叢海濤，王惠琴，陳 斌，丁進峰，陳玲陽

七氟烷預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷近期和遠期的影響

叢海濤，王惠琴，陳 斌，丁進峰，陳玲陽

目的：觀察七氟烷預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷近期和遠期的影響。方法：健康成年雄性SD大鼠40只，隨機分為七氟烷預(yù)處理組（A組）和對照組（B組）各20只；七氟烷預(yù)處理組在缺血前吸入2%七氟烷30 min，利用大鼠大腦中動脈線栓阻閉法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，阻斷血流60 min后，去除線實現(xiàn)再灌注；1個月后進行動物恢復(fù)及神經(jīng)認知行為學(xué)評估，包括曠場實驗和水迷宮行為學(xué)檢測。結(jié)果：缺血再灌注后，神經(jīng)功能缺陷評分A組1分、2分、3分分別為4例、10例、6例，B組1分、2分、3分分別為0例，6例，14例，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A組缺血前血糖值為(5.84±0.35)mmol/L,缺血后上升為(8.94±0.46)mmol/L（P＜0.05）；B組缺血前血糖值為(5.76±0.42)mmol/L,缺血后上升為(12.9±0.69)mmol/L（P＜0.05）；兩組間缺血后血糖值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A組曠場實驗得分、中央格停留次數(shù)以及穿越平臺次數(shù)分別為(34.83±0.25)分、(2.27±0.19)次和(4.67±0.34)次。B組組曠場實驗得分、中央格停留次數(shù)以及穿越平臺次數(shù)分別為(18.83±0.14)分、(1.35±0.11)次和(1.3±0.11)次，兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：七氟烷預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷近期和遠期均衡有一定保護作用。

七氟烷；腦缺血再灌注損傷；大鼠；認知功能

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠40只，清潔級，體質(zhì)量(290±28)g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。以標準飼料喂養(yǎng)，為1級合格動物。隨機分為七氟烷預(yù)處理組（A組）和對照組（B組）各20只。七氟烷預(yù)處理組在缺血前吸入2%七氟烷。曠場實驗儀器和Morris水迷宮實驗器材由成都儀器廠提供。

1.2 實驗方法 利用大鼠大腦中動脈線栓阻閉法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型。10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔內(nèi)注射，取仰臥位固定。行股動脈穿刺置管持續(xù)監(jiān)測動脈血壓及行血液采樣。頸部正中切口，分離并暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈。結(jié)扎頸總動脈，在頸總動脈上段靠近頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處剪一切口。將備好的直徑為0.24 mm的栓線緩慢送入切口中，經(jīng)分叉處穿過頸內(nèi)動脈。當有輕微阻力時停止，插入深度從分叉處計算約為17～18 mm。固定好栓線，縫合切口。阻斷血流60 min，拔出栓線實現(xiàn)再灌注。手術(shù)過程中保持自主呼吸，白熾燈照射。體溫由肛溫探頭連接多功能監(jiān)測儀監(jiān)測，維持直腸溫度在36.5～37.5℃。麻醉蘇醒后，將動物放回鼠籠，自由飲食。

將七氟烷組動物放入處理箱內(nèi),經(jīng)輸入孔通以氧氣及七氟烷，另一監(jiān)測孔連接麻醉氣體分析儀，持續(xù)監(jiān)測箱內(nèi)氣體濃度。氧流量為4 L/min,調(diào)節(jié)七氟烷濃度以維持箱內(nèi)七氟烷吸入濃度為2%。箱內(nèi)設(shè)置有CO2吸收裝置。在局灶性腦缺血前持續(xù)吸入七氟烷30 min。1個月后進行動物恢復(fù)及神經(jīng)認知行為學(xué)評估。⑴曠場實驗：曠場實驗箱為80 cm× 80 cm×80 cm的正方體無蓋箱子，上方用日光燈照明。實驗前先在箱內(nèi)預(yù)適應(yīng)40 min，采用追蹤分析系統(tǒng)通過紅外裝置記錄并分析曠場實驗得分以及大鼠的水平穿格次數(shù)。⑵Morris水迷宮：將大鼠從4個入水點下水進行定位航行實驗，訓(xùn)練找到平臺，培訓(xùn)8次。定位航行實驗完成后撤去平臺，大鼠從任一入水點下水，記錄在1 min內(nèi)跨越原平臺的次數(shù)。

