SOCS3通過PYK2信號通路調(diào)控小細胞肺癌的HI F-1α表達及增殖潛能△

萬軍 車云 康寧寧 柴惠平

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普胸外科，合肥 230022

小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）是肺癌的常見基本類型之一，約占20%，其癌細胞生長迅速，易轉(zhuǎn)移擴散，并且有三分之二的肺癌患者在診斷時就已存在遠處轉(zhuǎn)移。SCLC以全身化療為主，但其治療水平在近30多年來一直處于平臺期[1-2]。多項研究從分子水平證實，SCLC的發(fā)生可能涉及多種因子的參與[3-5]。雖然SOCS3和PYK2與腫瘤發(fā)生發(fā)展間的關(guān)系正日益受到關(guān)注[6-8]，但目前尚無文獻報道SOCS3和PYK2在SCLC中表達和機理方面的內(nèi)容。

因為實體腫瘤過快的增殖生長方式與其血管生成不成比例，腫瘤內(nèi)部普遍存在缺氧的情況?，F(xiàn)有的動物實驗和臨床觀察雖已證實缺氧是惡性腫瘤進展的主要負面因素，但其具體作用機制尚未明確[9-10]。HIF-1是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，主要由α和β兩個亞單位組成，一般情況下α亞單位是主要的調(diào)節(jié)因子。HIF-1普遍存在于人和哺乳動物細胞內(nèi)，只有在缺氧條件下才被穩(wěn)定表達，并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄和基因調(diào)控作用[11]。近十年的研究顯示，HIF-1α和SOCS在人類許多常見的腫瘤中都有表達，它們調(diào)節(jié)腫瘤生物學(xué)的各個方面，如細胞生存、增殖、血管生成等[12-13]，從而成為非常引人矚目的抗癌藥物研發(fā)目標(biāo)。本研究主要探討在SCLC進展過程中SOCS3與PYK2信號通路的關(guān)系及對HIF-1α表達和細胞增殖潛能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

6周齡雄性裸鼠24只，體重為19～23 g（中科院上海實驗動物中心提供）；人小細胞肺癌細胞株NCI-H446購自上海北諾生物科技有限公司；HIF-1α、SOCS3、PYK2和Tyr402單克隆抗體購自上海漢恒生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、異硫氰酸熒光素（FITC）和RNase A酶購自上海博升生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2..11轉(zhuǎn)染細胞的制備 收集對數(shù)生長期的人小細胞肺癌株NCI-H446細胞，室溫下200 r/min離心5 min；然后用RPMI 1640培養(yǎng)基（0.5%的FCS）重懸細胞，200 r/min離心5 min，棄上清。用電穿孔緩沖液重懸細胞，將細胞濃度調(diào)整為每毫升2×106個，孵育20 min；加入質(zhì)?；蚱渌d體后混勻，使終濃度為25μg/ml。將800μl細胞懸液移入4 mm電擊杯內(nèi)，使細胞懸浮并避免氣泡；給予電擊。電擊參數(shù)為620 V持續(xù)60μs，脈沖1次；電擊后15 min內(nèi)將細胞小心地轉(zhuǎn)移至含3 ml RPMI 1640培養(yǎng)基（10%的FCS）的培養(yǎng)皿中，48 h后檢測。利用此方法分別制備Ad5轉(zhuǎn)染細胞株、Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染細胞株和Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染細胞株。

1.2..22免疫熒光檢測 使用紅色熒光標(biāo)記，在倒置熒光顯微鏡下，分別檢測已轉(zhuǎn)染細胞株及未轉(zhuǎn)染細胞株中SOCS3的表達水平。

1.2..33細胞生長曲線的繪制 將人小細胞肺癌株NCI-H446細胞、Ad5轉(zhuǎn)染細胞株、Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染細胞株和Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染細胞株分別移至培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于第4、8、12、16、20、24、28天使用細胞計數(shù)板分別計算細胞增殖數(shù)。檢測SOCS3單獨轉(zhuǎn)染及SOCS3與HIF-1α共轉(zhuǎn)染對細胞增殖的影響。

1.2..44建立實驗用裸鼠移植瘤模型 24只裸鼠被隨機分為Ad5轉(zhuǎn)染對照組、Ad5-SOCS3單獨轉(zhuǎn)染組和Ad5-SOCS3-HIF-1α共同轉(zhuǎn)染組，每組8只。于裸鼠背側(cè)近右前肢處，皮下注射對數(shù)生長期的NCI-H446小細胞肺癌細胞株，總量為200μl，為含1×107個懸浮細胞的無血清RPMI 1640培養(yǎng)液。觀察并記錄各組裸鼠移植瘤的生長速率，定期測量腫瘤體積，計算腫瘤生長抑制率，繪制腫瘤生長曲線圖。28天后，脫頸處死所有裸鼠，稱重比較瘤體。

