楊 陽 劉 霞 曾國敏 高雪晉 梁春花 杜曉華

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院；2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070）

腦紅蛋白（Neuroglobin，NGB）最早于2000年由德國科學(xué)家Burmester等［1］發(fā)現(xiàn)，是一種主要分布于脊椎動物的腦和視網(wǎng)膜中的特異性攜氧球蛋白，具有儲存氧氣和促進氧氣向線粒體擴散或直接介導(dǎo)氧氣向線粒體傳遞，促進ATP的產(chǎn)生，維持神經(jīng)元正常工作的功能［2］。近年來對于NGB的研究多集中于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，視網(wǎng)膜作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個重要組成部分，NGB在其內(nèi)部的表達及生理功能已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。有研究表明，NGB在視網(wǎng)膜中有比其它神經(jīng)組織更高程度的表達，其濃度約為腦內(nèi)濃度的50－100倍［3］，而視網(wǎng)膜的相對耗氧量又遠高于腦和其他組織，是人體內(nèi)耗氧率最高的組織［4，5］，提示NGB可能與視網(wǎng)膜的氧利用密切相關(guān)。目前，NGB在嚙齒類動物、犬、人［6－9］視網(wǎng)膜中的表達都有相關(guān)的報道，而對于NGB在家兔視網(wǎng)膜中的分布主要集中在眼球挫傷和高原吸氧［10，11］這兩個方面，對于正常家兔視網(wǎng)膜中NGB的分布特點尚未見報道。為此，本實驗采用免疫組織化學(xué)方法對NGB在正常成年家兔視網(wǎng)膜的分布進行研究，為進一步研究NGB在哺乳動物視網(wǎng)膜中的分布提供有價值的形態(tài)學(xué)資料，也可為NGB在視網(wǎng)膜缺氧損傷相關(guān)疾病中生理功能的研究提供理論依據(jù)。

材料和方法

1.實驗動物

健康成年家兔5只，樣品采集自甘肅省蘭州市，海拔1510米，屬亞高原環(huán)境。

2.主要試劑與儀器

器械：常規(guī)手術(shù)器械（解剖刀、解剖剪等）；生物組織包埋機：KD－BM型，浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP－9082型，上海朵弗實業(yè)有限公司；精密輪轉(zhuǎn)半自動螺旋切片機：RM－2235，德國LEICA 公司；生物組織攤片機：KD－P型，浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司；生物組織烤片機：KD－H型，浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司；光學(xué)顯微鏡：13395H2X型，德國LEICA公司。

試劑：PBS磷酸鹽緩沖液：ZLI－9062，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶：T8150－25，北京索萊寶科技有限公司；甲醛和正丁醇溶液：分析純，天津市百世化工有限公司；冰乙酸和酒精溶液：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；兔抗鼠多克隆抗體：BS－1859R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組化染色試劑盒：SP－9001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒：ZLI－9018，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3.方法

3.1 組織切片制備

家兔宰殺后，迅速取組織，置于入Davidson固定液（95%酒精：甲醛：冰乙酸：蒸餾水比例為3∶2∶1∶2）中固定24h，用鋒利的刀片在角膜上開一天窗，取出晶狀體和玻璃體，處理過的眼球組織于自來水流水狀態(tài)下沖5h。再按70%酒精（過夜）—80%酒精（5h）—90%酒精（3h）—95%酒精（2h）—正丁醇（過夜）—更換正丁醇（5h）的步驟操作［12］，然后石蠟包埋、制作石蠟切片。

