NaCl脅迫處理對(duì)豇豆幼苗抗氧化酶活性的影響

代其林　王金玲　馬明莉　呂旭才　郭翠　王勁　杜世章

摘要：主要研究150 mmol/L NaCl脅迫處理對(duì)豇豆（Vigna unguiculata Linn.）幼苗葉片抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，豇豆幼苗在受到NaCl脅迫后，其葉片內(nèi)可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量隨脅迫時(shí)間的延長均逐漸升高，脅迫12 h后，它們的含量都達(dá)到峰值；在150 mmol/L NaCl脅迫過程中，豇豆幼苗葉片的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等活性在0～12 h期間逐漸上升，12 h后其活性也均達(dá)到最高值；在12～48 h脅迫期間，3種抗氧化酶活性逐漸下降，但仍強(qiáng)于非鹽脅迫下的抗氧化酶活性。同時(shí)，對(duì)NaCl脅迫下這3種抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行熒光定量分析，結(jié)果表明，SOD和CAT 等2種抗氧化酶基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與脅迫期間內(nèi)相應(yīng)酶的活性變化一致，而POD基因表達(dá)在脅迫6 h后就已經(jīng)達(dá)到最大值，與其酶活性在12 h后達(dá)最大值是不一致的。分析結(jié)果表明，在鹽脅迫下NaCl誘導(dǎo)了SOD、POD、CAT等 3種酶基因的表達(dá)，抗氧化酶活性相應(yīng)增強(qiáng)，從而增強(qiáng)了豇豆幼苗應(yīng)對(duì)NaCl脅迫的能力，為鹽堿地培育豇豆作物具有一定指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：NaCl脅迫；豇豆幼苗；抗氧化酶；可溶性蛋白；脯氨酸；丙二醛；實(shí)時(shí)定量PCR

中圖分類號(hào)： S643.401 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0193-04

土壤鹽漬化是一個(gè)世界性的資源問題和生態(tài)問題，是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要環(huán)境因素。鹽漬土壤能通過水分脅迫、鹽分離子的生理毒害等作用對(duì)作物產(chǎn)生危害，因此能限制作物的生長、發(fā)育，甚至造成農(nóng)作物的減產(chǎn)或絕收。當(dāng)前，全球鹽堿地面積已達(dá)9.5億 hm2，中國有1億 hm2[1]。中國的鹽漬化土地主要分布在西北和華北地區(qū)，并有逐年擴(kuò)大的趨勢，而這些地區(qū)是我國主要的產(chǎn)糧地區(qū)，植物耐鹽研究已經(jīng)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

在正常狀態(tài)下，植物的光合作用和呼吸作用等代謝途徑都會(huì)產(chǎn)生電子，電子在質(zhì)膜上進(jìn)行傳遞時(shí)會(huì)不斷產(chǎn)生活性氧，這些活性氧包括超氧自由基（ O-2 · ）、羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）[2-7]。NaCl等鹽非生物脅迫過程中所產(chǎn)生的低濃度活性氧可作為信號(hào)分子在植物的氧化還原反應(yīng)中進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]，引起一系列的生理生化反應(yīng)，并產(chǎn)生一定的生理抗性。而中度和重度非生物脅迫都會(huì)使植物體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧，使植物體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫[9-12]，甚至?xí)?yán)重破壞細(xì)胞的穩(wěn)定性和正常的代謝，通常使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸受到氧化損傷，從而造成細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5，13-15]。同時(shí)，NaCl等鹽脅迫還會(huì)啟動(dòng)膜脂過氧化或膜脂脫脂作用，從而破壞膜結(jié)構(gòu)，使質(zhì)膜流動(dòng)性增大，電解質(zhì)滲出率增加，細(xì)胞內(nèi)代謝毒物 （如丙二醛、MDA等）積累增多[8，16-18]。因此，活性氧參與了植物光合作用的調(diào)節(jié)、脅迫應(yīng)答、病原反應(yīng)、程序性細(xì)胞死亡、激素調(diào)節(jié)以及植物的生長發(fā)育等生理生化反應(yīng)[5，19]。植物為了應(yīng)對(duì)活性氧所引起的氧化脅迫，在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了一個(gè)有效的抗氧化防御系統(tǒng)[20]，這個(gè)防御系統(tǒng)主要由超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等組成，其中SOD能清除超氧離子，POD能清除過氧化物，二者產(chǎn)生的過氧化氫由CAT轉(zhuǎn)化成氧氣和水，從而解除活性氧對(duì)植物的毒害作用[15，19，21]。因此，抗氧化酶系統(tǒng)是植物應(yīng)對(duì)氧化脅迫的一個(gè)重要反應(yīng)機(jī)制[11，21- 22]。

