不同倍性西瓜原生質(zhì)體制備與低溫耐受性分析

王靜　喬飛　江雪飛　黨選民　詹園鳳

摘要：以同源二倍體、四倍體西瓜為試驗(yàn)材料，對(duì)其葉片及葉片制備的原生質(zhì)體進(jìn)行低溫處理，分別測(cè)定葉片電解質(zhì)外滲率、原生質(zhì)體細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)，分析不同倍性西瓜對(duì)亞低溫的耐受能力。結(jié)果表明：（1）將2.7%纖維素酶+0.78%離析酶R-10溶于0.4 mol/L甘露醇中，于80 r/min下酶解120 min，西瓜葉片原生質(zhì)體產(chǎn)率最高，制備效果最好；（2）四倍體西瓜原生質(zhì)體直徑為11.26 μm，比二倍體直徑為10.41 μm的高8.2%；（3）用電導(dǎo)法測(cè)西瓜葉片電解質(zhì)外滲率發(fā)現(xiàn)，-20、0 ℃處理時(shí)，二倍體西瓜的抗寒性略高于四倍體，但10～20 ℃的亞低溫范圍內(nèi)沒有檢出差異；（4）15～25 ℃的亞低溫處理原生質(zhì)體，測(cè)定細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)發(fā)現(xiàn)，二倍體導(dǎo)水系數(shù)的增幅極顯著小于四倍體，說明二倍體西瓜對(duì)亞低溫的耐受能力明顯高于四倍體。研究結(jié)果為植物種質(zhì)資源低溫抗性鑒定及多層次評(píng)價(jià)提供了新的研究思路和技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：西瓜；多倍體；低溫脅迫；原生質(zhì)體；導(dǎo)水系數(shù)

中圖分類號(hào)： S651.034 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0206-04

西瓜（Citrullus lanatus）起源于熱帶，為喜溫作物，極不耐寒，遇霜即死，屬于冷敏感植物，尤其在冬春反季節(jié)栽培的西瓜常會(huì)遇到低溫天氣導(dǎo)致其產(chǎn)量、品質(zhì)的下降[1]。近年來，隨著日光溫室、塑料大棚的大面積應(yīng)用，設(shè)施栽培西瓜幾乎很少出現(xiàn)0 ℃以下低溫凍害，偶爾會(huì)遭遇極端低溫冷害（0～8 ℃左右），但最常見的低溫逆境其實(shí)是亞低溫冷害。所謂亞低溫（也稱亞適溫或偏低溫）是指僅使作物生長緩慢但不使作物受到較大傷害而導(dǎo)致其生長停滯的溫度條件[2]。植物對(duì)亞低溫的耐受能力被稱為低溫耐受性，它與植物對(duì)冷害的抵抗能力即耐冷性之間既有聯(lián)系又相互區(qū)別[3-4]。大多起源于熱帶、亞熱帶的喜溫耐熱植物的亞低溫范圍在10～23 ℃[5-7]。

目前關(guān)于亞低溫對(duì)蔬菜的影響研究報(bào)道不多，袁偉、白潔發(fā)現(xiàn)，長時(shí)間亞低溫下，黃瓜表現(xiàn)出生長緩慢或停滯、花打頂、黃化、萎蔫、坐果率低、畸形瓜多、產(chǎn)量下降等[5，8]；王麗娟等研究得出，長期夜間亞低溫（15 ℃）改變了西紅柿光合產(chǎn)物分配方向[7]；Ventura等發(fā)現(xiàn)，只要設(shè)置適當(dāng)?shù)膩喌蜏?，果?shí)質(zhì)量不但不會(huì)下降，反而會(huì)得到改良[6]。

有關(guān)同源多倍體西瓜抗性也已有多方面的研究[9-12]。郭啟高等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，四倍體西瓜耐熱能力明顯高于同源二倍體[12]。但亞低溫能否對(duì)西瓜產(chǎn)生影響，如果產(chǎn)生影響，會(huì)是什么樣的影響；不同倍性西瓜經(jīng)短時(shí)間亞低溫處理后，其低溫耐受性有何區(qū)別，這些都尚未見報(bào)道。