3.2 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)染色SP法進行染色，步驟如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化；PBS（0.01 mol／L，pH＝7.2）沖洗3次，每次5min；0.125%胰蛋白酶抗原修復(fù)30min；PBS沖洗2次，每次3min；每張切片加入一滴30ml／L過氧化氫阻斷溶液，室溫孵育10min，PBS沖洗3次，每次5min；加入正常羊血清封閉，室溫孵育15min，傾去勿洗；加入一滴相應(yīng)的一抗，37℃孵育2h，PBS沖洗3次；除去PBS，加入相應(yīng)的二抗，37℃孵育15min；PBS沖洗3次，每次5min；每張切片加入一滴鏈霉菌抗生物素－過氧化物酶溶液，37℃孵育15min，PBS沖洗3次，每次5min；除去PBS，滴加新鮮配制的DAB顯色液，在顯微鏡下觀察并控制顯色；蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片并拍照和鏡下分析。陰性對照以PBS替代一抗進行染色。

4.免疫組化結(jié)果判定

在NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng)中對陽性切片進行拍照，拍攝參數(shù)要統(tǒng)一。利用Image Pro Plus6.0圖像處理軟件對所獲得的照片進行分析，在測量窗內(nèi)對圖像中的各層結(jié)構(gòu)區(qū)域（Area of inter，AOI）進行面積和累積光密度值（Integrated optical density，IOD）測定，測定結(jié)果導(dǎo)入 Excel 2010軟件計算陽性對照組各層結(jié)構(gòu)區(qū)域的平均光密度值（Mean density，MD）（平均光密度＝累積光密度／面積）。陰性對照組的光密度值測定方式同上，各層結(jié)構(gòu)區(qū)域MD值的測定結(jié)果均為0。

結(jié) 果

眼球的最內(nèi)層是視網(wǎng)膜，哺乳動物視網(wǎng)膜由內(nèi)向外可分為10層結(jié)構(gòu)（圖1，6），依次為內(nèi)界膜、視神經(jīng)纖維層、節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、外核層、外界膜、視桿視錐層和色素上皮層，其中內(nèi)界膜由支持細胞的內(nèi)側(cè)端融合而成；視神經(jīng)纖維層由節(jié)細胞的軸突組成；節(jié)細胞層由節(jié)細胞和無長突細胞的胞體組成；內(nèi)網(wǎng)狀層由雙極細胞的軸突和節(jié)細胞的樹突等組成；內(nèi)核層由雙極細胞、水平細胞等細胞的胞體及樹突等組成；外網(wǎng)狀層由視桿細胞和視錐細胞的軸突，雙極細胞樹突，水平細胞的突起組成；外核層由視錐和視桿細胞的胞體組成；外界膜由支持細胞，及神經(jīng)角質(zhì)細胞的外側(cè)端融合而成；視桿視錐層，由光感受器細胞的內(nèi)、外節(jié)組成；色素上皮層由色素上皮細胞組成。

成年家兔視網(wǎng)膜中NGB免疫陽性反應(yīng)主要分布于視神經(jīng)纖維層、節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、外網(wǎng)狀層、光感受器內(nèi)節(jié)段和色素上皮層，內(nèi)界膜、外界膜和內(nèi)核層也有陽性表達（圖2）。其中，視神經(jīng)纖維層的陽性表達主要為節(jié)細胞的軸突；節(jié)細胞層的陽性表達為節(jié)細胞的胞體，其胞體大小不一，輪廓清楚，免疫組化結(jié)果顯示NGB表達定位于細胞質(zhì)，胞核中未見陽性著色；內(nèi)網(wǎng)狀層的陽性表達主要為雙極細胞的軸突和節(jié)細胞的樹突；外網(wǎng)狀層的陽性表達為視桿細胞和視錐細胞的軸突，雙極細胞樹突以及水平細胞的突起；色素上皮層的陽性表達為色素上皮細胞；內(nèi)核層的陽性表達為雙極細胞的胞體，其中胞質(zhì)陽性著色較強。NGB陽性表達的細胞類型主要為光感受器細胞、雙極細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，與視網(wǎng)膜三級神經(jīng)元相一致。成年家兔視網(wǎng)膜的外核層和光感受器外節(jié)段未見有NGB陽性表達。陰性對照各層未見陽性表達（圖5）。此外，免疫組化結(jié)果顯示NGB在成年家兔視神經(jīng)中也具有陽性表達（圖3，4）。

