT4主要存在于免疫組織而在其他組織中較少表達(dá)有關(guān)。加入CaN特異性抑制劑CsA后，CnA、NFAT3的mRNA表達(dá)量及NFAT3的蛋白含量明顯受到抑制，與各自對應(yīng)對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異，CnB的mRNA僅在加力24 h組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而NFAT4的mRNA表達(dá)量無明顯變化，說明CsA可以抑制CaN催化亞基CnA的表達(dá)，但對CaN調(diào)節(jié)亞基CnB的表達(dá)僅在其濃度較高時有部分抑制作用。由此可以看出，CaN與NFAT3在應(yīng)力介導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了一定作用， CaN-NFAT3信號通路可能參與了應(yīng)力介導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡，但其確切機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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