Lyons早就提出細(xì)胞膜系是低溫冷害發(fā)生的首要部位[13]，本研究以不同倍性西瓜葉片制備原生質(zhì)體，對(duì)其進(jìn)行短時(shí)間的亞低溫處理，通過測(cè)定原生質(zhì)體的細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)、細(xì)胞電解質(zhì)外滲率分析不同倍性西瓜的低溫耐受能力，以期為西瓜多倍體抗性形成機(jī)制和抗性育種精確鑒定等方面提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以同源二倍體（FR-32-1B-2n）、四倍體（FR-32-1B-4n）西瓜為試驗(yàn)材料，其中四倍體由同源二倍體通過秋水仙素誘導(dǎo)獲得。試驗(yàn)材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 原生質(zhì)體制備方法的優(yōu)化：以二倍體和同源四倍體西瓜葉片為材料，設(shè)置2種酶液組合：酶1（2.7%纖維素酶+0.78% 離析酶R-10）、酶2（2.7%纖維素酶+0.78%離析酶R-10+0.155% 果膠酶），2種酶液組合均溶解在0.40 mol/L的甘露醇中；設(shè)置5個(gè)酶解時(shí)間：30、75、120、165、210 min；設(shè)置5個(gè)甘露醇濃度：0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mol/L，通過測(cè)定不同處理原生質(zhì)體產(chǎn)出率等綜合篩選最佳制備方法。

不同倍性西瓜葉片細(xì)胞大小的比較：以制備好的原生質(zhì)體為試驗(yàn)材料，采用顯微照相，AxioVision Re1.4.8軟件測(cè)量原生質(zhì)體直徑，比較不同倍性西瓜細(xì)胞直徑的差異。

不同倍性西瓜低溫耐受性比較：（1）以制備好的原生質(zhì)體為試驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行短時(shí)間的亞低溫處理，處理溫度分別設(shè)為15、20、25 ℃（25 ℃為對(duì)照，CK），處理時(shí)間為15 min，通過測(cè)定并計(jì)算細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)（Lp）評(píng)價(jià)不同倍性西瓜低溫耐受性。（2）以西瓜葉片為試驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行低溫處理，處理溫度設(shè)為-20、0、10、15、20、25 ℃（25 ℃為對(duì)照，CK），處理時(shí)間為30 min，通過電導(dǎo)法測(cè)定其相對(duì)電解質(zhì)外滲率，評(píng)價(jià)不同倍性西瓜低溫耐受性。試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2 試驗(yàn)方法 原生質(zhì)體的制備：取西瓜完全展開的葉片，切成5 mm2左右的塊狀，稱取1 g葉片，加入5 mL酶解液混勻，于25 ℃、80 r/min搖床上振蕩酶解。酶解后的溶液用160目的尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液。用0.4 mol/L甘露醇清洗，定容至6 mL，于400 r/min下離心5 min，棄上清，重復(fù)1次。為降低細(xì)胞壁的再生對(duì)測(cè)定細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)的影響，在已制備出的原生質(zhì)體懸浮溶液中加入酶液（1% 纖維素酶、0.3% 離析酶R-10，溶于0.4 mol/L甘露醇），加入量為懸浮液 ∶ 酶液=15 ∶ 1。

原生質(zhì)體產(chǎn)出率的測(cè)定：采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法測(cè)定，吸取20 μL稀釋后的原生質(zhì)體懸浮液滴在血球計(jì)數(shù)板上，然后置于10×物鏡顯微下觀察（Zeiss，M1）計(jì)數(shù)，n≥200，重復(fù)3次，取平均值。

原生質(zhì)體初始直徑測(cè)定：取制備好的原生質(zhì)體滴在血球計(jì)數(shù)板上顯微觀察照相，樣本數(shù)n≥30個(gè)/次，重復(fù)3次，然后用AxioVision Re1.4.8軟件對(duì)原生質(zhì)體直徑進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)重復(fù)測(cè)定30個(gè)原生質(zhì)體，取平均值。endprint

細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)測(cè)定：細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)的測(cè)定參考Liu等的方法[14]。具體如下：取制備好的原生質(zhì)體20 μL，加入等體積水混合，即開始計(jì)時(shí)（t=0）；迅速將混合液轉(zhuǎn)移至血球計(jì)數(shù)板上，再在40×物鏡下分別于90、150 s照相；通過測(cè)量原生質(zhì)體直徑的變化計(jì)算原生質(zhì)體體積的變化，再用以下公式計(jì)算細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)：

Lp=dV/dtSΔΨw≈（V150 s-V90 s）/60 sSΔosm

。

式中：ΔΨw為水勢(shì)的變化值；V90 s為90 s時(shí)原生質(zhì)體的體積，μm3；V150 s為150 s時(shí)原生質(zhì)體的體積，μm3；Δosm為加水混勻前后滲透勢(shì)的差值，mmol/kg，滲透勢(shì)由WESCOR 5600滲透勢(shì)儀測(cè)定；S為原生質(zhì)體的表面積，μm2。