利用Image Pro Plus6.0軟件進行半定量分析的結(jié)果顯示（表1），陽性對照組家兔視網(wǎng)膜視神經(jīng)纖維層、節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、外核層、光感受器內(nèi)節(jié)段、光感受器外節(jié)段和色素上皮層的 MD值分別為0.151±0.050、0.173±0.040、0.140±0.019、0.091±0.031、0.123±0.017、0.020±0.013、0.143±0.038、0.033±0.014、0.170±0.040。統(tǒng)計學(xué)分析表明，陽性對照組的外核層和光感受器外節(jié)段的MD值與陰性對照組差異不顯著（P＞0.05），為陰性表達（－），陽性對照組的視神經(jīng)纖維層、節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、光感受器內(nèi)節(jié)段和色素上皮層的MD值與陰性對照組有顯著差異（P＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義，均為陽性表達，而陽性對照組的視神經(jīng)纖維層、節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、外網(wǎng)狀層、光感受器內(nèi)節(jié)段和色素上皮層的MD值又顯著高于內(nèi)核層的 MD值（P＜0.05），說明視神經(jīng)纖維層、節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、外網(wǎng)狀層、光感受器內(nèi)節(jié)段和色素上皮層為強陽性表達（＋＋），內(nèi)核層為弱陽性表達（＋），這一判定結(jié)果也與光鏡下肉眼觀察的陽性表達情況相一致。

表1 家兔視網(wǎng)膜各層NGB表達強度比較（）Table 1 The compare of the NGB expression intensity in adultsheep retina（）

表1 家兔視網(wǎng)膜各層NGB表達強度比較（）Table 1 The compare of the NGB expression intensity in adultsheep retina（）

＊陽性與陰性對照組比較，P＞0.05；＊＊ 陽性與陰性對照組比較，P＜0.05；△ 陽性對照組內(nèi)比較，P＜0.05。＊Compared with negative control group，P＞0.05；＊＊ Compared with negative control group，P＜0.05；△Intra－group comparisons of the positive control group，P＜0.05

平均光密度值 Meandensity 表達強度The expression intensit y視神經(jīng)纖維層（NFL）nerve fiber layer 0.151±0.050＊＊ △＋＋＋＋節(jié)細胞層（GCL）ganglion cell layer 0.173±0.040＊＊△ ＋＋內(nèi)網(wǎng)狀層（IPL）inner plexiform layer 0.140±0.019＊＊△ ＋＋內(nèi)核層（INL）inner nuclear layer 0.091±0.031＊＊ ＋外網(wǎng)狀層（OPL）outer plexiform layer 0.123±0.017＊＊△ ＋＋外核層（ONL）outer nuclear layer 0.020±0.013＊ –光感受器內(nèi)節(jié)段（IS）photoreceptor inner segments 0.143±0.038＊＊ △ ＋＋光感受器外節(jié)段（OS）photoreceptor outer segments 0.033±0.014＊ –色素上皮層（PEL）pigmented epithelial layer 0.170±0.040＊＊ △

