呂夕超，葉超，紀(jì)絲保，周陽強，李昂

（福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

通過CHD基因鑒定信鴿性別

呂夕超，葉超，紀(jì)絲保，周陽強，李昂*

（福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

本試驗采用羽毛樣本成功提取了信鴿基因組DNA，然后利用引物對2550F/2718R對其基因的特異性片段進(jìn)行擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，雌性信鴿有2條帶，分別在400 bp與600 bp左右，雄性僅有1條帶，在400 bp左右。而后利用此方法，對600只性別未知的信鴿進(jìn)行了性別鑒定，其中雄性信鴿358只，雌性信鴿242只，準(zhǔn)確率達(dá)到100%，結(jié)果表明：本試驗的分子生物學(xué)方法可用于鑒別信鴿性別，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益，在生產(chǎn)管理上有廣闊的應(yīng)用前景。

信鴿；性別鑒定基因；PCR技術(shù)

信鴿是一種單態(tài)性鳥,是典型的“一夫一妻制”,不利于產(chǎn)業(yè)化飼養(yǎng)管理與繁殖育種。近年來,隨著養(yǎng)鴿業(yè)的迅猛發(fā)展,國內(nèi)外學(xué)者也熱衷于養(yǎng)鴿的研究,但在分子領(lǐng)域的研究很少,又主要集中在肉鴿性別鑒定,關(guān)于信鴿性別鑒定的研究更是空白。利用分子手段對信鴿進(jìn)行性別鑒定,與其他方法相比如翻肛鑒別、腹腔鏡檢、糞便類固醇檢測以及核型分析,具有準(zhǔn)確性高、簡便、成本低、對動物傷害較小等優(yōu)點［3］,并對降低飼養(yǎng)成本、提高經(jīng)濟效益、推動信鴿產(chǎn)業(yè)化具有十分重要的意義。

本試驗采用羽毛樣本提取信鴿基因組DNA,利用引物對2550F/2718R擴增基因的特異性片段,以鑒定信鴿性別,達(dá)到淘汰非目的性別,降低飼養(yǎng)成本,提高經(jīng)濟效益的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的采集試驗動物為福建閩侯旗翔生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司培育的信鴿。選取已配對成功的30只雄性與30只雌性信鴿,每只拔取翅膀或尾部帶有毛囊的新生羽毛5根,用于確定信鴿性別鑒定方法的可靠性。另隨機選擇600只28日齡性別未知的健康信鴿,同樣每只拔取翅膀或尾部帶有毛囊的新生羽毛5根,用于鑒別其性別。

1.2 試驗方法

1.2.1 信鴿羽毛基因組DNA的提取每只試驗鴿拔取翅膀或尾部帶毛囊的新生羽毛5根,剪下羽毛根部約1 cm；用70%乙醇浸洗,蒸餾水沖洗,室溫下干燥；用剪刀盡量將帶毛囊的毛根剪碎；將剪碎的羽毛放入研缽中,加入液氮迅速研碎；將研碎的羽毛移入離心管中,加入DTT 10 μL、1×SET 450 μL、20 mg/mL蛋白酶K 20 μL、10%SDS 50 μL；顛倒混勻,56℃水浴振蕩過夜；等體積的飽合酚和氯仿各抽提2次, 12 000 r/min離心10 min,小心吸取上層粘稠水相移至另一離心管中；加入等體積酚、氯仿、異戊醇(24∶23∶1)混合液,上、下顛倒混勻10 min,12 000 r/min離心12 min,吸取上層粘稠水相移至另一離心管中；加入1/5體積3 mol/L醋酸鈉與2倍體積預(yù)冷的無水乙醇,橫向劇烈振蕩3 min,10 000 r/min離心10 min,管底可見白色DNA沉淀；加入70%乙醇1 mL洗滌DNA,8 000 r/min離心5 min,倒掉乙醇,將離心管倒置于濾紙上,揮發(fā)殘留乙醇；加30～50 μL TE溶液溶解DNA,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA的濃度測定和質(zhì)量檢測信鴿基因組DNA提取完成后,使用紫外分光光度計測定DNA的濃度,并記錄OD260/OD280比值。同時,采用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測提取的信鴿基因組DNA片段大小。

1.2.3 引物的設(shè)計與合成根據(jù)Griffiths等［1］與Fridolfsson等［2］的研究成果,選擇利用以下2對引物分別對鴿子性別基因進(jìn)行特異性擴增,引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

引物對1：2550 F：5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′2718 R：5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′

引物對2：P2 F：5′-TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3′P8 R：5′-CTCCCAAGGATGATRAAYTG-3′