西瓜葉片相對(duì)電解質(zhì)外滲率測(cè)定：參考史樹德等的測(cè)定方法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶組合在不同酶解時(shí)間下對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

由圖1可以看出，2種酶液組合均可制備獲得西瓜葉片原生質(zhì)體，原生質(zhì)體產(chǎn)率均隨著酶解時(shí)間的延長呈先升高后降低的趨勢(shì)。酶解時(shí)間不同，原生質(zhì)體產(chǎn)率差異很大，經(jīng)方差分析，2種酶液組合的最佳酶解時(shí)間都在120～165 min范圍內(nèi)，<120 min或>165 min原生質(zhì)體產(chǎn)率都極顯著降低。

2種酶液組合的變化一致，但變化幅度并不一樣，酶1的上升幅度和下降幅度均大于酶2，且酶1組合的原生質(zhì)體最高產(chǎn)率可達(dá)1.28×105個(gè)/mL，比酶2高15.4%。由此可知，選用酶1組合，在酶解120 min下制備西瓜葉片原生質(zhì)體既省時(shí)產(chǎn)出率又高。

2.2 不同甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

去除細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體需要一個(gè)合適的滲透環(huán)境才能維持正常形態(tài)。Cochrane等研究發(fā)現(xiàn)，甘露醇在水中的濃度和滲透勢(shì)有著較好的線性關(guān)系[16]，所以將甘露醇作為滲透調(diào)節(jié)劑在很多研究中都有應(yīng)用。由圖2可知，甘露醇濃度對(duì)西瓜葉片原生質(zhì)體產(chǎn)率有較大影響，濃度過低或過高都會(huì)降低原生質(zhì)體的產(chǎn)率。當(dāng)甘露醇濃度為0.40 mol/L時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)率最高，且經(jīng)方差分析，與0.30、0.50 mol/L處理的差異達(dá)到極顯著水平，說明0.40 mol/L甘露醇最有利于西瓜葉片原生質(zhì)體的形成。因此，本研究的西瓜原生質(zhì)體制備方法優(yōu)化為：酶1組合（2.7% 纖維素酶+0.78% 離析酶 R-10）溶于0.4 mol/L甘露醇中，于80 r/min下酶解120 min，西瓜葉片原生質(zhì)體的產(chǎn)出率最高，制備效果最好（圖3）。

2.3 不同倍性西瓜葉片細(xì)胞直徑的比較

多倍體與普通二倍體西瓜相比，不僅染色體數(shù)量增加，大多還表現(xiàn)出細(xì)胞體積增大或某些器官的巨型化，例如花瓣、果實(shí)或種子等器官的大型化。本試驗(yàn)選用的四倍體西瓜（FR-32-1B-4n）的葉片就比其同源二倍體（FR-32-1B-2n）的葉片大，但是其葉片大是由于葉片中細(xì)胞的體積較大還是細(xì)胞數(shù)量較多引起的并不清楚。本研究通過比較不同倍性西瓜葉片原生質(zhì)體的直徑分布（圖4）可知，二倍體西瓜葉片原生質(zhì)體的平均直徑為10.41 μm，分布在8.0～10.0 μm之間的原生質(zhì)體數(shù)約占總數(shù)的40%，分布在10.0～14.0 μm之間的原生質(zhì)體數(shù)約占總數(shù)的60%；四倍體的平均直徑為 11.26 μm，分布在8.0～10.0 μm之間的原生質(zhì)體數(shù)約占總數(shù)的22.9%，分布在10.0～14.0 μm之間的原生質(zhì)體數(shù)占總數(shù)的71.4%，另外還有5.7%的分布在14.0～16.0 μm范圍內(nèi)。由此可知，細(xì)胞個(gè)體增大是四倍體西瓜葉片巨型化的重要原因之一。

2.4 低溫處理對(duì)不同倍性西瓜葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

從Dexter將電導(dǎo)法應(yīng)用于生物抗寒性鑒定[17]以來，人們已公認(rèn)此方法較可靠。由圖5可以看出：（1）處理溫度與西瓜葉片相對(duì)電導(dǎo)率間有較好的相關(guān)關(guān)系，即在-20～25 ℃范