豇豆（Vigna unguiculata Linn.）屬于豆科豇豆屬，是中國重要的蔬菜作物，在整個(gè)生長發(fā)育期對(duì)鹽脅迫都很敏感。筆者發(fā)現(xiàn)，在0～250 mmol/L NaCl脅迫12 h后，豇豆幼苗葉片的可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、丙二醛含量以及抗氧化酶活性逐漸升高，在150 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值[18]。本研究選取豇豆作為研究對(duì)象，考察150 mmol/L NaCl脅迫處理下豇豆幼苗葉片抗氧化酶活性的變化，測定丙二醛（MDA）、脯氨酸含量的變化，初步探索豇豆幼苗葉片3種抗氧化酶基因在NaCl脅迫下基因表達(dá)水平的變化，以期為今后豇豆在鹽堿地栽培生產(chǎn)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

豇豆品種為翠寶198豇豆。該品種抗病性強(qiáng)，特耐高溫，具有分枝多、肉質(zhì)脆嫩、爽甜、纖維少、不易老化等特點(diǎn)。

1.2 種子預(yù)處理

將豇豆種子用1% NaClO溶液浸泡10 min，流水沖洗3～5次后吸脹12 h，于25 ℃的光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)24 h，再用蒸餾水清洗萌發(fā)的種子2～3次。將萌發(fā)一致的種子播種在已滅菌石英砂中，澆上MS營養(yǎng)液，置于人工培養(yǎng)室（25±1） ℃培養(yǎng)，每天補(bǔ)充水2次。待所有幼苗的第1對(duì)真葉全部展開時(shí)，選取長勢一致的幼苗，分成2組：（1）對(duì)照組，（2）NaCl等鹽脅迫試驗(yàn)組，每組重復(fù)3次。其中對(duì)照組直接用MS培養(yǎng)液澆灌，鹽脅迫試驗(yàn)組都用含150 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)液對(duì)其進(jìn)行鹽脅迫處理。然后分別在處理后0、6、12、24、48 h后取樣。每次取樣均取豇豆的第1對(duì)真葉為試驗(yàn)材料，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.3 葉片酶粗液的提取

稱取約0.5 g豇豆葉片組織于預(yù)冷的研缽中，加少量石英砂，2 mL （0.1 mol/L pH值6.8）的Tris-HCl緩沖液，在冰浴中研磨成勻漿，用2 mL緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液也轉(zhuǎn)至離心管中，在4 ℃下，4 000 r/min離心20 min。將離心管的上清液分裝于多個(gè)1.5 mL離心管中，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中。

1.4 分析與測定

可溶性蛋白質(zhì)含量的測定按照Lowry法[23]，用牛血清蛋白溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[24]；脯氨酸含量用茚三酮法[24]測定；用NBT光還原法測定超氧化物歧化酶的活性[25]；按Omran的方法測定過氧化物酶的活性[26]。而過氧化氫酶活性按Beers和Sizer的方法[27]進(jìn)行。endprint

1.5 抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)

