葉華 楊凱 譚雪梅 趙丹 呂曉強 王青青,2

1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科；2.口腔疾病與生物醫(yī)學重慶市重點實驗室，重慶 400016

在長期的生物進化中，地球上的生物形成了內源性的時間調節(jié)系統(tǒng)，即晝夜節(jié)律時鐘[1-2]。目前研究[3-4]表明，哺乳動物體內的許多生命活動，如睡眠與清醒、激素分泌和免疫活動等均表現出以近24 h為周期的晝夜節(jié)律波動，這種波動是由鐘基因的晝夜節(jié)律性表達控制的。進一步研究[2,5]發(fā)現，哺乳類動物基因組中約有5%～10%的基因受到鐘基因的調控，也表現出以24 h為周期的晝夜節(jié)律波動，這些基因被稱為鐘控基因。鐘基因和鐘控基因的晝夜節(jié)律表達對維持正常生命活動高度協(xié)同有序具有重要作用[5-6]。

Per2（Period 2）基因是重要的鐘基因，在正常細胞中的表達具有晝夜節(jié)律性[1,7]；同時Per2也是一種抑癌基因，在前列腺癌、結腸癌、黑色素瘤等多種實體癌細胞中低表達[8-9]。許多與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的重要基因為鐘控基因，受到了鐘基因Per2的調控[9-11]。Per2通過調控下游眾多腫瘤相關基因影響細胞的增殖、凋亡和腫瘤新生血管生成，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關[10-11]。但目前尚不清楚鐘基因Per2與腫瘤相關鐘控基因在癌癥發(fā)生發(fā)展不同階段晝夜節(jié)律的動態(tài)變化情況。本研究通過檢測鐘基因Per2和腫瘤相關基因血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、Ki67、c-Myc和P53在金黃地鼠頰黏膜癌變不同階段的晝夜節(jié)律表達變化規(guī)律，分析該基因與癌變的關系，對深入研究癌癥發(fā)生發(fā)展的機制以及基于恢復生物晝夜節(jié)律的癌癥治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 儀器與試劑 二甲基苯并蒽（dimethylbenzanthracene，DMBA）（Sigma公司，美國）。RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）。冷凍低溫離心機（Z223MK-Z型，HERMLE公司，德國），核酸蛋白分析儀（UV-GeneQuant型，瑞典安瑪西亞公司）。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（TaKaRa公司，日本）。梯度PCR儀（BioRad公司，美國），熒光定量PCR儀（S1000TMThermal Cycler型，BioRad公司，美國）。光學顯微鏡（BX51型，Olympus公司，日本）。

1.1.2 實驗動物 無特定病原體級敘利亞金黃地鼠（北京維通利公司）90只，雄性，6～7周齡，質量90～120 g。所有動物實驗操作程序均經過重慶醫(yī)科大學實驗動物使用管理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 DMBA誘導金黃地鼠頰黏膜癌變動物模型的建立 90只敘利亞金黃地鼠隨機分籠飼養(yǎng)，每籠5只，墊料、飼料和飲水均經滅菌處理，室溫為（24±1） ℃，空氣濕度為60%±10%，置于標準化12 h光照和12 h黑暗環(huán)境中飼養(yǎng)3周以同步化金黃地鼠的晝夜生活習性。時間以開燈后時間（hours after light onset，HALO）作為參考，0 HALO為開燈時間，12 HALO為關燈時間。在第3周最后1 d，在24 h內4、8、12、16、20和24 HALO共6個不同時間點采用頸椎脫位法處死30只金黃地鼠，每個時間點處死5只，獲取其左側正常頰黏膜組織（正常組）。余下的60只地鼠繼續(xù)置于12 h光照和12 h黑暗環(huán)境中飼養(yǎng)，每周1、3、5將地鼠固定于自制鼠盒上，拉開上下牙列，用5號油畫筆于左側頰黏膜涂抹0.5%DMBA丙酮液，分別于涂抹DMBA第6周和第14周的最后1 d，在24 h內的4、8、12、16、20和24 HALO共6個不同時間點用頸椎脫位法各處死5只金黃地鼠，獲取左側頰部組織。

根據不同的誘導時間，第6周獲取的組織為癌前病變組，第14周獲取的組織為癌癥組。每個動物所獲的組織均分為兩個部分，一部分用10%甲醛溶液常規(guī)固定，脫水，石蠟包埋；另一部分迅速分裝于凍存管，保存在液氮中。

1.2.2 病理學檢測 將獲取的每塊石蠟包埋組織行4 μm厚切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色、封片，在光學顯微鏡下觀察組織的癌變情況。