1.3 監(jiān)測指標 記錄缺血前和再灌注24 h后的大鼠體重，再灌注24 h時后神經(jīng)功能缺陷評分，吸入七氟烷前后的血氣分析值，缺血前及缺血后血糖值，進行認知行為學(xué)檢測，包括曠場實驗得分、穿格次數(shù)和水迷宮跨越原平臺的次數(shù)。

神經(jīng)功能缺陷評分：0分無神經(jīng)功能障礙；1分不能完全伸展左前肢；2分行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分行走時向左側(cè)跌倒；4分完全不能行走，意識喪失。累計1分以上即為建模成功。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血前和再灌注24 h后體質(zhì)量的變化 兩組缺血前和再灌注24 h后體質(zhì)量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 缺血再灌注24 h后神經(jīng)功能缺陷評分 缺血再灌注后，兩組神經(jīng)功能缺陷評分均大于1分。與B組比較，A組神經(jīng)功能缺陷評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組缺血前和再灌注24 h后體質(zhì)量的比較（g，±s）

表1 兩組缺血前和再灌注24 h后體質(zhì)量的比較（g，±s）

組別A組B組n 20 20缺血前279±16 283±17再灌注24 h 261±15 263±18

表2 兩組再灌注24 h后神經(jīng)功能缺陷評分的比較

2.3 缺血前后血氣變化 兩組間pH、PO2和PCO2比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 吸入七氟醚預(yù)處理缺血前后血氣變化情況（±s）

表3 吸入七氟醚預(yù)處理缺血前后血氣變化情況（±s）

組別A組B組n 20 20 pH前7.39±0.05 7.40±0.06 pH后7.40±0.06 7.41±0.05 PO2前90.35±7.81 89.32±6.49 PO2后89.86±6.54 88.75±7.12 PCO2前36.86±3.74 37.63±3.57 PCO2后37.89±4.23 36.84±3.97

2.4 缺血后的血糖值 兩組缺血后血糖均上升（P＜0.05）。與A組比較，B組缺血后血糖差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組缺血前后的血糖值（±s）

表4 兩組缺血前后的血糖值（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05

組別A組B組n 20 20缺血前5.84±0.35 5.76±0.42缺血后8.94±0.46 12.9±0.69a

2.5 曠場實驗 兩組間曠場實驗得分、中央格停留時間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 曠場實驗得分和中央格停留時間比較（±s）

表5 曠場實驗得分和中央格停留時間比較（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05

組別A組B組n 20 20曠場實驗得分（分）34.83±0.25 18.83±0.14a中央格停留時間(min) 2.27±0.19 1.35±0.11a

2.6 水迷宮結(jié)果 A組大鼠穿越平臺次數(shù)為（4.67± 0.34）次，B組（1.3±0.11）次（P＜0.05）。

3 討論

本研究采用目前常用的大鼠大腦中動脈線栓法制備腦缺血再灌注損傷模型，結(jié)果顯示，兩組大鼠缺血再灌注后體重均減輕，且兩組大鼠大腦中動脈線栓后神經(jīng)功能缺陷評分增加。說明大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型制備成功。A組神經(jīng)功能缺陷評分比B組低，提示七氟烷預(yù)處理可減輕大鼠局灶性腦腦缺血再灌注損傷。血氣結(jié)果表明，吸入七氟烷后并未導(dǎo)致動物明顯的缺氧和二氧化碳潴留以及酸中毒。由此可排除吸入七氟烷抑制呼吸引起的低氧誘導(dǎo)的腦保護作用。

血糖被認為是加重腦腦缺血再灌注損傷的因素之一，高血糖可加重腦組織缺血性損傷。關(guān)于其機制的闡述，Rizk等[2]認為，腦缺血缺氧時葡萄糖無氧酵解加重，其終產(chǎn)物乳酸鹽生成增多，而高血糖增加了底物供給，更使乳酸鹽大量堆積，致腦組織局部酸中毒，破壞血－腦屏障，加劇腦水腫及神經(jīng)細胞死亡，使梗死面積擴大。B組血糖明顯高于A組，表明七氟烷可減輕大鼠局灶性腦腦缺血再灌注損傷，對腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用。