1.2..55蛋白印跡法檢測表達情況 采用蛋白印跡法檢測HIF-1α、SOCS3、PYK2及其磷酸化活性形式Tyr402在裸鼠移植瘤中的表達情況。首先裂解懸浮細胞樣品，抽提目的蛋白質(zhì)；然后在100 V、120 min的條件下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；再次于15 mA硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜過夜；最后封閉、一抗孵育、二抗孵育，使用X光片自動洗片機顯影檢測蛋白表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析方法

電泳產(chǎn)物及蛋白印跡產(chǎn)物采用半定量的方法獲得數(shù)據(jù)。采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較選用SNK法檢驗，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后SOCS3的表達情況

使用Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染小細胞肺癌細胞株NCI-H446。經(jīng)細胞爬片并使用免疫熒光標(biāo)記SOCS3（紅色）后，研究者于倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染前后SOCS3蛋白的表達水平存在明顯差異，轉(zhuǎn)染后細胞胞質(zhì)的SOCS3蛋白表達水平明顯升高（圖1A和圖1B）。以未轉(zhuǎn)染的人小細胞肺癌細胞株NCI-H446為空白對照組，以單純轉(zhuǎn)染Ad5的細胞為陰性對照，以轉(zhuǎn)染了Ad5-SOCS3的細胞為陽性組，以各組的β-actin蛋白表達情況為內(nèi)對照，采用蛋白印跡法檢測三組細胞中SOCS3蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組中SOCS3蛋白表達水平顯著高于Ad5組和空白對照組，Ad5組中SOCS3蛋白表達水平明顯高于空白對照組（圖1C和圖片1D，均p＜0.05）。

2.2 裸鼠模型皮下移植瘤生長情況

從培養(yǎng)皿傳代轉(zhuǎn)染的細胞開始，每4天計數(shù)一次細胞增殖數(shù)量，至第28天結(jié)束觀察計數(shù)，Ad5轉(zhuǎn)染組、Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組和Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組的細胞增殖情況存在明顯差異，其中Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組的細胞增殖速率最慢、Ad5轉(zhuǎn)染組的細胞增殖速率最快、Ad5-SOCS3-HIF-1α轉(zhuǎn)染組的細胞增殖速率居中但更接近Ad5轉(zhuǎn)染組，Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組和Ad5轉(zhuǎn)染組的細胞增殖速率相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A，p＜0.05）。

將Ad5轉(zhuǎn)染組、Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組和Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組的細胞接種于裸鼠皮下，每4天測量一次皮下腫瘤的生長情況，至第28天結(jié)束觀察測量。三組裸鼠皮下移植瘤生長情況與各組細胞在培養(yǎng)皿中的增殖情況一致（圖2c），至第28天取出裸鼠皮下移植瘤，Ad5轉(zhuǎn)染組皮下移植瘤的平均體積最大、平均質(zhì)量最大，Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組皮下移植瘤的平均體積最小、平均質(zhì)量最小，Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組的皮下移植瘤的平均體積和平均質(zhì)量均居中；三組裸鼠28日皮下移植瘤腫瘤質(zhì)量存在顯著性差異（F=59.825，P=0.000；圖2B、圖2D和表1）。三組裸鼠皮下移植瘤腫瘤質(zhì)量SNK法進行組間比較顯示，每兩個比較組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.000）。

表11 三組裸鼠模型第2828天時皮下移植瘤質(zhì)量比較

2.3 Ad 5-SOCS3轉(zhuǎn)染及干預(yù)對HI F-1α和PYK2表達的影響

2 2..3.1 轉(zhuǎn)染SOCS3后HI F-1α和PYK2表達的比較 在未轉(zhuǎn)染SOCS3和（或）HIF-1α的小細胞肺癌細胞株（Ad5轉(zhuǎn)染組）中，HIF-1α、PYK2及其磷酸化活性形式Tyr402的表達情況如圖3第1泳道所示。與第1泳道相比，Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組（圖3第2泳道）、Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組（圖3第4泳道）中HIF-1α的表達水平明顯下降，其中SOCS3轉(zhuǎn)染組HIF-1α的表達水平下降最明顯，Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組HIF-1α的表達水平明顯高于Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均p＜0.05）。Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組和 Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組的PYK2和Tyr402表達水平基本一致，但均明顯低于未轉(zhuǎn)染組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均p＜0.05）。

22..3.2特異性干預(yù)對HIF-1α和Tyr Tyr 402402表達的影響 PYK2特異性小干擾組（siPYK2組，圖3第3泳道）的HIF-1α表達水平明顯低于未轉(zhuǎn)染組，且Tyr402的表達水平同樣低于未轉(zhuǎn)染組。

