劉夢鶴，李捷鑫，田樹軍，2*，蘇文龍，孟娜娜，王寒陽，李俊杰，2，孫樹春，2

（1.河北農業(yè)大學動物科技學院，河北保定071000；2.河北省牛羊胚胎工程技術研究中心，河北保定071000）

卵母細胞體外成熟過程中CTSB、CTSS和caspase 3活性與表達量的變化

劉夢鶴1，李捷鑫1，田樹軍1，2*，蘇文龍1，孟娜娜1，王寒陽1，李俊杰1，2，孫樹春1，2

（1.河北農業(yè)大學動物科技學院，河北保定071000；2.河北省牛羊胚胎工程技術研究中心，河北保定071000）

CTSB、CTSS和caspase 3對細胞凋亡具有重要作用，其活性和蛋白表達量可反映細胞內、外環(huán)境對卵母細胞的凋亡刺激。本研究利用雙夾心ELISA方法測定綿羊卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3在IVM 0、8、16、24 h的活性與蛋白表達量，研究其在IVM過程中的變化、與卵母細胞質量的相關性及E-64對其產生的影響。結果表明：質量差組卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3活性與CTSB蛋白表達量均極顯著高于正常質量組（P＜0.01）；CTSB、CTSS活性和蛋白表達量在IVM過程中無顯著變化（P＞0.05），caspase 3活性呈現先降低后升高的趨勢，蛋白表達量無顯著變化（P＞0.05）；5 μmol/L和10 μmol/L E-64顯著或極顯著降低了CTSB、CTSS和caspase 3活性（P＜0.05 or P＜0.01），10 μmol/L E-64顯著提高了CTSB蛋白表達量（P＜0.05）。結果顯示，CTSB、CTSS和caspase 3的活性及CTSB蛋白表達量與卵母細胞質量呈負相關，E-64可降低CTSB、CTSS和caspase 3活性，并提高CTSB蛋白表達量。

綿羊；卵母細胞；組織蛋白酶；caspase 3；ELISA

組織蛋白酶B、S(CTSB、CTSS)屬于溶酶體內半胱氨酸蛋白酶家族中的成員,通過激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(caspase)3開啟凋亡通路［1］。CTSB普遍存在于哺乳動物細胞中［2］,主要分解細胞內蛋白［3］；CTSS僅存在于與其功能有關的主要組織相容性復合體中［4］,對細胞外高分子物質如層茹連蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白進行分解［5］,在細胞凋亡和胚胎附植上發(fā)揮重要作用［6-7］。E-64(L-反-環(huán)氧琥珀酸-L-亮酸胺4-胍丁烷)作為一種組織蛋白酶抑制劑,可有效抑制組織蛋白酶B活性［8］。

有研究表明,在牛卵丘中和卵母細胞內,CTSB、CTSS mRNA表達量均與卵母細胞發(fā)育能力呈負相關［9-10］。Balboula等［11-12］發(fā)現,牛卵母細胞和胚胎中CTSB活性和表達量均與卵母細胞和胚胎的質量呈負相關,當卵母細胞受到凋亡刺激后,caspase 3的活性和表達量會顯著升高［13］。劉志濤等［14］報道,綿羊卵母細胞體外成熟液中添加E-64可降低CTSB和CTSS mRNA表達量,提高卵母細胞后續(xù)發(fā)育能力；Balboula等［11-12］報道,E-64可降低牛卵丘細胞和胚胎細胞的凋亡率。本研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定綿羊卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3的活性和蛋白表達量,探究這三種酶的活性和蛋白表達量與卵母細胞質量間的關系、體外成熟(IVM)過程中的變化及E-64對其產生的影響,為提高卵母細胞體外發(fā)育能力提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料試驗所用綿羊卵巢采集于河北唐縣屠宰場,離體卵巢獲得后立即被放入30℃、青霉素和鏈霉素濃度均為100 IU/mL的生理鹽水中,并在2～3 h內運回實驗室。

1.2 試驗試劑以下試劑若無特殊說明,均購自

Sigma aldrich公司。

卵母細胞成熟液：TCM199+100 mol/L半胱氨酸+10 g/mL促卵泡素(Bioniche,Canada)+10 g/mL促黃體素(Bioniche,Canada)+1 g/mL雌二醇+10%胎牛血清(Gibco)。

采卵液：TCM199(Gibco)+5 mmol/L NaHCO3+ 10 mmol/L Hepes+10 mmol/L Hepes-Na+0.01 g/L肝素鈉+10 mL/L胎牛血清(Gibco)+0.025 g/L青霉素+ 0.025 g/L鏈霉素。