本研究證實，在動物腦缺血損傷前給予七氟烷吸入，可以對缺血后腦有保護作用，減輕動物的腦缺血損傷。我們考慮2%七氟烷為臨床麻醉常用濃度，選擇七氟烷濃度為2%。更高濃度的吸入七氟烷雖有可能進一步增強其腦保護效果，但隨之帶來的呼吸抑制等不良反應(yīng)也可能相應(yīng)增加。

行為學(xué)檢測是極為重要的對大鼠遠期認知功能的影響觀察指標，曠場實驗是一種評價實驗動物在新異環(huán)境中自發(fā)行為、探索行為的方法。本研究結(jié)果顯示，七氟烷組和對照組間的曠場實驗得分、中央格停留時間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示與缺血對照組比較七氟烷預(yù)處理能提高大鼠的自主探索能力。Morris水迷宮所檢測的是大鼠空間辨別學(xué)習記憶的能力，與海馬結(jié)構(gòu)功能密切相關(guān)。穿越平臺次數(shù)是最為重要的指標之一，穿越平臺的次數(shù)越多，說明學(xué)習記憶能力越強[3]。本研究結(jié)果顯示，兩組大鼠穿平臺次數(shù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明與腦缺血再灌注組比較七氟烷預(yù)處理對腦缺血的大鼠遠期的空間和位置學(xué)習記憶有明顯提高。

有關(guān)吸入麻醉藥的腦保護作用機制,目前認為與吸入麻醉藥能激活神經(jīng)元突觸后GABAA受體,延長并增強GABAA受體對氯離子的傳導(dǎo),產(chǎn)生長時間通道開放狀態(tài),抑制突觸興奮性,減少鈣離子內(nèi)流,從而降低突觸后神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子濃度有關(guān)[4]。Toner等[5]通過皮層腦片缺氧缺糖模型研究發(fā)現(xiàn),七氟烷預(yù)處理可以降低腦片孵育上清液中谷氨酸的濃度。Kristin等[6]通過微透析方法研究也發(fā)現(xiàn),七氟烷預(yù)處理可以降低腦缺血大鼠腦內(nèi)谷氨酸濃度。2.5%和4%七氟烷能分別降低離體腦額葉皮層神經(jīng)元細胞突觸前膜去極化引起的谷氨酸釋放，其抑制程度分別達到45%和55%。Do等[7]研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷能通過直接作用于PKC激酶的催化區(qū)和調(diào)節(jié)區(qū)，激活PKC激酶，后者的激活能增強突觸前膜神經(jīng)元型谷氨酸轉(zhuǎn)運體的轉(zhuǎn)運功能，從而降低中樞興奮性遞質(zhì)的濃度。因此，降低腦內(nèi)興奮性遞質(zhì)谷氨酸濃度，減弱其引起的興奮性損傷，可能是七氟烷腦保護作用的關(guān)鍵。也有實驗表明七氟醚可能是通過Caspase激活[8-9]、氧化應(yīng)激反應(yīng)[10-11]、細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡[11-12]等途徑引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡，誘導(dǎo)BACE-1上調(diào)增加Aβ表達，從而影響老年大鼠的認知功能。本研究證實選用的腦缺血成年大鼠經(jīng)過七氟烷預(yù)處理，在一定程度上可以減輕認知功能損害。

七氟烷是一種既適合全麻誘導(dǎo)又適合全麻維持的吸入麻醉藥。動物實驗表明，七氟烷預(yù)處理在腦缺血-再灌注損傷中具有保護作用[13]。趙平等[14]認為，1.5%和2%異氟烷后處理能夠減輕新生大鼠缺血缺氧性腦損傷程度。臨床常用的異氟烷吸入濃度對新生大鼠具有腦保護作用，這為異氟烷后處理在生后窒息的新生兒的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。吳周全等[15]認為，七氟烷預(yù)處理在一定程度上減輕CPB后引起的腦損傷及潛在的認知功能損害，可能與其降低ET-1的含量、增加CPB腦血流灌注有關(guān)。