用無DNA的RNA試劑盒（上海華瞬生物技術(shù)有限公司，W6711）提取豇豆幼苗葉片總RNA，然后把總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA （reverse-transcription Kit，TaKaRa，Japan）。用IQ5 Real-time PCR儀（Bio-Rad）和根據(jù)Two-step QuantiTect SYBR Green PCR Kit試驗(yàn)指南對(duì)POD、SOD、CAT基因進(jìn)行定量擴(kuò)增，用iCycler定量分析軟件（iCycler real-time detection system software，version 2.0）對(duì)基因的定量擴(kuò)增數(shù)據(jù)。用Primer 12 Express 2.0 （Applied Biosystems）軟件設(shè)計(jì)定量擴(kuò)增引物（SOD、POD和CAT基因的引物分別為：POD F（5′-GGCATGTATTATGTTTCGTGCGTCTC-3′）和R（5′-GCGTCACAACCATTGACAAAGCAG-3′）；SOD F（5′-GTTCAACGGCGGAGGTCA-3′）和R（5′-AACATCAATACCCACCAGAGGA-3′）；CAT F（5′-GAAGGTTTCGGCGTCCACA-3′）和R（5′-TTGGTCACATCAAGCGGGTC-3′）；以及內(nèi)參基因β-actin F（5′-ACTGTGCCAATCTACGAGGGTT-3′）和R（5′-TCTTACAATTTCCCGCTCTGCT-3′），其qRT-PCR產(chǎn)物長度為100～300 bp。用豇豆的β-actin管家基因來作為定量擴(kuò)增的內(nèi)參。所有的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增都重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫條件下豇豆幼苗葉片中總可溶性蛋白含量的變化

在NaCl等鹽非生物脅迫條件下，可溶性蛋白參與了植物細(xì)胞滲透勢的調(diào)節(jié)，較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的可溶性蛋白質(zhì)，有利于植物細(xì)胞維持較低的滲透勢，減少細(xì)胞內(nèi)水分和溶質(zhì)的流失[28]，從而減少鹽脅迫帶來的損壞。在150 mmol/L NaCl脅迫下，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長，可溶性蛋白含量逐漸增加（圖1），在脅迫12 h后，可溶性蛋白含量最高，為 819.812 μg/g，隨后又逐漸下降。而對(duì)照組在0～48 h內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量變化不大。

2.2 NaCl脅迫條件下豇豆幼苗葉片中丙二醛含量的變化

在逆境條件下，往往會(huì)發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛是其產(chǎn)物之一，通常利用它來作為脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)，表示細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱[29]）。豇豆幼苗在經(jīng)150 mmol/L NaCl脅迫后，豇豆葉片的丙二醛含量一直升高。在脅迫12 h后，豇豆幼苗葉片丙二醛含量達(dá)最高，然后逐漸下降（圖2）。表明在NaCl脅迫下，豇豆幼苗葉片通過提高丙二醛含量來抵御外界脅迫對(duì)膜脂流動(dòng)和穩(wěn)定性的影響。

2.3 NaCl脅迫條件下豇豆葉片中脯氨酸含量的變化

植物中游離脯氨酸具有較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力及保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，有助于維持低滲透壓提高植物對(duì)水分的吸收[30]。在150 mmol/L NaCl脅迫下，豇豆幼苗葉片的脯氨酸含量逐漸上升，在脅迫12 h時(shí)達(dá)到最大值，然后逐漸下降（圖3）。表明豇豆幼苗受到NaCl脅迫時(shí)，能夠通過增加脯氨酸含量來提高細(xì)胞滲透勢，從而提高豇豆抗性。

2.4 NaCl脅迫條件下豇豆葉片抗氧化酶活性的變化

在植物體內(nèi)的抗氧化防御體系中，POD、SOD、CAT等酶系是最重要的保護(hù)酶類。在NaCl脅迫下，清除活性氧的抗氧化酶活性發(fā)生明顯的變化，豇豆葉片中POD、SOD和CAT等酶系活性都不斷增強(qiáng)（圖4），在脅迫12 h后，活性均達(dá)到最大值，分別為61.475、28.965、125.863 U/（mg·min），然后又

逐漸減弱。說明在NaCl等鹽脅迫過程中，植物體通過增強(qiáng)其抗氧化酶的活性來清除活性氧，避免逆境脅迫對(duì)自身的不利影響。

2.5 NaCl脅迫條件下豇豆葉片中抗氧化酶基因相對(duì)表達(dá)的變化

為了研究植物鹽脅迫下的耐鹽機(jī)制，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法研究3個(gè)抗氧化物酶基因在NaCl脅迫下的表達(dá)（圖5）。在150 mmol/L NaCl 脅迫后，豇豆幼苗葉片POD、SOD、CAT基因的表達(dá)水平存在差異。其中，沒有用鹽處理的3種抗氧化酶基因有少量表達(dá)；在NaCl 脅迫后，豇豆幼苗葉片的POD、SOD、CAT等抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)水平都有不同程度的增強(qiáng)，3個(gè)基因的表達(dá)水平都增加，其中SOD、CAT基因在 NaCl脅迫12 h后達(dá)到最大水平，與其酶活性的變化趨勢一致，而POD基因在NaCl脅迫6 h后就達(dá)到最大表達(dá)水平，然后三者的表達(dá)量都開始下降。

