不同南豐蜜橘園掛果期土壤微生物的多樣性

任強(qiáng)　陳連水　鄒義冬　吳心怡

摘要：通過(guò)對(duì)江西省撫州市南豐縣市山鎮(zhèn)郊橘園土壤、萊溪水田邊橘園土壤、軍峰山石橋橘園下層土壤、旴江邊橘園上層土壤的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，再通過(guò)菌落觀察、測(cè)量、計(jì)數(shù)及細(xì)胞形態(tài)、大小的觀測(cè)，計(jì)算出各土壤培養(yǎng)組中固氮菌群落的Margalef豐富度指數(shù)（dma）、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）、Shannom-Winener多樣性指數(shù)（H′）、Pielou均勻度指數(shù)（Jsw）、每皿平均種類數(shù)和平均個(gè)體數(shù)，再進(jìn)行種群間的相似性分析，以期能體現(xiàn)南豐蜜橘的獨(dú)特性和南豐蜜橘橘園土壤微生物的多樣性狀況。試驗(yàn)結(jié)果表明，南豐蜜橘不同耕作方式對(duì)土壤有一定影響，合理的種植措施可以改善土壤微生物多樣性，從而使南豐蜜橘高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)。初步得出結(jié)論：除保證品系、苗木質(zhì)量、合理施肥外，保護(hù)產(chǎn)地的生態(tài)條件是目前情形下保護(hù)南豐蜜橘優(yōu)良品質(zhì)最有效的措施。

關(guān)鍵詞：南豐蜜橘；土壤微生物；多樣性；土壤固氮菌；豐富度指數(shù)

中圖分類號(hào)： S666.206 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0414-03

南豐蜜橘（Citrus reticulata）香甜可口，核小，果實(shí)色澤金黃，皮薄肉嫩，食不存渣，風(fēng)味濃郁，芳香撲鼻，以其滋味濃醇而著稱于世，是江西省甚至是全國(guó)的著名良種。南豐蜜橘的品質(zhì)是南豐蜜橘研究的核心問(wèn)題，但隨著種植面積大幅度增加以及產(chǎn)量的提高，人們普遍反映南豐蜜橘的質(zhì)量和風(fēng)味下降，值得研究者和種植者關(guān)注。品質(zhì)是蜜橘產(chǎn)業(yè)化的核心，南豐蜜橘發(fā)展的關(guān)鍵點(diǎn)應(yīng)當(dāng)放在提高品質(zhì)上，應(yīng)加大南豐蜜橘產(chǎn)業(yè)產(chǎn)前、產(chǎn)中、產(chǎn)后的投入力度。南豐蜜橘整體品質(zhì)自1991年大凍后有所下降，在不同程度上出現(xiàn)皮厚、不化渣、味不濃、籽多、偏酸等現(xiàn)象。據(jù)江西省南豐蜜橘普查工作小組1999年對(duì)南豐縣36個(gè)典型橘園36個(gè)果樣的調(diào)查分析，符合江西省標(biāo)準(zhǔn)DB36/T127—1993《南豐蜜橘》的僅有13個(gè)果樣，占總樣的36%，19%的果樣可溶性固形物含量低于標(biāo)準(zhǔn)，64%的果樣含酸量不符合標(biāo)準(zhǔn)[1-6]。方治軍等研究發(fā)現(xiàn)，南豐蜜橘在果實(shí)的色澤、肉質(zhì)、風(fēng)味、可溶性固形物含量、維生素C含量等方面存在較大的差異，并與產(chǎn)地氣候、土壤等主要生態(tài)因子有一定的相關(guān)性[7]，其中土壤養(yǎng)分是影響土壤性質(zhì)的重要因子，對(duì)南豐蜜橘產(chǎn)量和品質(zhì)有顯著的影響。土壤中的氮素?fù)p失一直是土壤微生物學(xué)家重視的問(wèn)題，目前正在研究以抑制硝化細(xì)菌活動(dòng)的方式減少土壤中的硝化、反硝化作用，從而防止氮肥的損失和避免因形成亞硝酸而污染水域。固氮菌除能固氮之外，還能形成維生素和異生長(zhǎng)素，不僅能刺激農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育、提高產(chǎn)量，也能加強(qiáng)其他根際微生物的生命活動(dòng)，促進(jìn)土壤有機(jī)物質(zhì)的礦化作用，從而改良土壤結(jié)構(gòu)、改善農(nóng)作物品質(zhì)[8-13]。許多對(duì)植物或動(dòng)物有害的物質(zhì)如農(nóng)藥、重金屬等超過(guò)一定限度同樣會(huì)影響或危及土壤微生物種類，而土壤具有分解有毒化合物的作用，這種作用是靠土壤中的微生物（主要是細(xì)菌）來(lái)完成的[14-16]，這也是橘園土壤固氮菌研究的重要性在另一個(gè)方面的體現(xiàn)。陳晶等研究表明，不同農(nóng)藥及其不同濃度對(duì)自生固氮菌生長(zhǎng)及固氮量的影響有所不同，從而為添加固氮菌以提高農(nóng)作物產(chǎn)量、監(jiān)測(cè)固氮菌含量來(lái)評(píng)估作物產(chǎn)量，以及田間正確使用農(nóng)藥提供了理論依據(jù)。另外，目前利用固氮菌開(kāi)發(fā)的生物型肥料也日益應(yīng)用在綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[15-17]。