臨床上進行頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)和冠狀動脈旁路移植術(shù)等的病人都具有潛在腦缺血的可能，麻醉時選擇有腦保護作用的麻醉藥物具有重要意義。本研究為臨床麻醉醫(yī)師處理腦缺血或潛在腦缺血的病人時麻醉藥物的選擇，提供了一定的實驗依據(jù)。同時七氟烷預(yù)處理的腦保護作用預(yù)處理治療腦損傷臨床意義可能適用于難產(chǎn)引起的新生兒腦缺氧-缺血、新生兒心臟手術(shù)、腦室內(nèi)出血的新生兒等疾病的治療。

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（收稿：2014-09-20 修回：2015-01-26）

（責任編輯 李文碩）

Short-term and Long-term Effects of Selflurane Preconditioning on Cerebral Ischemia Reperfusion In?jury in Rats

CONG Hai-tao,WANG Hui-qin,CHEN Bin,et al.
Department of Anesthesiology,Taizhou Hos?pital of ZheJiang Province,Linhai(317000),China

ObjectiveTo observe the short-term and long-term effects of selflurane preconditioning on ce?rebral ischemia reperfusion injury in rats.MethodsForty healthy adult male SD rats were divided randomly into group A(sevoflurane preconditioning group)and group B(control group).There were 20 rats in eachgroup.2%sevoflurane was inhalated 30 min before ischemia in sevoflurane preconditioning group.The rat model of middle cerebral artery occlusion was established.The blood flow was blocked 60 min later,the line was pulled out and the brain reperfused.One month later the rats were given the assessment of neural cognitive be?havioral recovery,including empty field experiment and water maze behavioral testing.The body weights of rats were recorded before ischemia and after reperfusion 24 h later;The nerve function defect score was recorded af?ter reperfusion 24 h later;Blood gas analysis was recorded before and after inhalation sevoflurane.Blood sugar of both groups were recorded before and after ischemia;cognitive behavioral tests were done,including empty field experiment and water maze experiment.ResultsNerve function defect scores of 1,2 and 3 in group A after ischemia reperfusion were 4,10 and 6,while 0,6 and 14 in group B.The difference between group A and group B was statistically significant(P＜0.05).Blood sugar in group A before ischemia was(5.84±0.35)mmol/L, while(8.94±0.46)mmol/L after ischemia（P＜0.05）;Blood sugar in group B before ischemia was(5.76±0.42) mmol/L,while(12.9±0.69)mmol/L after ischemia（P＜0.05）.The difference of blood sugar after ischemia be?tween group A and group B was statistically significant(P＜0.05).Empty field experiment scores,the central grid stops and crossing platform numbers were 34.83±0.25,2.27±0.19 and 4.67±0.34 respectively in group A, empty field experiment scores,the central grid stops and crossing platform numbers were 18.83±0.14、1.35±0.11 and 1.3±0.11 respectively in group B.The difference between group A and group B was statistically significant (P＜0.05)； Conclusion Sevoflurane preconditioning on ischemia reperfusion injury in rats has certain protec?tive short-term and long-term effects.

Sevoflurane;cerebral ischemia reperfusion injury；rats;cognitive function腦缺血疾病是目前嚴重危害人類健康的主要疾病之一，具有發(fā)病率、致殘率、死亡率高的特點。腦缺血可以引起一系列病理生理和生化方面的改變,目前公認的腦缺血損傷機制包括興奮性損害、Ca2+超載、自由基及脂質(zhì)過氧化、線粒體功能障礙、NO、細胞因子、立早基因和熱休克蛋白表達紊亂、細胞凋亡等。七氟烷是新型鹵代烴基醚類揮發(fā)性吸入麻醉藥，臨床應(yīng)用具有蘇醒快、刺激小，既能增加腦血流量，又能保留中樞自主調(diào)節(jié)等特點。有研究表明[1]，七氟烷預(yù)處理可增加腦血流量、降低腦代謝率，從而對腦組織起到保護作用。本研究觀察了七氟烷預(yù)處理對大鼠缺血再灌注損傷的近期和遠期影響，并探討其可能的機制。

Q95-33;R651

A

1007-6948(2015)02-0156-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.02.015

浙江省溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院麻醉科（臨海 317000）

叢海濤，E-mail:33363534@qq.com