3 討論

SOCS3是SOCS家族成員之一，能夠阻斷細胞因子應(yīng)答并負反饋調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的信號通路，在抑制細胞過度增殖、誘導(dǎo)凋亡、維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用[14-15]。SOCS3在多種腫瘤中的表達均下調(diào)，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。據(jù)推測，SOCS3表達上調(diào)可能參與某些腫瘤細胞對腫瘤生長抑制因子的應(yīng)答。在本研究中，與未轉(zhuǎn)染Ad5-SOCS3的情況相比，Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染后，小細胞肺癌細胞株及其裸鼠皮下移植瘤的增長速率均下降，其中以Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組小細胞肺癌細胞株及其裸鼠皮下移植瘤的增殖速率明顯且低于Ad5轉(zhuǎn)染組和Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組，而Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染對細胞株和皮下移植瘤的影響較小。這提示Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染可削弱Ad5-SOCS3單獨轉(zhuǎn)染對細胞增殖的抑制作用。從第28天移植瘤質(zhì)量的比較來看，Ad5-SOCS3單獨轉(zhuǎn)染組的移植瘤質(zhì)量明顯小于Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組的，而共轉(zhuǎn)染組的移植瘤質(zhì)量又明顯小于Ad5轉(zhuǎn)染組的。這提示SOCS3基因?qū)π〖毎伟┘毎闚CI-H446中PYK2介導(dǎo)的HIF-1α的信號通路及細胞增殖有負性調(diào)控作用，且Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染或siPYK2技術(shù)僅可在一定程度上抑制這種負性調(diào)控，使HIF-1α的表達較Ad5-SOCS3單獨轉(zhuǎn)染時升高，但其表達無法達到未轉(zhuǎn)染SOCS3時的水平。因此，SOCS3基因有可能成為小細胞肺癌基因治療的一個新的靶點。

PYK是一種非受體酪氨酸激酶，在細胞內(nèi)分布廣泛，與細胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)通路及其生物學(xué)功能密切相關(guān)，調(diào)節(jié)細胞存活、增殖和遷移。PYK2信號通路的活化能夠增強細胞運動并促進細胞在非錨定狀態(tài)下的存活[16]。多項研究發(fā)現(xiàn)，高侵襲性腫瘤細胞存在PYK2蛋白表達上調(diào)和（或）活性增強的現(xiàn)象。目前，對PYK2的研究主要集中在病理生理過程中其多個磷酸化位點活性的變化及其對下游靶蛋白磷酸化作用的方面。其中，酪氨酸402位點（Tyr402）是PYK2最重要的自身磷酸化位點，為PYK2活化和功能所必需，其磷酸化后可以增強乳腺癌細胞的侵襲和遷移能力，可能在促進腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有重要作用。對肝癌組織的研究顯示，PYK2高表達者多為晚期肝癌患者，而動物實驗顯示PYK2過表達可見于侵襲邊緣的腫瘤細胞和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中[17]。雖然PYK2廣泛表達于正常胃黏膜，但其在胃癌組織中的表達顯著降低，且胃癌組織學(xué)分級和TNM分期越高PYK2表達就越低。這表明PYK2蛋白在不同腫瘤中的表達情況并不相同，對不同腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用可能也不同。對肺癌的研究顯示，PYK2是參與懸浮生長肺腺癌細胞的生存和神經(jīng)肽誘導(dǎo)的小細胞肺癌細胞增殖信號通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子。

越來越多的研究顯示PYK2對多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展均具有非常重要的作用。在轉(zhuǎn)移性和侵襲性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤和肝癌細胞中PYK2的表達顯著增強。侵襲性乳腺癌細胞和小細胞肺癌細胞中均可檢測到PYK2蛋白Tyr402位點的磷酸化，而且PYK2相關(guān)途徑的活化參與人類腫瘤細胞黏附能力的上調(diào)。盡管已有大量關(guān)于PYK2下游信號通路的研究，但是有關(guān)PYK2的調(diào)節(jié)機制目前尚不明確。在我們的研究中，與未轉(zhuǎn)染SOCS3的細胞相比，Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染細胞中PYK2的表達水平及Tyr402的表達水平均明顯下降，其效果與si-PYK2技術(shù)產(chǎn)生的效果相同，提示SOCS3蛋白可能具有負性調(diào)節(jié)PYK2表達的作用，可能是PYK2信號通路中非常重要的負性調(diào)節(jié)因子。

不過，SOCS3與PYK2間的相互作用是否通過磷酸化的Tyr402位點以及SOCS3對PYK2下游與細胞遷移相關(guān)的細胞骨架蛋白的調(diào)節(jié)是否與肺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)等問題均仍需進一步驗證。

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