本研究通過(guò)對(duì)江西省撫州市南豐縣市山鎮(zhèn)郊橘園土壤、萊溪水田邊橘園土壤、軍峰山石橋橘園下層土壤、旴江邊橘園上層土壤的微生物進(jìn)行培養(yǎng)、觀察、計(jì)算，分析土壤微生物的多樣性指標(biāo)，以期為保持南豐蜜橘生長(zhǎng)所需的土壤條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料來(lái)源 所用土樣分別采自江西省南豐縣萊溪田邊橘園土壤、市山鎮(zhèn)郊平地橘園土壤、旴江邊平地橘園土壤、軍峰山腳下橘園土壤。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 主要試劑有：50 mg/L重鉻酸鉀抑制劑溶液、1 mol/L NaOH溶液、復(fù)紅染劑、改良的Ashby培養(yǎng)基、革蘭氏染色劑、95%乙醇溶液、0.85%生理鹽水、番紅溶液、碘液、結(jié)晶紫染液、無(wú)菌水等。

1.1.3 儀器與耗材 主要儀器與耗材有：DHG-9003BS-Ⅲ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DNP-9002BC-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱、BD-156CT型超低溫冰柜、SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)、B-103 單目顯微鏡、BCD-193A 冰箱、BS223S 電子天平、CJ-2FD型超凈工作臺(tái)、B203LED生物顯微鏡、YX280A手提式不銹鋼蒸氣消毒器、錐形瓶、電爐、無(wú)菌試管、無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌燒杯、玻璃棒、接種環(huán)、無(wú)菌吸管、無(wú)菌棉、吸水紙、擦鏡紙、量筒、試管架、刷子、載玻片、顯微鏡、滴管、無(wú)菌錐形瓶、石棉網(wǎng)、手套、無(wú)菌袋、移液槍、涂棒、錫紙、蓋玻片、精確pH試紙等。

1.2 試驗(yàn)方法與步驟

1.2.1 配制改良后的Ashby培養(yǎng)基 分別在加有一定蒸餾水的燒杯中加入100 g甘露醇、5 g CaCO3、0.2 g MgSO4·7H2O、0.1 g CaSO4·2H2O、0.2 g KH2PO4、0.1 g CaSO4·2H2O、0.2 g NaCl、20 g瓊脂，加熱使瓊脂融化后加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2.2 南豐蜜橘土壤中固氮菌的分離培養(yǎng) 制備土壤稀釋液，用移液槍吸取0.1 mL土壤稀釋液涂布在改良的Ashby培養(yǎng)基中，將平板倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d[18]。之后每過(guò)1 d對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿中產(chǎn)生的固氮菌分別進(jìn)行計(jì)數(shù)并描述各種固氮菌的形態(tài)、生化生理特征[19-21]。

1.2.3 革蘭氏染色及個(gè)體形態(tài)觀察與計(jì)數(shù) 取固氮菌常規(guī)涂片、干燥、固定。滴加結(jié)晶紫（剛好將菌膜覆蓋即可）染色1～2 min，之后水洗。殘水用碘液沖去，并用碘液覆蓋約1 min，再水洗。用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，置于白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇不出現(xiàn)紫色時(shí)，立即水洗。用番紅液復(fù)染約2 min，水洗。干燥后，用油鏡觀察菌種的形態(tài)，結(jié)合細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。endprint