3 結(jié)論與討論

植物遭受NaCl等鹽脅迫時(shí)，其體內(nèi)的生理生化特性發(fā)生巨大變化。植物光合作用和呼吸作用所產(chǎn)生的過多電子在傳遞過程中，產(chǎn)生大量的活性氧[31-32]，過量活性氧對(duì)植物產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化傷害，為了減輕或免于受到氧化傷害，植物啟動(dòng)了自身的防御系統(tǒng)，活性氧清除酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)，其中SOD、POD、CAT是清除活性氧酶系統(tǒng)中最重要的種酶類。它們可以相互作用，降解活性氧種類，其中超氧化自由基被SOD催化發(fā)生歧化反應(yīng)生成O2和H2O2，產(chǎn)生的H2O2再由POD、CAT分解[29]，從而減輕NaCl等非生物脅迫。本研究結(jié)果表明，在NaCl等鹽脅迫下，豇豆幼苗葉片中3種抗氧化酶的活性與植物抗氧化脅迫能力相關(guān)，它們活性高低可作為衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。豇豆幼苗在受到NaCl脅迫時(shí)，其SOD、POD、CAT活性都增強(qiáng)，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長，抗氧化酶均逐漸增加，三者酶活性12 h后最高，分別達(dá)到28.965、61.475、125.863 U/（mg·min）。盡管鹽脅迫使SOD、POD、CAT活性都有所增強(qiáng)，但鹽脅迫使細(xì)胞質(zhì)膜處于氧化狀態(tài)而受到損害，所以隨著鹽脅迫的進(jìn)行，脯氨酸和MDA含量增加，質(zhì)膜受損傷程度也逐漸加重。鹽脅迫下豇豆幼苗葉片抗氧化物酶基因的表達(dá)都發(fā)生了變化，在沒有NaCl處理時(shí)豇豆葉片POD、SOD、CAT基因都有微量表達(dá)，在150 mmol/L NaCl脅迫后，3種抗氧化酶基因表達(dá)都增加。POD基因表達(dá)量在脅迫6 h后就達(dá)到最高，而CAT和SOD的基因表達(dá)量在脅迫12 h后都達(dá)到最高，然后三者的基因表達(dá)均下降，與相應(yīng)酶的活性變化基本一致，這與甘藍(lán)型油菜在鹽脅迫下基因表達(dá)與酶活性的變化情況[17]一致。表明這3個(gè)抗氧化酶基因都是誘導(dǎo)型表達(dá)的基因，在鹽等逆境脅迫下，它們均可以過量表達(dá)。endprint

非酶活性氧清除系統(tǒng)也會(huì)發(fā)生巨大的作用，脯氨酸與可溶性蛋白是植物體內(nèi)普遍存在的物質(zhì)，在逆境條件下，二者通過參與體內(nèi)的某種代謝活動(dòng)對(duì)植物進(jìn)行保護(hù)性的調(diào)節(jié)，以增強(qiáng)抗逆性[31]。在NaCl等鹽脅迫下，脯氨酸的積累是植物體抵御滲透脅迫的有效方式之一。脯氨酸含量的增加能夠降低葉片細(xì)胞的滲透勢，防止細(xì)胞脫水；而且脯氨酸具有很高的水溶性，可以保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)，維持細(xì)胞內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解。大量研究表明，許多植物在鹽脅迫下脯氨酸迅速積累，耐鹽植物中的脯氨酸含量高于不耐鹽植物[29，31]。MDA是膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量的高低是膜脂過氧化程度的重要標(biāo)志[31]。

本研究結(jié)果顯示，鹽脅迫可誘導(dǎo)豇豆葉片中抗氧化酶活性的增強(qiáng)，這些酶有可能協(xié)同作用共同抵抗鹽脅迫造成的氧化傷害，但這種誘導(dǎo)作用并非是無限的，重度脅迫可能對(duì)植物造成不可逆的傷害。由此推測，嚴(yán)重鹽脅迫對(duì)豇豆造成了一種不可逆的傷害，但相關(guān)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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