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新疆阿魏中阿魏酸在Caco-2細(xì)胞模型的吸和收轉(zhuǎn)運研究

張海英1,2，姜林2，任燕1，周銘心1*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥藥理學(xué)教研室，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊 830000)

[關(guān)鍵詞]新疆阿魏；Caco-2細(xì)胞；腸吸收

[中圖分類號]R282.71,R285.5[文獻標(biāo)志碼]B

DOI：10.5428/pcar20150502

基金項目國家自然科學(xué)基金(81260625)

作者簡介張海英(女)，博士生，副教授.

[收稿日期]2014-09-22

E-mail: zzhhyy2583@126.com

*通信作者(Corresponding author)：周銘心，E-mail:zmx9998@vip.sina.com

阿魏為傘形科植物，是新疆特色資源植物。本課題組前期研究表明，新疆阿魏乙酸乙酯提取物對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116具有增殖抑制作用[1]。Caco-2細(xì)胞模型是研究藥物吸收、轉(zhuǎn)運和代謝常用的經(jīng)典體外模型[2]，故本研究運用Caco-2細(xì)胞模型研究新疆阿魏乙酸乙酯提取物的吸收轉(zhuǎn)運特性，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1材料

1.1儀器和試劑CO2培養(yǎng)箱、MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；六孔Transwell板(直徑24 mm，生長面積4.67 cm2)和聚碳酸酯膜(孔徑3.0 μm)購自美國Costar公司；

Waters

2695高效液相色譜儀和Waters XTerra RpC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)購自美國Waters公司；Millicell-ERS細(xì)胞電阻儀(美國Millipore公司)；AL204電子天平 [梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。阿魏酸對照品(批號110773-201012，中國食品藥品檢定研究院)；Hank’s緩沖溶液(美國Hyclone公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液(批號1237839，美國Gibco公司)。

1.2細(xì)胞人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2，購自中國科學(xué)研究院上海生化與細(xì)胞研究所。

1.3新疆阿魏乙酸乙酯提取物的制備新疆阿魏400 g，用30～60 ℃石油醚2000 ml超聲提取40 min，控溫在40 ℃以下，過濾；上述殘渣用95%乙醇2000 ml超聲提取60 min,提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮。濃縮的膏液用硅藻土拌樣分散均勻后，用乙酸乙酯2000 ml超聲提取2次至提取液近無色，減壓回收得新疆阿魏乙酸乙酯提取物。

2方法和結(jié)果

2.1Caco-2細(xì)胞單層模型的建立Caco-2細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)液稀釋，接種到六孔Transwell培養(yǎng)板上的聚碳酸酯膜上，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接種后每隔4 d用Millicell-ERS細(xì)胞電阻儀測定聚碳酸酯膜上Caco-2單層細(xì)胞的跨膜電阻，各孔跨膜電阻值均達到平臺(>500 Ω/cm2)，即符合要求可用于實驗[3]。

2.2阿魏乙酸乙酯提取物對Caco-2細(xì)胞增殖的影響將Caco-2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入阿魏乙酸乙酯提取物使終濃度為200、100、50、25、12.5、6.25 mg/L，培養(yǎng)48 h。每孔加MTT液20 μl，使用MK3酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度(A)[1]。經(jīng)測定，阿魏乙酸乙酯提取物200、100、50、25、12.5、6.25 mg/L對Caco-2細(xì)胞的增殖抑制率分別為(83.10±1.21)%、(73.21±1.34)%、(51.88±1.50)%、(24.56±1.06)%、(9.74±0.75)%和(7.78±0.64)%。表明阿魏乙酸乙酯提取物濃度在0～12.5 mg/L范圍內(nèi)，與細(xì)胞培養(yǎng)48 h后細(xì)胞的存活率>90%，故確定藥物濃度12.5 mg/L為最大無毒濃度，6.25 mg/L濃度對Caco-2細(xì)胞無毒性，但濃度太低，達不到儀器的檢測限，故吸收轉(zhuǎn)運實驗選擇12.5 mg/L濃度進行。

2.3HPLC分析方法的建立

2.3.1色譜條件色譜柱：Waters XTerra RpC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(17∶83)；檢測波長：323 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.3.2分析方法的專屬性考察分別取Hank’s緩沖液、含阿魏酸的Hank’s緩沖溶液、含阿魏乙酸乙酯提取物的Hank’s緩沖溶液各200 μl，加入1 ml甲醇，超聲30 min，4.47×102×g離心10 min，取上清液，注入10 μl進行HPLC分析。另取用甲醇溶解的阿魏酸對照品溶液10 μl直接進行HPLC分析。結(jié)果表明，阿魏酸對照品與供試品的保留時間都在16.23 min[4]，供試品的色譜圖在16.23 min處有一個主峰，前后有幾個小峰，說明阿魏乙酸乙酯提取物主要成分是阿魏酸，還有一些其他成分。Hank’s緩沖液色譜圖在阿魏酸相應(yīng)出峰時間無干擾，表明本方法專屬性較好。