1.3 計(jì)算公式：

總個(gè)體數(shù)：N=∑NiSi；

總種數(shù)：S=∑Si；

Margalef豐富度指數(shù)：dma=（S-1）/lnN；

Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)：D=1-∑P2i；

Shannom-Winener多樣性指數(shù)：H′=-∑PilnPi；

Pielou均勻度指數(shù)：Jsw=H′/H′max。

2 結(jié)果與分析

2.1 南豐蜜橘土壤固氮菌多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)市山鎮(zhèn)郊橘園土壤（1號(hào)土樣）、萊溪水田邊橘園上層土壤（2號(hào)土樣）、萊溪水田邊橘園中層土壤（3號(hào)土樣）、軍峰山石橋橘園下層土壤（4號(hào)土樣）、旴江邊橘園上層土壤（5號(hào)土樣）、萊溪水田邊橘土下層土壤（6號(hào)土樣）的土壤固氮菌種數(shù)和個(gè)體數(shù)對(duì)應(yīng)關(guān)系計(jì)算出Ni、Si，再運(yùn)用“1.3”節(jié)各公式計(jì)算出各土壤培養(yǎng)組固氮菌群落的Margalef豐富度指數(shù)（dma）、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）、Shannom-winener多樣性指數(shù)（H′）、Pielou均勻度指數(shù)（Jsw）、每皿平均種數(shù)和平均個(gè)體數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1、圖1、圖2。

2.2 根據(jù)固氮菌進(jìn)行樣點(diǎn)間聚類分析

本試驗(yàn)中，采用最短距離法進(jìn)行聚類分析，以2個(gè)樣方間距離系數(shù)BC為指標(biāo)， 各樣方用Sample i表示（Sample 1代表市山鎮(zhèn)郊橘園土壤、Sample 2代表萊溪水田邊橘園上層土壤、Sample 3代表萊溪水田邊橘園中層土壤、 Sample 4代表軍峰山石橋橘園下層土壤、Sample 5代表旴江邊橘園上層土壤、Sample 6代表萊溪水田邊橘園下層土壤），dij表示xi與xj之間的距離，Dpq表示樣方Sample p與樣方Sample q之間的距離。則2個(gè)樣方間的最短距離表示為：Ds（p，q）=min{djk︱j∈Gp，k∈Gq}。采用最短距離法對(duì)本試驗(yàn)中的6個(gè)樣方進(jìn)行分類，得各樣方間距離，D（0）矩陣見(jiàn)表2。

從圖3可以通過(guò)距離的大小看出聚類的密切程度，距離越大，樣本間的差異也越大；反之，樣本間的差異越小。Sample 1和Sample 2的距離最小，故二者間的相似度也就最高；其次是Sample 3與Sample 6之間的距離，也很近。將Sample 3與Sample 6的交點(diǎn)記為A，則A與Sample 4的距離最短，若將A與Sample 4的距離記為B，則B與Sample 5越近。相似度最遠(yuǎn)的是Sample 1與Sample 5。也就是說(shuō)，從固氮菌豐富性來(lái)講，市山鎮(zhèn)郊橘園土壤與萊溪水田邊橘園上層土壤間的相似度最高，萊溪水田邊橘園中層土壤與萊溪水田邊橘園下層土壤相似度次之，而市山鎮(zhèn)郊橘園土壤與萊溪水田邊橘園下層土壤間的相似度最低。

值得注意的是，利用最短距離法進(jìn)行聚類分析有很多優(yōu)點(diǎn)，其分類簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛，當(dāng)兩類合并后與其他類的距離是所有距離中最小者，從而縮小了新合并類與其他類的距離，產(chǎn)生空間收縮，因而其靈敏度相對(duì)較低。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

微生物參與土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，在土壤形成、肥力演變、植物養(yǎng)分有效化和土壤結(jié)構(gòu)的形成與改良、有毒物質(zhì)降解及凈化等方面起著重要作用，數(shù)量龐大、種類繁多的土壤微生物是豐富的生物資源庫(kù)。由于人類對(duì)自然環(huán)境、自然資源的過(guò)度開(kāi)發(fā)和干預(yù)，使得地球上數(shù)以萬(wàn)計(jì)的物種消失或?yàn)l臨滅絕，生境被嚴(yán)重破壞，生物多樣性喪失，生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性變?nèi)酰Y源日益枯竭。植物根際微生態(tài)環(huán)境中，土壤微生物數(shù)量多、密度大，能在植物根系周圍形成一個(gè)物理屏障，由于在根際周圍的分泌物很多，最后在根冠周圍形成黏質(zhì)層，進(jìn)而構(gòu)成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境，這對(duì)保護(hù)植物根系、提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、減少病原菌和害蟲(chóng)入侵具有相當(dāng)重要的作用。不同污染程度的土壤微生物群落序列在其均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)等方面均存在差異。通過(guò)對(duì)南豐蜜橘園土壤細(xì)菌Margalef豐富度指數(shù)、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、Shannom-Winener多樣性指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)、每皿平均固氮菌種數(shù)和平均固氮菌個(gè)體數(shù)的測(cè)算，側(cè)面反映了南豐蜜橘不同橘園土壤微生物種群在均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)等方面存在的差異。