1.3 卵丘卵母細胞復合體(COCs)的收集將綿羊卵巢移入燒杯,用38.5℃生理鹽水沖洗3～5次,置于水浴鍋內。將卵巢置于放有采卵液的培養(yǎng)皿中,選取卵巢上直徑為2～6 mm的卵泡用刀片進行切割。利用口吸管在顯微鏡下收集COCs。挑選形態(tài)正常、卵丘細胞不少于3層的COCs作為正常質量組；胞質不均勻、無或僅有少量卵丘細胞包匣的卵母細胞作為質量差組。

1.4 卵母細胞體外成熟將COCs分別移入E-64濃度分別為0、5、10 μmol/L的熟液滴中,微滴體積為100 μL置于38.5℃、飽和濕度和5%CO2的條件下進行體外成熟。

1.5 樣品收集在IVM 0、8、16、24 h收集正常質量組中的卵母細胞,IVM 24 h收集質量差組中的卵母細胞。將COCs置于PVA含量為1 g/L的DPBS(Gibco)中并移入1.5 mL離心管,用移液槍反復吹打,直至卵丘細胞從卵母細胞上完全脫離,用DPBS洗3遍,最終移入200 μL離心管中,每個離心管中含50個卵母細胞。每組樣品均進行3次重復采樣。

1.6 樣品裂解用移液槍測量保存樣品的200 μL離心管中液體體積,加入DPBS,使離心管中液體總體積均為70 μL,并用超聲波勻漿儀對樣品進行裂解。

1.7 ELISA利用測定CTSB、CTSS和caspase 3活性或蛋白表達量的6種雙夾心ELISA試劑盒(慧穎應用生物科技公司),分別對裂解液中的6個指標進行測定,按照說明書進行操作在酶標包被板上設10個標準品孔,按照說明書將標準品稀釋成5個濃度梯度,每個濃度梯度的標準品占2個孔,每個加樣孔加樣量為50 μL；每個待測樣品孔加入10 μL裂解液,40 μL樣品稀釋液,37℃溫育30 min后,棄去液體,在每個加樣孔加滿洗滌液,30 s后棄去洗滌液,并重復5次；向加樣孔加入50 μL酶標試劑,利用上述方法溫育和洗滌后,每個加樣孔依次加入顯色劑A和顯色劑B各50 μL,37℃避光顯色15 min；向每個加樣孔加入50 μL終止液,15 min后在酶標儀中以450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)；最后利用標準品的OD值繪制標準曲線,利用樣品OD值計算樣品中CTSB、CTSS和caspase 3的活性和蛋白表達量。

1.8 統(tǒng)計分析試驗結果利用SPSS 17.0進行One-Wway ANOVA分析及Ducan′s檢驗,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著,P＞0.05表示差異不顯著,結果均以平均值±標準誤表示。

2 結果

2.1 不同質量卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3活性和蛋白表達量的比較由表1可以看出,體外成熟24 h后,質量差的卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3活性均極顯著高于質量正常的卵母細胞(P＜0.01),而在3種酶蛋白表達量上的對比表明,2種卵母細胞僅在CTSB蛋白表達量上存在極顯著差異(P＜0.01)。

表1 不同質量卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3酶活性及蛋白表達量對比

2.2 E-64對卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3活性變化的影響不同濃度E-64對卵母細胞內CTSB活性變化的影響如表2所示。對照組卵母細胞于IVM 0、8、16、24 h CTSB活性保持穩(wěn)定(P＞0.05)；5 μmol/L E-64組,CTSB活性僅在IVM 8 h時顯著低于IVM 0 h組和對照組中卵母細胞內CTSB活性(P＜0.05)；10 μmol/L E-64組在體外成熟過程中一直顯著或極顯著低于0 h組和對照組(P＜0.05或P＜0.01)。5 μmol/L E-64組和10 μmol/L E-64組之間無顯著差異(P＞0.05)。

由表3可知,對照組卵母細胞內CTSS活性無顯著變化(P＞0.05)。E-64試驗組中CTSS活性呈下降趨勢,其中5 μmol/L E-64組中CTSS活性僅在體在IVM 24 h時顯著低于對照組(P＜0.05)；10 μmol/L E-64組中CTSS活性在IVM 8 h和24 h顯著或極顯著低于對照組(P＜0.05或P＜0.01),而在IVM 16 h與對照組無顯著差異(P＞0.05)；10 μmol/L E-64組在IVM 24 h時顯著低于5 μmol/L E-64組(P＜0.05)。