1.2.4 PCR擴增反應(yīng)體系為20 μL體系：模板1 μL,上、下游引物各0.5 μL,Mix 10 μL,滅菌去離子水8 μL。反應(yīng)程序:94.0℃5 min,94.0℃30 s, 51.0℃45 s,72.0℃45 s,39個循環(huán),72.0℃8 min,4℃保存。

1.2.5 PCR產(chǎn)物檢測吸取5 μL PCR擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠成像系統(tǒng)檢測電泳結(jié)果,并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 信鴿基因組提取結(jié)果

2.1.1 DNA濃度與純度紫外分光光度檢測用紫外分光光度計對信鴿基因組DNA樣品的濃度和純度進(jìn)行了檢測,OD260/OD280結(jié)果介于1.8～2.0,說明提取的信鴿基因組DNA的純度較高,可用于PCR擴增。

2.1.2 DNA質(zhì)量的瓊脂糖凝膠電泳檢測將所提取的信鴿基因組DNA用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。如圖1所示,所有基因組DNA均呈現(xiàn)致密亮帶,沒有發(fā)生降解,表明所提DNA質(zhì)量很好,可用于PCR擴增。

圖1 DNA質(zhì)量的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 雄性與雌性信鴿PCR擴增結(jié)果信鴿基因組DNA用2550F/2718R引物對進(jìn)行PCR擴增后,擴增產(chǎn)物的聚丙烯酸胺凝膠電泳結(jié)果見下圖2。

由圖2可看到,信鴿的基因組DNA用2550F/2718R引物對進(jìn)行PCR擴增后,雄性PCR產(chǎn)物有1條亮帶,片段長約400 bp左右,而雌性PCR產(chǎn)物有2條亮帶,1條片段長約600 bp左右,另1條片段長與雄性條帶一樣,約400 bp左右。

圖2 雌性與雄性信鴿的PCR擴增結(jié)果

而信鴿的基因組DNA用P2F/P8R引物對進(jìn)行PCR擴增后,擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果未能區(qū)分出信鴿性別。因此,在后續(xù)試驗PCR擴增時,均利用2550F/2718R引物對擴增性別未知的信鴿基因組DNA。

2.3 性別未知的信鴿PCR擴增結(jié)果用上述方法對600只隨機選擇、性別未知的信鴿提取基因組DNA,而后用2550F/2718R引物對進(jìn)行PCR擴增,擴增產(chǎn)物直接用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定(圖3)。

圖3 性別未知的信鴿PCR擴增結(jié)果

由圖3可以看出,1、4、7、8、9、10泳道有2條亮帶,片段長分別約400 bp左右與600 bp左右,鑒定為雌性,2、3、5、6泳道有1條亮帶,片段長約400 bp左右,則鑒定為雄性。

3 討論

3.1 信鴿羽毛樣本提取DNA進(jìn)行分子生物學(xué)試驗一般需要提取動物基因組DNA,而試驗中最為普遍的是從動物血液或組織中提取基因組DNA,這樣或多或少會對動物造成應(yīng)激,產(chǎn)生傷害?，F(xiàn)在很多學(xué)者通過動物毛發(fā)、糞便等樣品提取DNA,對取樣動物基本無傷害,并解決了小動物因個體小、血管細(xì)而采血困難等問題,簡省了采血器具、消毒及抗凝等試劑,得到越來越多的認(rèn)可。國內(nèi)外有很多用羽毛提取動物基因組DNA的報道。Horvath等［4］和Leeton等［5］均從博物館標(biāo)本的羽毛凝塊中成功提取到DNA,可用于進(jìn)行遺傳分析。Bello等［6］報道了一種快速準(zhǔn)確的提取方法,可從120個品種的800多種鳥類羽毛中提取到高質(zhì)量的基因組。胡飛等［7］用2根次級飛羽成功提取出基因組DNA,進(jìn)行PCR擴增后,利用EE0.6基因有效鑒定了焦冠鶴的性別；Alipanah等［8］從非洲鴕鳥的羽毛中順利提取到基因組DNA,經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測認(rèn)為質(zhì)量較高。蓋玉林等［9］利用羽毛提取DNA,采用PCR的方法,確立了畫眉鳥和紅嘴相思鳥的快速性別鑒定體系。