3.2 結(jié)論

通過(guò)對(duì)6種橘園土樣掛果期土壤固氮菌的培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)計(jì)算，根據(jù)公式計(jì)算土樣中固氮菌群落的Margalef豐富度指數(shù)（dma）、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）、Shannom-Winener多樣性指數(shù)（H）、Pielou均勻度指數(shù)（Jsw）、每皿平均固氮菌種數(shù)、平均固氮菌個(gè)體數(shù)?？梢缘贸鲆韵陆Y(jié)論：（1）Margalef豐富度指數(shù)（dma）大小為：5號(hào)土樣>3號(hào)土樣>6號(hào)土樣>4號(hào)土樣>1號(hào)土樣>2號(hào)土樣；（2）Simpson優(yōu)勢(shì)度（D）大小為：5號(hào)土樣>4號(hào)土樣>2號(hào)土樣>6號(hào)土樣>3號(hào)土樣>1號(hào)土樣；（3）Shannom-Winener多樣性指數(shù)（H′）大小為：5號(hào)土樣>4號(hào)土樣>2號(hào)土樣>3號(hào)土樣>6號(hào)土樣>1號(hào)土樣；（4）Pielou均勻度指數(shù)（Jsw）大小為：5號(hào)土樣>4號(hào)土樣>2號(hào)土樣>3號(hào)土樣>6號(hào)土樣>1號(hào)土樣；（5）平均種類數(shù)大小為：5號(hào)土樣>1號(hào)土樣=6號(hào)土樣=4號(hào)土樣>2號(hào)土樣=3號(hào)土樣；（6）平均個(gè)體數(shù)大小為：2號(hào)土樣>1號(hào)土樣>4號(hào)土樣>6號(hào)土樣>3號(hào)土樣>5號(hào)土樣。

萊溪水田邊橘園上層土壤的平均固氮菌個(gè)體數(shù)最多，說(shuō)明其相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境比其他樣點(diǎn)的土壤更有利于固氮菌的生長(zhǎng)；旴江邊橘園上層土壤擁有的物種豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)要遠(yuǎn)高于其他土壤。說(shuō)明旴江邊橘園上層土壤更有利于固氮菌物種多樣性的發(fā)展。

不同樣地的南豐蜜橘掛果期土壤固氮菌的數(shù)量、種類以及多樣性差異的出現(xiàn)，是由于它們所處的地理位置不同，另外人為干擾也占絕大一部分因素。南豐蜜橘品質(zhì)的好壞原因中，其地理環(huán)境是最重要的，因?yàn)橐环矫嫠苯佑绊懙轿⑸锏纳L(zhǎng)情況，不同的地域可能由于氣候和土壤條件的不同會(huì)使微生物的種類、個(gè)體數(shù)、多樣性產(chǎn)生明顯的差異。而另一方面人為干擾也會(huì)造成蜜橘品質(zhì)不同，適當(dāng)?shù)氖┓屎苤匾?，但過(guò)度施肥有可能導(dǎo)致南豐蜜橘品質(zhì)下降，以致失去原味，變得更酸。同時(shí)，耕作方式和農(nóng)藥噴灑等因素都會(huì)造成生物群落的改變，從而對(duì)南豐蜜橘的品質(zhì)造成一定的影響。由于旴江邊橘園上層土壤微生物群落除受水質(zhì)以及外圍雜草侵入等少量因素影響外，基本保持原始狀態(tài)；而其他的樣地耕作方式、化肥和農(nóng)藥施用等人為環(huán)境的干擾較嚴(yán)重，土壤微生物群落變化較大?？梢赃m當(dāng)?shù)剡M(jìn)行人為的呵護(hù)，從而讓其保持原有生態(tài)布局。本研究表明，土壤微生物的多樣性反映出南豐蜜橘各個(gè)橘園的土質(zhì)情況，應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)貙?shí)際情況，通過(guò)各種途徑進(jìn)行土壤改良。所以為了保護(hù)好南豐蜜橘的優(yōu)良品質(zhì)，應(yīng)盡量讓其在原產(chǎn)地生長(zhǎng)。endprint

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