討 論

已有研究表明，NGB在嚙齒類動物、犬和人視網(wǎng)膜的定位除色素上皮層和光感受器外節(jié)段未見有陽性表達外，其它各層均有NGB陽性表達，主要集中于節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、外網(wǎng)狀層、光感受器內(nèi)節(jié)段的橢球體及內(nèi)、外核層的核周體等神經(jīng)元集中的部位［3，6－9］。本研究結(jié)果顯示，NGB在家兔視網(wǎng)膜內(nèi)界膜、視神經(jīng)纖維層、節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、外界膜和光感受器內(nèi)節(jié)段中均見有陽性分布，在光感受器外節(jié)段未見有陽性表達，這一觀察結(jié)果與前人在嚙齒類動物、犬和人的研究結(jié)果基本一致。至于NGB在哺乳動物視網(wǎng)膜色素上皮層中是否有表達，現(xiàn)有研究觀點并不一致，Bentmann［13］、李耀宇［7］和Schmidt［3］等利用免疫組織化學(xué)技術(shù)證實，NGB陽性物質(zhì)不存在于大鼠和小鼠的色素上皮層中，但Ostoji？倢等［8－9］應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對人和犬視網(wǎng)膜內(nèi)NGB的定位研究結(jié)果表明，人和犬視網(wǎng)膜色素上皮層中均存在NGB陽性表達，徐瓊［14］等在對成年大鼠視網(wǎng)膜中NGB亞細胞分布的研究中發(fā)現(xiàn)色素上皮層中也具有NGB陽性顆粒。本研究在成年家兔視網(wǎng)膜色素上皮層中也觀察到有NGB陽性表達，這與Bentmann等的研究結(jié)果不同，但與 Ostoji？倢和徐瓊等［8－9，13］的觀察結(jié)果一致，這種矛盾現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與所用抗體及研究方法的敏感性不同有關(guān)，另外，為保證視網(wǎng)膜的功能，人類和大多數(shù)哺乳動物通過視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜雙重循環(huán)來連續(xù)供氧，內(nèi)層視網(wǎng)膜由視網(wǎng)膜中央血管系統(tǒng)營養(yǎng)，外層視網(wǎng)膜的血供主要是由脈絡(luò)膜循環(huán)支持，而脈絡(luò)膜循環(huán)的血液并不直接到達光感受器細胞層，其中的氧必須經(jīng)過色素上皮層才能彌散至光感受器，這也可能是NGB表達不同的原因之一。出現(xiàn)在色素上皮層中的NGB是由色素上皮層細胞自身產(chǎn)生還是NGB在神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生后的運輸和再分布，還有待進一步實驗驗證。此外，在NGB是否分布于哺乳動物視網(wǎng)膜外核層的問題上，現(xiàn)有研究結(jié)果也存在不一致的情況，冉建華［6］等采用原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在Wistar大鼠視網(wǎng)膜的內(nèi)、外核層中觀察到強烈的NGB mRNA雜交信號，這與李耀宇［7］和 Ostoji［8］等采用免疫組化技術(shù)在SD 大鼠和人類眼球核層發(fā)現(xiàn)NGB免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)分布相一致，但徐瓊［13］等未發(fā)現(xiàn)外核層中具有NGB陽性顆粒。本研究結(jié)果顯示，家兔視網(wǎng)膜外核層中未見有NGB陽性表達，這與徐瓊的觀察結(jié)果相一致，但與Ostoji？倢和李耀宇的研究結(jié)果不同，這種差異的出現(xiàn)可能也與所用抗體及研究方法的敏感性不同有關(guān)。