圍內(nèi)，溫度越低，其西瓜葉片的相對(duì)電導(dǎo)率越大，表明西瓜葉片細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲的越多，細(xì)胞膜受傷害程度越大；（2）不同倍性西瓜在同一溫度處理下的相對(duì)電導(dǎo)率差異不大，只有-20、0 ℃處理能看出四倍體西瓜葉片的相對(duì)電導(dǎo)率稍高于二倍體，而10～20 ℃的亞低溫范圍內(nèi)，兩者的相對(duì)電導(dǎo)率幾乎重疊在一起，沒有顯著差異。二倍體和四倍體西瓜對(duì)亞低溫的耐受性是否真的沒有差異，對(duì)此我們進(jìn)一步用細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)法進(jìn)行分析。

2.5 亞低溫處理對(duì)不同倍性西瓜細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)的影響

低溫逆境下，植物對(duì)水分的吸收、運(yùn)輸受限[18]，而細(xì)胞體積的迅速變化可以通過原生質(zhì)體來觀察[14]。如圖6所示，將原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移到低滲透勢(shì)的溶液中，原生質(zhì)體體積會(huì)逐漸變大，而其增大的速度可以通過細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)（Lp）來表示。本研究表明，15、20 ℃亞低溫處理后，同源二倍體和四倍體西瓜原生質(zhì)體的Lp明顯比對(duì)照（25 ℃）的Lp有大幅提高，但二者的增幅不同，經(jīng)方差分析，四倍體的原生質(zhì)體細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)的增幅（ΔLp）極顯著高于同源二倍體的（圖7）。由此也可看出，亞低溫處理下，二倍體西瓜原生質(zhì)體的Lp表現(xiàn)出比四倍體更好的穩(wěn)定性，即二倍體西瓜對(duì)亞低溫逆境有更好的耐受能力。

3 結(jié)論與討論

多倍體育種在西瓜中極其普遍，生產(chǎn)上常見的有二倍體、三倍體和四倍體。劉文革等研究發(fā)現(xiàn)，西瓜染色體經(jīng)加倍后，其抗逆性也會(huì)發(fā)生改變[19]。這在其他多倍體物種中也普遍存在，如杜鵑和黑麥草的同源四倍體就比二倍體適應(yīng)性更強(qiáng)，

但其耐冷性卻較差[20-21]?？墒墙?jīng)過抗逆鍛煉后，不同倍性材料的抗性提高程度表現(xiàn)不同。如經(jīng)低溫鍛煉后，四倍體西瓜幼苗細(xì)胞膜保護(hù)酶SOD、POD活性較高，比二倍體表現(xiàn)出更加耐冷[22]。以上研究表明，同源多倍體抗性形成可能存在多種機(jī)制。

細(xì)胞膜作為植物內(nèi)部與外界環(huán)境交流的界面，對(duì)逆境最為敏感[18]。低溫可對(duì)細(xì)胞膜造成直接物理損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，滲漏的多少可以體現(xiàn)損傷程度，滲漏的多少可以用Dexter等提出的電導(dǎo)率儀法[17]測(cè)定。目前，該方法結(jié)合Logistic方程還可以進(jìn)一步定量確定植物組織的半致死溫度（LT50），抗熱性[23]和抗寒性[24]。本研究應(yīng)用該方法測(cè)定不同低溫條件下，同源二倍體和四倍體西瓜葉片電解質(zhì)滲漏的情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)該方法能較好地區(qū)分不同處理溫度時(shí)的樣品電解質(zhì)的滲漏情況，但是不能區(qū)分不同倍性西瓜的電解質(zhì)的滲漏差異，特別是在亞低溫（10～20 ℃）范圍內(nèi)。但通過測(cè)定原生質(zhì)體的細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)卻能明顯區(qū)分，且差異達(dá)到了極顯著水平（P<0.01）。由此表明，細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)或許可用于植物亞低溫下低溫耐受能力的分析。endprint

通過原生質(zhì)體體積變化測(cè)定細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)涉及各種生理過程。在原生質(zhì)體體積快速增大或縮小的情況下，細(xì)胞膜的表面積在幾秒鐘內(nèi)就表現(xiàn)出明顯變化，而細(xì)胞膜面積的迅速增大與囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞骨架等多種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)[14，25]，說明染色體加倍后細(xì)胞自身生理調(diào)節(jié)機(jī)制也發(fā)生了變化。

本研究?jī)?yōu)化了不同倍性西瓜葉片原生質(zhì)體的制備方法，同時(shí)從細(xì)胞膜導(dǎo)水系數(shù)和細(xì)胞膜傷害率2個(gè)方面對(duì)不同倍性西瓜的低溫耐受能力進(jìn)行了分析。這些結(jié)果為研究多倍體西瓜抗性提供了新的思路，為西瓜抗性的多層次評(píng)價(jià)提供了技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]Korkmaz A，Dufault R J. Developmental consequences of cold temperature stress at transplanting on seedling and field growth and yield.Ⅰ. Watermelon[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，2001，126（4）：404-409.