1.2.3 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR檢測按試劑盒說明進行。1）組織總RNA提?。河肦NA提取試劑盒提取液氮保存組織的總RNA，用核酸蛋白分析儀測定其在波長260 nm及280 nm處的光密度值，計算RNA質量濃度和純度。2）cDNA合成：用逆轉錄試劑盒合成cDNA，反應體系為10 μL，37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。3）實時熒光定量PCR反應：用Oligo7.0軟件設計并合成目的基因Per2、VEGF、Ki67、c-Myc、P53以及內參基因β-actin的引物（引物序列見表1），反應體系為2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，濃度均為0.4 μmol·L-1的上游和下游引物各1 μL，DNA模板2 μL（相當于100 ng），滅菌滅酶蒸餾水8.5 μL。反應液總體積為25 μL。反應條件均為95 ℃預變性1.5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，擴增40個循環(huán)；60 ℃延伸時采集熒光信號。采用2-ΔΔCt法計算Per2、VEGF、Ki-67、c-Myc和P53 mRNA的表達。實驗共進行3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件分析各目的基因在每個癌變階段各6個時間點的差異性表達，檢驗水準為雙側α=0.05。用Time Series Analysis Cosinor 6.3軟件行單余弦分析，以P＜0.05為目的基因表達存在晝夜節(jié)律性，并繪制余弦曲線。晝夜節(jié)律特征以中值、振幅和峰值位相時來反映，其中中值為曲線對應的所有數據的平均值，振幅表示余弦曲線振蕩高于或低于中值的程度，峰值位相時表示節(jié)律達到頂峰時的時間。

表1 各基因實時熒光定量PCR引物序列Tab 1 Primers used for real-time PCR amplification of gene expression

2 結果

2.1 病理學檢查

病理學檢查顯示：正常組30例均為正常頰黏膜組織；癌前病變組30例中有25例表現為中度不典型增生，3例為輕度不典型增生，2例為重度不典型增生；癌癥組30例均為鱗狀細胞癌組織（圖1）。

圖1 正常頰黏膜、癌前病變及癌癥組織的病理學檢測 HE × 400Fig 1 Pathological observation of normal buccal mucosa, precancerous lesions and cancer HE × 400

2.2 鐘基因Per2 mRNA在頰黏膜癌變不同階段表達的晝夜節(jié)律改變

Per2 mRNA在正常組、癌前病變和癌癥組晝夜6個不同時間點之間表達的差異均有統(tǒng)計學意義（表2）。余弦分析表明：Per2 mRNA在正常組、癌前病變組和癌癥組中的表達均有晝夜節(jié)律性（表3），基因表達的余弦擬合曲線見圖2。結合表2、表3和圖2分析晝夜節(jié)律特征如下。1）中值和振幅：Per2 mRNA表達的中值和振幅在癌前病變組和癌癥組中均低于正常黏膜組（P＜0.05），癌癥組中值低于癌前病變組（P＜0.05），但振幅在癌癥組和癌前病變組中無明顯差異（P＞0.05）。2）峰值位相時：Per2 mRNA癌癥組的峰值位相時與正常組大致相同，但癌前病變組則較正常組提前了2.94 h。

表2 Per2、VEGF、Ki67、c-Myc和P53 mRNA在正常頰黏膜、癌前病變和癌癥組織中24 h內6個不同時間點的mRNA相對表達量Tab 2 The mRNA relative expression of Per2, VEGF, Ki67, c-Myc and P53 in normal buccal mucosa, precancerous lesions and cancer at 6 different time points in 24 h

表3 Per2、VEGF、Ki67、c-Myc和P53 mRNA在正常頰黏膜、癌前病變和癌癥組織中mRNA表達的晝夜節(jié)律變化特征Tab 3 The circadian rhythm characteristics of Per2, VEGF, Ki67, c-Myc and P53 mRNA expression in normal buccal mucosa,precancerous lesions and cancer

2.3 癌癥相關基因mRNA在頰黏膜癌變不同階段表達的晝夜節(jié)律改變

VEGF、Ki67和P53 mRNA在正常組、癌前病變組和癌癥組晝夜6個不同時間點之間表達的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；c-Myc mRNA在正常組、癌前病變組晝夜6個不同時間點表達的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但在癌癥組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

各基因的余弦擬合曲線見圖2，結合圖2和表2進行余弦分析，可以發(fā)現以下規(guī)律：VEGF、P53和c-Myc mRNA在正常組、癌前病變和癌癥組中的表達具有晝夜節(jié)律性（P＜0.05）；Ki67 mRNA在正常組和癌前病變組中的表達具有晝夜節(jié)律性（P＜0.05），但在癌癥組中不具有晝夜節(jié)律性（P＞0.05）。

圖2 Per2、VEGF、Ki67、c-Myc和P53 mRNA分別在正常頰黏膜、癌前病變和癌癥組織表達的晝夜變化的余弦擬合曲線Fig 2 Cosine fitted curves of Per2, VEGF, Ki67, c-Myc and P53 mRNA expression in normal buccal mucosa, precancerous lesions and cancer