免疫組化半定量分析結(jié)果顯示，NGB在家兔視網(wǎng)膜各層表達的強弱有明顯差異，在視神經(jīng)纖維層、節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、外網(wǎng)狀層和光感受器內(nèi)節(jié)段等部位的陽性表達強度最高，這與Schmidt等［13］對小鼠視網(wǎng)膜中NGB表達的研究結(jié)果一致。有研究表明，哺乳動物視網(wǎng)膜的視神經(jīng)纖維層、節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、外網(wǎng)狀層和光感受器內(nèi)節(jié)段是視網(wǎng)膜組織中氧耗最集中的部位［15］，這是因為視網(wǎng)膜的這些部位主要由相鄰二層神經(jīng)元之間大量的突觸聯(lián)系和線粒體所構(gòu)成，神經(jīng)元通過相互間的突觸來傳遞信息，以實現(xiàn)光電信號的轉(zhuǎn)換，該過程需要消耗大量的氧，而NGB在這些部位的高表達可能與其對氧的利用和線粒體的亞細胞定位密切相關(guān)，同時，NGB自身攜帶的氧也可為視網(wǎng)膜神經(jīng)元所利用進而滿足上述四層對氧的高消耗。此外，徐瓊等研究發(fā)現(xiàn)，成年大鼠視網(wǎng)膜突觸前結(jié)構(gòu)的突觸小泡之間分布有較多的NGB陽性顆粒，進一步支持了NGB與視網(wǎng)膜耗氧有關(guān)的假設(shè)，并且提示NGB可能由神經(jīng)元分泌并運輸?shù)酵挥|小泡之間來完成復(fù)雜的生理功能。我們的研究還發(fā)現(xiàn)NGB在家兔視網(wǎng)膜色素上皮層也有較高強度的陽性表達。有研究表明，色素上皮細胞的質(zhì)膜內(nèi)褶可擴大色素上皮細胞與脈絡(luò)膜毛細血管間的接觸面積，有利于在視網(wǎng)膜外層與脈絡(luò)膜之間營養(yǎng)和代謝物質(zhì)的選擇性轉(zhuǎn)運［16］。另外色素上皮細胞還具有維生素A的轉(zhuǎn)運和代謝、藥物解毒、合成黑色素和細胞外基質(zhì)、對光感受器外節(jié)脫落的膜盤進行吞噬消化等多種功能。色素上皮細胞的這些功能都對其自身提出了較高的能量要求，提示NGB在色素上皮層的高表達可能與其在維持正常功能活動中需要大量耗氧有關(guān)。

研究表明，NGB在視網(wǎng)膜的氧動態(tài)平衡中起著至關(guān)重要的作用，同時NGB的存在可以使視網(wǎng)膜在缺血缺氧的情況下，忍受更長的時間［17］。史少陽等［18］發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜缺血后NGB轉(zhuǎn)錄水平迅速增高，說明NGB對缺氧的反應(yīng)非常敏感，提示NGB有可能在視網(wǎng)膜缺氧的適應(yīng)性保護過程中起重要作用。丁國鵬等［19］研究表明，在急性缺血缺氧狀態(tài)下大鼠視網(wǎng)膜NGB含量表達升高主要集中在節(jié)細胞層，在內(nèi)、外網(wǎng)狀層也發(fā)現(xiàn)有少量表達升高。燕振國等［10］研究表明，在高原低氧環(huán)境下兔眼視網(wǎng)膜組織中NGB的表達高于平原及亞高原環(huán)境，平原地區(qū)NGB在兔視網(wǎng)膜內(nèi)、外叢狀層和光感受器內(nèi)節(jié)中僅有弱表達。本實驗對亞高原環(huán)境下家兔視網(wǎng)膜中NGB表達的研究結(jié)果表明，NGB在視神經(jīng)纖維層、節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、外網(wǎng)狀層、光感受器內(nèi)節(jié)段和色素上皮層等部位的表達強度最高，在內(nèi)核層表達強度較弱，提示視網(wǎng)膜視神經(jīng)纖維層、節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、外網(wǎng)狀層和光感受器內(nèi)節(jié)段等耗氧最集中的部位對缺血缺氧的敏感性程度最高，色素上皮層細胞代謝活躍，具有特殊的吞噬作用，同時還擔(dān)負著視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層的生物濾過功能，這都需要較高強度的能量供給，因此對缺血缺氧的敏感性程度也最高。此外，內(nèi)核層作為傳遞光感受器細胞沖動至神經(jīng)節(jié)細胞的通路，兩者都具有較大的耗氧需求，對缺血缺氧的敏感性也較高，而外核層和光感受器外節(jié)段等NGB表達呈陰性的部位則對缺氧的敏感程度最低。因此，推測NGB在視網(wǎng)膜各層表達的差異也可能與各層對缺血缺氧損傷的敏感程度相對應(yīng)。