[2]劉景安. 夜間亞低溫對(duì)甜瓜幼苗生長和生理生化特性的影響[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[3]陳青君，張福墁，王永健，等. 黃瓜對(duì)低溫弱光反應(yīng)的生理特征研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（1）：77-81.

[4]馬國成，張福墁. 日光溫室不同光溫環(huán)境對(duì)黃瓜光合產(chǎn)物運(yùn)輸及分配的影響[J]. 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，21（1）：34-38.

[5]袁 偉. 亞低溫對(duì)溫室黃瓜生長發(fā)育及產(chǎn)量的影響[D]. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2006.

[6]Ventura Y，Mendlinger S. Effects of suboptimal low temperature on yield，fruit appearance and quality in muskmelon （Cucumis melo L.） cultivars[J]. Journal of Horticultural Science & Biotechnology，1999，74（5）：602-607.

[7]王麗娟，李天來，齊紅巖，等. 長期夜間亞低溫對(duì)番茄生長發(fā)育及光合產(chǎn)物分配的影響[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（3）：300-303.

[8]白 潔. 外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)亞低溫下番茄幼苗生理特性的影響[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

[9]王 鎮(zhèn)，黨選民，詹園鳳，等.不同倍性小型西瓜主要農(nóng)藝性狀的比較分析[J]. 中國蔬菜，2010（2）：51-55.

[10]鄭 鋒. 小型西瓜四倍體誘變及不同倍性果實(shí)性狀與胚胎發(fā)育研究[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2012.

[11]閻志紅，劉文革，石玉寶，等. NaCl脅迫對(duì)不同染色體倍性西瓜種子發(fā)芽特性的影響[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（1）：204-207.

[12]郭啟高，宋 明，楊天秀，等. 西瓜子葉組織培養(yǎng)中四倍體的產(chǎn)生及鑒定[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，22（4）：298-300.

[13]Lyons J M. Chilling injury in plants[J]. Annual Review of Plant Physiology，1973，24：445-466.

[14]Liu Q，Qiao F，Ismail A，et al. The plant cytoskeleton controls regulatory volume increase[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2013，1828（9）：2111-2120.

[15]史樹德，孫亞卿，魏 磊，等. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2011.

[16]Cochrane T T，Cochrane T A. Osmotic potential properties of solutes common in the soil plant solution continuum[J]. Soil Sci，2005，170（6）：433-444.

[17]Dexter S T，Tottingham W E，Graber L F. Preliminary results in measuring the hardiness of plants[J]. Plant Physiology，1930，5（2）：215-223.

[18]胡 博，呂 滟，肖素妮，等. 水分脅迫下花生葉片AhNCED1蛋白表達(dá)與氣孔開度的變化[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2012，48（8）：815-820.

[19]劉文革，王 鳴，閻志紅，等.不同倍性蜜枚西瓜幼苗在低溫脅迫下的生理生化特性[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2003，20（1）：44-48.

[20]Vainola A，Repo T. Cold hardiness of diploid and corresponding autotetraploid rhododendrons[J]. Journal of Horticultural Science & Biotechnology，1999，74（5）：541-546.

[21]Sugiyama S. Differentiation in competitive ability and cold tolerance between diploid and tetraploid cultivars in Lolium perenne[J]. Euphytica，1998，103（1）：55-59.

[22]劉文革，王 鳴，閻志紅，等. 冷鍛煉對(duì)不同倍性西瓜幼苗SOD、POD活性及MDA含量的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（4）：578-582.

[23]徐 康，夏宜平，徐碧玉，等. 以電導(dǎo)法配合Logistic方程確定茶梅‘小玫瑰的抗寒性[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2005，32（1）：148-150.

[24]李秀玲，劉 君，宋海鵬，等. 應(yīng)用Logistic方程測(cè)定13種觀賞草的耐熱性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（3）：184-186.

[25]Wolfe J，Dowgert M F，Steponkus P L. Mechanical study of the deformation and rupture of the plasma membranes of protoplasts during osmotic expansions[J]. The Journal of Membrane Biology，1986，93（1）：63-74.孔小平，魏廷珍. 高原設(shè)施葡萄促早、延后栽培技術(shù)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：210-213.endprint