2.3.3方法學(xué)研究精密稱取阿魏酸對照品2.5 μg，置于25 ml棕色容量瓶中，加適量甲醇超聲使溶解，定容至刻度，配制成濃度為0.1 μg/ml的對照品儲備液。再分別取阿魏酸儲備液1、2、3、4、5 ml置5 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 μg/ml的對照品溶液，按2.3.1項色譜條件進樣分析。以阿魏酸對照品濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為y=5.87×106x-9.5×104(r=0.996 6)，表明阿魏酸在0.02～0.10 μg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好。經(jīng)考察，儀器精密度、實驗重復(fù)性、實驗穩(wěn)定性的RSD分別為1.21%、1.71%、1.84%。平均加樣回收率為99.61%，RSD為1.02%，表明本方法準(zhǔn)確性良好，可用于阿魏酸的含量測定。

2.4阿魏乙酸乙酯提取物的吸收轉(zhuǎn)運研究

2.4.1Caco-2模型的轉(zhuǎn)運實驗取生長21 d、符合轉(zhuǎn)運條件的Transwell培養(yǎng)板上的聚碳酸酯膜，藥物的吸收實驗(AP→BL)是將濃度為12.5 mg/L的阿魏乙酸乙酯提取物溶液(其中阿魏酸為3.42 μg/ml)1.5 ml加到AP側(cè)作為供給池，BL側(cè)加入空白Hank’s液2.0 ml作為接收池。于30、60、90、120 min時，分別從接收池抽取200 μl的樣品供分析，再加入200 μl的Hank’s液以保證接收池中的液體量為2.0 ml。按2.4.2項供試品溶液的制備進行處理，過0.45 μm微孔濾膜，進樣10 μl進行HPLC分析。BL→AP側(cè)的轉(zhuǎn)運剛好相反。計算藥物的滲透系數(shù)(Papp)[2,3]。

Papp=dQ/(60×dt×A×C0)

Papp單位為cm/s。Q是累積轉(zhuǎn)運量 (μg)，為阿魏酸在接收池出現(xiàn)的總量，計算時要累加上次取樣時取走的量；C0是化合物在供給池的初始濃度(3.42 μg/ml)；A是聚碳酸酯膜的表面積(cm2)，本研究為4.67 cm2，t是測定時間。

2.4.3阿魏乙酸乙酯提取物在Caco-2細(xì)胞的吸收與轉(zhuǎn)運特性本研究中A為4.67 cm2，C0為3.42 μg/ml，經(jīng)測定，阿魏乙酸乙酯提取物的雙向累積轉(zhuǎn)運情況如下：30、60、90、120 min，由AP→BL的累積轉(zhuǎn)運量為(0.33±0.01)、(0.40±0.016)、(0.46±0.033)、(0.579±0.041) μg；由BL→AP的累積轉(zhuǎn)運量為(0.27±0.013)、(0.357±0.018)、(0.45±0.033)、(0.522±0.036) μg。90 min時，阿魏乙酸乙酯提取物的吸收滲透系數(shù)Papp AP→BL為(5.33±0.377)×10-6cm/s，分泌滲透系數(shù)Papp BL→AP為(5.218±0.383)×10-6cm/s，Papp AP→BL/Papp BL→AP為1.02。

3討論

在Caco-2細(xì)胞單層模型上，判定藥物吸收難易的一般標(biāo)準(zhǔn)是Papp AP→BL<1.0×10-6cm/s為吸收不良的藥物，吸收率在0～20%；Papp AP→BL在1×10-6～10×10-6cm/s為吸收中等的藥物，吸收率在20%～70%；Papp AP→BL>10×10-6cm/s，為吸收良好的藥物，吸收率在70%～100%[3]。本研究中90 min阿魏乙酸乙酯提取物的吸收滲透系數(shù)Papp AP→BL為(5.33±0.377)×10-6cm/s，表明阿魏乙酸乙酯提取物為吸收中等的藥物。90 min時阿魏乙酸乙酯提取物分泌滲透系數(shù)Papp BL→AP為(5.218±0.383)×10-6cm/s，Papp AP→BL/Papp BL→AP為1.02。提示它們的吸收和外流能力相近，推測阿魏乙酸乙酯提取物在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收沒有載體轉(zhuǎn)運參與，是以被動擴散為主要方式被細(xì)胞攝取。

綜上所述，本研究表明阿魏乙酸乙酯提取物為吸收中等的成分，轉(zhuǎn)運途徑可能為被動擴散方式，為明確阿魏乙酸乙酯提取物的體內(nèi)吸收提供了實驗依據(jù)。

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[修回日期]2015-07-08

[本文編輯]貢沁燕