由表4可知,在IVM過程中,卵母細胞內caspase 3活性呈先降低后升高的趨勢,IVM 8 h除對照組卵母細胞內caspase 3活性與IVM 0 h組無顯著差異(P＞0.05)外,各E-64試驗組中caspase 3活性均顯著或極顯著低于(P＜0.05、P＜0.01)IVM 0 h組,并且IVM 24 h時各組卵母細胞內caspase 3活性均顯著或極顯著(P＜0.05、P＜0.01)高于IVM 8 h。10 μmol/L E-64組中caspase 3活性均顯著低于對照組(P＜0.05),5 μmol/L E-64組與對照組和10 μmol/L E-64組無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 E-64對卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3蛋白表達量的影響E-64對卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3蛋白表達量的影響如表5、6、7所示,IVM過程中卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3蛋白表達量無顯著變化(P＞0.05)；5 μmol/L和10 μmol/L E-64對卵母細胞內CTSS和caspase 3蛋白表達量無顯著影響(P＞0.05)；10 μmol/L E-64組中CTSB蛋白表達量在IVM 24 h時顯著高于IVM 0 h和8 h(P＜0.05),且顯著高于(P＜0.05)IVM 24 h對照組內CTSB蛋白表達量。

表2 不同濃度E-64對卵母細胞內CTSB活性的影響IU·L-1

表3 不同濃度E-64對卵母細胞內CTSS活性的影響IU·L-1

3 討論

3.1 不同質量卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3活性及蛋白表達量的差異CTSB和CTSS在凋亡信號傳導上具有重要作用,caspase 3的活化發(fā)生在凋亡早期。組織蛋白酶介導凋亡的過程中,組織蛋白酶會從溶酶體中釋放出來,促使線粒體中細胞色素C進行釋放,激活caspase 9,最后激活caspase 3,繼而開啟凋亡通路［15］。Balboula［11,13］在牛卵母細胞上的研究表明,質量差的卵母細胞內CTSB活性和蛋白表達量高于質量正常的卵母細胞,并且在體外成熟過程中,利用熱應激對卵母細胞給予凋亡刺激后,CTSB和caspase 3的活性和蛋白表達量均會顯著升高。質量差的卵母細胞周匣缺少卵丘細胞,因此更容易受到活性氧等因素引起的凋亡刺激［16］。本試驗結果表明,在IVM 24 h時,質量差卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3活性均極顯著高于質量正常的卵母細胞,與Balboula［11,13］的研究結果一致,由此可推斷,在體外成熟過程中,質量差組中的卵母細胞受到了較正常質量組更高水平的凋亡刺激。然而蛋白表達量的測定結果表明,只有CTSB蛋白表達量與卵母細胞質量呈負相關性,與Balboula等［13］結果不一致,因此質量差組中的卵母細胞在體外成熟過程中所受到的凋亡刺激,在種類或程度上不同于熱應激產生的凋亡刺激,同時,相較于CTSS和caspase 3,CTSB在凋亡過程中起到了更為重要的作用。

表4 不同濃度E-64對卵母細胞內caspase 3活性的影響IU·L-1

表5 不同濃度E-64對卵母細胞內CTSB蛋白表達量的影響pg·mL-1

表6 不同濃度E-64對卵母細胞內CTSS蛋白表達量的影響pg·mL-1

表7 不同濃度E-64對卵母細胞內caspase 3蛋白表達量的影響ng·mL-1

3.2 E-64對卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3活性變化和蛋白表達量的影響E-64作為特異性組織蛋白酶抑制劑,僅對CTSB、CTSH(組織蛋白酶H)和CTSL(組織蛋白酶L)活性產生抑制作用［13］。卵母細胞在IVM 0、8、16 h和24 h分別處于GV期(生發(fā)泡期)、GVBD期(生發(fā)泡破裂期)、MⅠ期(第1次減數分裂中期)和MⅡ期(第2次減數分裂中期),因此這4個時間點能較為準確地反映CTSB、CTSS和caspase 3在體外成熟過程中的變化。然而結果表明,E-64組中CTSB、CTSS和caspase 3的活性均有所降低,因此CTSB、CTSS和caspase 3的活性之間可能存在聯(lián)系。當細胞受到凋亡刺激后,CTSB和CTSS從溶酶體中釋放出來,最終活化caspase 3,開啟凋亡通路［15］。因此當CTSB活性受到抑制后,caspase 3活性也會隨之降低。CTSS活性的降低表明E-64組中卵母細胞受到較對照組中卵母細胞更低的凋亡刺激,由于CTSB對細胞內蛋白分解上具有重要作用［2］,并且E-64組中CTSB和caspase 3活性均呈現先降低后升高的趨勢,因此推斷,在離體卵巢運輸和卵母細胞收集過程中,外界對卵母細胞產生的凋亡刺激促使CTSB從溶酶體中釋放出來,除傳導凋亡信號外,CTSB還對細胞內蛋白進行分解,而其中部分蛋白分解過程是不必要的,由此對卵母細胞產生了來自于細胞內的凋亡刺激,因此當CTSB活性受到抑制后,來自于細胞內的凋亡刺激減弱,CTSS的活性也隨之降低。