各基因的晝夜節(jié)律特征分析如下。1）中值：VEGF和c-Myc mRNA表達的中值在癌前病變組和癌癥組中均高于正常組，且癌癥組的中值明顯高于癌前病變組；Ki67 mRNA表達的中值在癌前病變組中高于正常組；P53 mRNA表達的中值在癌前病變組和癌癥組中均低于正常組，且癌癥組的中值低于癌前病變組，以上差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2）振幅：VEGF和c-Myc mRNA的振幅在癌前病變組和癌癥組中均高于正常組（P＜0.05），但在癌癥組和癌前病變組之間無明顯差異（P＞0.05）；Ki67 mRNA的振幅在癌前病變組中明顯高于正常組（P＜0.05）；P53 mRNA的振幅在癌前病變組和癌癥組中均低于正常組，且癌癥組低于癌前病變組（P＜0.05）。3）峰值位相時：VEGF mRNA的峰值位相時在癌前病變組和癌癥組中較正常組分別提前3.72 h和8.89 h；Ki67 mRNA的峰值位相時在癌前病變組較正常組滯后18.28 h；P53 mRNA的峰值位相時在正常組和癌癥組大致相同，但癌前病變組較正常組滯后3.40 h；c-Myc mRNA的峰值位相時在癌前病變和癌癥組中分別較正常組提前3.86 h和滯后16.15 h。

3 討論

鐘基因Per2為抑癌基因，其表達的晝夜節(jié)律改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[10-12]。Zieker等[1]報道，正常人口腔頰黏膜細胞中Per2的表達具有晝夜節(jié)律性。本研究進一步發(fā)現，Per2 mRNA在口腔頰黏膜癌變3個不同階段的表達均具有晝夜節(jié)律性，Per2 mRNA表達的中值和振幅隨癌變的發(fā)展而下降，證明其抑癌作用逐漸減弱，細胞出現惡性轉化。從峰值位相時來看，Per2 mRNA表達峰值的出現時間在正常頰黏膜和癌癥組織中大概相同，但在癌前病變階段較正常組提前2.94 h，其機制有待深入研究。

癌癥的發(fā)生發(fā)展必需依賴于腫瘤新生血管的生成[11]，VEGF在誘導腫瘤新生血管生成中起核心作用[11]。Koyanagi等[7]發(fā)現，VEGF mRNA在小鼠皮下移植肉瘤細胞中的表達具有晝夜節(jié)律性，同時在荷瘤鼠的肝細胞和血漿中VEGF蛋白的表達也具有晝夜節(jié)律性。本研究發(fā)現，VEGF mRNA在口腔頰黏膜癌變3個不同階段的表達均具有晝夜節(jié)律性，其中值和振幅隨癌癥的發(fā)展而升高，促進腫瘤新生血管的形成和腫瘤的發(fā)展；另外VEGF mRNA的峰值位相時隨癌癥的發(fā)生發(fā)展而不斷提前，這為基于VEGF為靶點的癌癥治療用藥時間提供了參考。

P53為抑癌基因，其表達水平增高能抑致腫瘤生長和誘導細胞凋亡，Ki67和c-Myc是細胞增殖基因，其表達水平增高能增加細胞的增殖水平[10]。本研究表明：P53和c-Myc mRNA在口腔頰黏膜癌變3個不同階段的表達均具有晝夜節(jié)律性，但Ki67 mRNA僅在正常組和癌前病變組具有晝夜節(jié)律性，癌癥組表現為晝夜節(jié)律紊亂?？傮w來看，隨著癌癥的發(fā)生發(fā)展，P53 mRNA表達的中值和振幅逐漸降低，表明其抑癌作用和誘導細胞凋亡能力逐漸減弱，而Ki67和c-Myc mRNA的中值和振幅逐漸升高，細胞增殖水平逐漸增強，導致細胞增殖和凋亡的平衡失調。從峰值位相時來看，P53 mRNA的峰值位相時在正常組和癌癥組中基本相同，但癌前病變組較正常組滯后3.40 h，Ki67在癌前病變組較正常組滯后18.28 h，c-Myc在癌前病變組和癌癥組較正常組分別提前3.86 h和滯后16.15 h。由此推測，細胞凋亡基因P53和細胞增殖基因Ki67、c-Myc峰值位相時在癌變過程中的不協(xié)同改變進一步加重了細胞增殖和凋亡的平衡失調，從而促進癌癥的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現，隨著癌癥的發(fā)生發(fā)展，鐘基因Per2和腫瘤相關基因VEGF、Ki-67、c-Myc和P53表達的中值、振幅和峰值位相時均發(fā)生了明顯改變，這為從基因的晝夜節(jié)律改變的角度來探索癌癥發(fā)生機制以及基于恢復生物晝夜節(jié)律的癌癥治療提供了新的思路。

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