總之，NGB在家兔視網(wǎng)膜中的分布同其他動物有相似之處，亦具有其自身特點。NGB的分布和視網(wǎng)膜各部分的生理機能密切相關(guān)。本實驗的研究結(jié)果為進一步探討NGB在正常哺乳動物視網(wǎng)膜中的分布提供了一定的形態(tài)學(xué)資料，但對于視網(wǎng)膜損傷后NGB參與的損傷修復(fù)機理還有待于從分子和組織生物學(xué)方面的進一步研究。

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圖 版 說 明

圖1 NGB在家兔眼球壁的表達。R視網(wǎng)膜。免疫組織化學(xué)染色，標(biāo)尺示100μm

圖2 NGB在家兔視網(wǎng)膜中的表達。ILM內(nèi)界膜；NFL視神經(jīng)纖維層；GCL節(jié)細胞層；IPL內(nèi)網(wǎng)層；INL內(nèi)核層；OPL外網(wǎng)層；ONL外核層；OLM外界膜；IS光感受器內(nèi)節(jié)段；OS光感受器外節(jié)段；PEL色素上皮層?！疽暽窠?jīng)節(jié)細胞。免疫組織化學(xué)染色，標(biāo)尺示20 μm

圖3 NGB在家兔視盤中的表達?！疽暽窠?jīng)。免疫組織化學(xué)染色，標(biāo)尺示100μm

圖4 NGB在家兔視盤中的表達。↑示視神經(jīng)。免疫組織化學(xué)染色，標(biāo)尺示20μm

圖5 NGB在家兔視網(wǎng)膜中的表達。ILM內(nèi)界膜；NFL視神經(jīng)纖維層；GCL節(jié)細胞層；IPL內(nèi)網(wǎng)層；INL內(nèi)核層；OPL外網(wǎng)層；ONL外核層；OLM外界膜；RCL視桿視錐層；PEL色素上皮層。免疫組織化學(xué)染色，標(biāo)尺示20μm

圖6 家兔視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)。ILM內(nèi)界膜；NFL視神經(jīng)纖維層；GCL節(jié)細胞層；IPL內(nèi)網(wǎng)層；INL內(nèi)核層；OPL外網(wǎng)層；ONL外核層；OLM外界膜；RCL視桿視錐層；PEL.色素上皮層。HE染色，標(biāo)尺示20μm

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1The expression of NGB in Eyeball wall of adult rabbit.R，retina.Immunohistochemical staining，Bar＝100 μm

Fig.2The expression of NGB in retina of adult rabbit.ILM，inner limiting membrane；NFL，nerve fiber layer；GCL，ganglion cell layer；IPL，inner plexiform layer；INL，inner nuclear layer；OPL，outer plexiform layer；ONL，outer nuclear layer；OLM，outer limiting membrane；IS，photoreceptor inner segment；OS，photoreceptor outer segment；PEL，pigmented epithelial layer.↑showed the retinal ganglion cell.Immunohistochemical staining，Bar＝20μm

Fig.3The expression of NGB inthe optic disc of adult rabbit.↑showed the optic nerve.Immunohistochemical staining，Bar＝100μm

Fig.4The expression of NGB in the optic disc of adultrabbit.↑showed the optic nerve.Immunohistochemical staining，Bar＝20μm

Fig5The expression of NGB in the optic disc of adult rabbit.ILM，inner limiting membrane；NFL，nerve fiber layer；GCL，ganglion cell layer；IPL，inner plexiform layer；INL，inner nuclear layer；OPL，outer plexiform layer；ONL，outer nuclear layer；OLM，outer limiting membrane；RCL，layer of rods and cones；PEL，pigmented epithelial layer.Immunohistochemical staining，Bar＝20μm

Fig.6The retina of adult rabbit.ILM，inner limiting membrane；NFL ，nerve fiber layer；GCL，ganglion cell layer；IPL，inner plexiform layer；INL，inner nuclear layer；OPL，outer plexiform layer；ONL，outer nuclear layer；OLM，outer limiting membrane；RCL，layer of rods and cones；PEL，pigmented epithelial layer.HE staining，Bar＝20μm