本試驗結(jié)果顯示,用羽毛提取基因組DNA完全可以滿足鴿子性別鑒定及其他分子生物學(xué)研究的要求,進(jìn)行后續(xù)試驗分析。但采樣時需要注意的是,應(yīng)拔取翅膀或尾部新生的羽毛,且必須帶有毛囊,這樣提取的DNA量大、質(zhì)量較高。為保證DNA的提取效果,并盡量減少對試驗鴿子的應(yīng)激,可選擇在鴿子秋冬換羽時期拔取羽毛,2～3根便可得到PCR擴增需要的模板量。因羽毛外部都包被著角質(zhì)層,性質(zhì)穩(wěn)定,難以裂解。在提取DNA時,需要加入二硫蘇糖醇(DTT)或巰基乙醇以破壞角質(zhì)層中的二硫鍵,有利于羽毛樣品的消化裂解。為了獲得量大質(zhì)優(yōu)的DNA,本試驗拔取了5根帶毛囊的新生羽毛,以保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 利用CHD基因鑒定信鴿性別CHD基因被Griffiths等［1］發(fā)現(xiàn),其進(jìn)化速率慢,對于鳥類非常保守,隨后此基因被廣泛用于非平胸類鳥類性別分子鑒定。至今,許多學(xué)者都應(yīng)用CHD基因成功地對非平胸鳥類性別進(jìn)行鑒定,過程簡單,結(jié)果可靠。Griffiths等［10-11］分別設(shè)計并利用P2/P3與P2/P8引物對準(zhǔn)確鑒定出了約30種鳥類的性別；Sacchi等［12］利用P2/P8引物對擴增了短趾雕(Circaetus gallicus)的CHD基因并進(jìn)行了酶切,對其性別進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定；Cerit等［13］通過特異性擴增CHD基因,并分析擴增結(jié)果,成功對雞尾鸚鵡(Nymphicus hollandicus)進(jìn)行了性別鑒定。陳宇科等［14］通過采用PCR方法,選定特殊的性別CHD1基因及鑒定引物,克隆出雛鴿特定性別基因序列鑒定雛鴿的雌雄。陳蓉等［15］利用引物(2550F/2718R)對美洲紅鹮和火烈鳥的CHD基因進(jìn)行PCR擴增,快速準(zhǔn)確地鑒定出這兩種鳥類的性別。

本研究利用P2/P8引物對和2550F/2718R引物對分別對性別已知的雌雄信鴿基因組DNA的CHD基因進(jìn)行PCR擴增,結(jié)果顯示2550F/2718R引物對的擴增結(jié)果更加穩(wěn)定,重復(fù)性高,并且擴增產(chǎn)物片段較小,小片段在PCR反應(yīng)中更占優(yōu)勢,可提高性別鑒定的精確程度,這與胡飛等［7］的研究結(jié)果一致。因此在鑒別未知性別信鴿時,全部利用2550F/2718R引物對對CHD基因進(jìn)行PCR擴增。2550F/2718R引物對的擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示,雌性有2條帶,分別在400 bp與600 bp左右,雄性只有1條帶,在400 bp左右,研究結(jié)果與田秀華等［16］對7種鶴形目鳥類的性別鑒定結(jié)果及劉鑄等［17］對東方白鸛性別鑒定的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本試驗采用羽毛樣本提取信鴿基因組DNA,利用引物對2550F/2718R對其CHD基因的特異性片段進(jìn)行擴增,結(jié)果表現(xiàn)出的性別差異可作為信鴿性別鑒定的依據(jù)。而后利用此方法,對600只性別未知的信鴿進(jìn)行了性別鑒定,其中雄性信鴿358只,雌性信鴿242只,準(zhǔn)確率達(dá)到100%,證明本試驗的分子生物學(xué)方法有利于快速、準(zhǔn)確、大量檢測鑒定信鴿雌雄,從而便于信鴿規(guī)?；曫B(yǎng)管理,提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益,在生產(chǎn)管理上有廣闊的應(yīng)用前景。

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Sex Identification of Pigeon by Detecting CHD Gene

LV Xi-chao,YE Chao,JI Si-bao,ZHOU Yang-qiang,LI Ang*
（Department of Animal Science,Fujian Agriculture And Forestry University,Fujian Fuzhou 350002,China）

The primer pairs（2550F/2718R）was desgned and polymerase chain reaction（PCR）technique to amplificate the segments of CHD gene to identificate pigeon's sex using a DNA sample which was extracted from feather pulps. Results showed that a DNA fragment（about 400 bp）was amplified from male pigeons,and two DNA fragments（about 400 bp and 600 bp）were amplified from the female.Then 600 unknown sex samples were successfully identified by this PCR technique（358 females and 242 males）.This technique is useful in the economic and the management of pigeon production.

pigeon；sex determination；CHD gene；PCR technique

S836.2

A

0258-7033（2015）09-0012-04

2014-10-29；

2014-12-05

信鴿產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用（k08112002A）

呂夕超（1986-），男，陜西西安人，碩士，E-mail：lvxichao1986@163.com

*通訊作者：李昂（1964-），男，教授，E-mail：poul@fafu.edu.cn