Bettegowda等［9］研究表明,10 μmol/L E-64組中卵丘細胞凋亡率顯著低于1 μmol/L E-64組,但兩試驗組在囊胚率上沒有差異。劉志濤等［14］發(fā)現,5、10 μmol/L E-64可顯著降低卵丘細胞內CTSB和CTSS基因表達量,并提高囊胚發(fā)育率,但是兩試驗組之間無顯著差異。本研究結果顯示,10 μmol/L E-64組中卵母細胞內CTSB活性與5 μmol/L E-64組無差異,蛋白表達量顯著高于對照組,表明過度抑制CTSB活性會刺激CTSB的表達。因此推斷,體外成熟過程中卵母細胞內CTSB活性須保持在一定水平以上,使其在除傳導凋亡信號的其他生理活動中發(fā)揮作用或在體外成熟后作為母源物質積累,因此10 μmol/L或更高濃度的E-64不但不會繼續(xù)提高卵母細胞的發(fā)育能力,還可能會影響其正常生理活動產生。

4 結論

綿羊卵母細胞在體外成熟過程中,CTSB、CTSS和caspase 3蛋白表達量保持穩(wěn)定,CTSB和CTSS活性沒有顯著變化,caspase 3活性呈先降低后升高的趨勢。CTSB、CTSS和caspase 3活性及CTSB蛋白表達量與體外成熟后卵母細胞質量呈負相關。成熟液中添加E-64可以降低卵母細胞內CTSB、CTSS和caspase 3的活性,10 μmol/L E-64可以提高卵母細胞內CTSB的蛋白表達量。

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Changes of Activity and Protein Expression of CTSB，CTSS and caspase 3 in Oocytes During in vitro Maturation

LIU Meng-he1,LI Jie-xin1,TIAN Shu-jun1,2*,SU Wen-long1,MENG Na-na1,WANG Han-yang1, LI Jun-jie1,2,SUN Shu-chun1,2
（1.College of Animal Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Hebei Baoding 071000,China；2.Embryo Engineering and Technological Center of Cattle and Sheep,Hebei Baoding 071000,China）

CTSB,CTSS and caspase 3 pla y important role in apoptosis,and activities and protein expressions of them can reflect death signals induced by intracellular and extracellular environment.This study was aimed to discover changes of activities and protein expression of CTSB,CTSS and caspase 3 and the relation to the quality of oocytes through detecting activities and protein expressions of CTSB,CTSS and caspase 3 in sheep oocytes at IVM 0,8,16 h and 24 h.Double antibody sandwich ELISA method was undertaken to detect activities and protein expressions,the correlation with the quality of oocytes and the effect of E-64 on them.The results showed that activities of CTSB, CTSS and caspase 3 and the protein expressions in oocytes quality poor were very significantly high compared with the normal ones.There was no significant fluctuation（P＞0.05）of CTSB and CTSS activities during IVM time,at the same time,there were no significant changes（P＞0.05）in protein expressions either,but the activity of caspase 3 showed a significant fluctuation（P＜0.05）.Addition of 5 μmol/L and 10 μmol/L E-64 significantly and very significantly（P＜0.05,P＜0.01）decreased the activities of CTSB,CTSS and caspase 3,and 10 μmol/L E-64 increased the protein expressions of CTSB.According to the results,the activities of CTSB,CTSS and caspase 3 and the protein expression of CTSB were negatively correlated with the quality of oocytes,and the addition of E-64 can to decrease the activities of CTSB,CTSS and caspase 3 and increase the protein expressions of CTSB.

sheep；oocytes；cathepsins；caspase 3；ELISA

S826.3

A

0258-7033（2015）09-0021-05

2014-10-04；

2014-11-17

河北省自然科學基金（C2012204084）；國家科技支撐計劃（2011BAD19B02-6）

劉夢鶴（1989-），男，河北唐山人，碩士研究生，從事動物胚胎工程技術研究，E-mail：liumengheyouxiang@163.com

*通訊作者：田樹軍，男，教授，博導，E-mail：tsj7890@126.com